Name: Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 학습하세요 THP-1 세포 기반 리포터 시스템을 활용하여 Toll-like 수용체 신호 전달을 억제하는 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 방법을. 이 기술은 염증성 질환 치료를 위한 신속하고 강건한 고처리량 선별 도구를 제공합니다.

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저자들은 Shanghai First People &#39;s Hospital (HY)의 초기 기금 인 Shanghai Institute of Higher Learning (HY)의 특별 임용 (Eastern Scholar) 교수 프로그램, Shanghai Jiaotong의 Gaofeng Clinical Medicine Grant 지원에 대한 지원을 인정하고자합니다. (HY), 캐나다의 Crohn &#39;s and Colitis Foundation (CCFC) (SET 및 HY)의 기금으로 구성되어 있습니다.

1. 세포 배양 배지 및 시약의 준비 <ol><li> RPMI - 1640 매체에 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM L - 글루타민과 1 MM 나트륨 피루 베이트의 보충제를 추가하여 완벽한 세포 배양 매체 R10을 준비합니다. <ol><li> NF - κB / AP - 1 활성화 제어하에 SEAP의 표현을 유지하기 위해 R10에 항생제 Zeocin (200 μg / ML)을 추가하여 선택 배지 R10 - Z를 준비합니다. SEAP 및 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현하는 세포를 선택하기 위해서는 Zeocin (100 μg / mL)과 blasticidin (10 μg / mL)을 모두 R10에 첨가하십시오 (R10-ZB). </li></ol></li><li> 클린 125 mL의 유리제 플라스크에 100 ㎖의 초순수, 독소없는 물 (E · G., 정량화 - 청색) 기판 분말 한 파우치를 용해하여 SEAP 기질 용액을 준비한다. <ol><li> 용액을 부드럽게 소용돌이면 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하여 완충액이 완전히 용해되도록하십시오. </li> &lt;멸균을 보장하기 위해 0.2 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 (4) 사용 전 2 주에서 최대 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 멸균 50 ML 원심 분리기 튜브에 25 ML ultrapure, endotoxin 무료 물에 기판 파우더 ( 예 : QUANTI-Luc)의 한 주머니를 용해하여 루시 페라 제 기질 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 분말을 완전히 녹인 후 즉시 용액을 사용하십시오. 또는 사용하기 전에 4 ° C (최대 1 주일) 또는 -20 ° C (최대 1 개월)에 보관하십시오. 주의 : 두 가지 용액 모두가 빛에 민감하므로 가능한 경우 항상 빛에 노출시키지 마십시오. 솔루션의 여러 번의 동결 - 해동 사이클은 기판의 불안정을 초래하고 수명을 단축시킬 수 있습니다. </li></ol></li><li> 500㎍ / mL의 농도를 갖도록 분자량 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에있는 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)의 스톡 용액을 준비하십시오. 원액의 분액을 만듭니다 (500 μL 튜브에 10 μL)를 넣고 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 5 mg / mL의 농도로 멸균 된 내 독소가없는 물에 LPS (E-coli K12) 저장 용액을 준비하고 -20 ° C에서 장기 보관을위한 분량을 만드십시오. 사용하기 전에 -20 ℃에서 100 μg / mL 및 저장 농도의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 스톡 LPS를 희석하여 작동 LPS 솔루션을 준비합니다. 주의 : 배양 물의 시약 준비는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행해야하며 사용하기 전에 모든 용기를 멸균해야합니다. PMA와 LPS 용액의 반복 된 동결 - 해동주기는 피해야한다. </li></ol> 2. THP-1 리포터 세포 유래 대 식세포의 배양 <ol><li> 2 개의 THP-1 리포터 세포주를 사용하십시오 : THP-1-XBlue 및 THP-1- 이중 세포. 전자는 NF-κB / AP-1에 의해 제어되는 SEAP 리포터 유전자를 가지고 있으며, 후자는 이중 리포터 유전자 시스템, 동일한 SEAP 리포터 유전자 및 IRF 조절 루시퍼 라제 유전자를 갖는다. 그만큼ir 배양 절차는 선발 배양 배지를 제외하고 동일하다. <ol><li> R10 배지 10 ML에서 작업 세포 주식 (~ 5 X 10 6 셀)을 해동, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀. 10 ML의 R10 매체에 Resuspend 세포 및 T75 문화 플라스크로 전송. 세포가 1 x 106 세포 / mL의 밀도에 도달 할 때까지 2-3 일마다 배지를 교환하십시오. </li><li> 세포 성장이 용량에 도달하면, 통로 세포는 2-5 × 105 세포 / ㎖의 범위에 세포 밀도를 감소시키기 때문에, 세포 성장을 계속할 수있다. </li><li> 적어도 1 회 통과 한 후, 선택 배지에서 세포를 배양하기 시작하십시오 : THP-1-XBlue의 경우 R10-Z, THP-1- 이중의 경우 R10-ZB. 선택 배양 배지로 적어도 1 회 통과시켜 세포를 배양 한 후, 세포를 실험 할 준비가된다. 주의 : 세포의 과증식은 심각한 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 세포 생존율은&gt; 98 %를 유지해야합니다. 통과 번호를 셀로 기록하십시오.ls는 많은 구절 (&gt; 20 구절) 후에 다르게 행동 할 수 있습니다. 참고 : 세포 배양 플라스크는 비용을 절감하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나,이 연습은 다른 플라스크 사이의 일반적인 오염과 교차 오염의 위험을 증가시킬 수 있습니다 (동시에 다른 세포주를 취급 할 경우). 배지 교환 및 세포 통과 동안 원심 분리는 300 xg에서 5 분으로 설정됩니다. </li></ol></li><li> 리포터 세포 분석을 수행하려면 세포를 96 웰 평면 세포 배양 플레이트에 넣고 대 식세포로 분화하십시오. 절차는 다음에서 설명합니다. <ol><li> 플라스크에서 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운하고 1 X 10 6 세포 / ML의 농도로 R10 매체에 resuspend. 50 ng / ML의 최종 농도와 세포 현탁액에 PMA 솔루션의 aliquots을 추가합니다. </li><li> 96 - 우리의 각 우물에 세포 현탁액의 100 μL를 전송멀티 채널 피펫을 사용하여 2 개의 플레이트로 분리 하였다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어. </li><li> 부화 후, 신중하게 진공 흡입기 (또는 다중 채널 피펫과)를 사용하여 문화 매체를 제거하고 부드럽게 PBS (100 μL / 잘) 두 번 세포를 씻어; 각 우물에 신선한 R10 매체 100 μL를 추가합니다. 기자 분석을 실시하기 전에 인큐베이터에서 2 일 동안 세포를 휴식. 주의 : 휴식 단계는 PMA 자극 후 세포가 평상시의 조용한 상태로 진정 될 수있게하는 데 매우 중요합니다. 이것은 비 자극 조건 하에서 리포터 유전자의 백그라운드 신호를 현저하게 감소시킬 수있다. 참고 : PMA로 24 자극 후, 세포는 우물 바닥에 세포 접착의 특징과 pseudopodia의 형태 학적 특징과 함께 macrophage 같은 표현형으로 차별화됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 리포터 세포를 이용한 잠재적 인 TLR4 나노 억제제의 스크리닝 </p&gt; 참고 : TLR4 신호 전달은 MyD88 의존 경로와 TRIF 의존 경로를 모두 사용하기 때문에 광범위한 TLR 신호 전달 경로를 포괄하는 주요 대상으로 선택됩니다. THP-1-XBlue 리포터 세포는 주로 NF-κB / AP-1 활성화를 검사하는 데 사용되는 반면 THP-1-Dual 세포는 TRIF 의존적 신호 전달에서 IRF 활성화를 위해 사용됩니다. <ol><li> 선별 검사 전에 용량 - 반응 곡선을 생성하여 최적의 피폭 선량을 확인하십시오. <ol><li> 작동 LPS 솔루션을 R10 배지 (log10 규모로 희석)에서 최종 농도 0.01 - 100 ng / ML로 희석합니다. 플레이트 디자인을 레이아웃하고 96 - 웰 둥근 바닥 문화 접시에 희석하십시오. 희석 후 각 웰에 최소 110 μL의 용액이 있는지 확인하십시오. </li><li> 진공 흡입기를 사용하여 세포 배양 플레이트 (2.2.3 항)에서 배양 배지를 부드럽게 제거합니다. </li><li> 희석 플레이트 (3.1.1)에서 준비된 R10 배지를 함유 한 LPS를 옮긴다.표본의 배치에 따라 배양 판에 묻는다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어. </li><li> 24 시간 후 조심스럽게 상등액 (80 μL / well)을 새로운 96-well 둥근 바닥 판에 옮긴다. 이 용액에 대해 비색 및 / 또는 루시퍼 레이션 루미 네 센스 분석을 즉시 수행하거나 분석 개발 전에 4 ° C (수 시간) 또는 -20 ° C (일)에 보관하십시오. 참고 : 실험 및 데이터 분석을 위해 판 레이아웃의 디자인이 간단하고 명확해야합니다. 각 조건에 대해 2-4 복제본을 고려해야합니다. 항상 음성 대조군 (LPS null)을 포함하십시오. 이중 세포는 대 식세포로 분화 된 후 NF-κB / AP-1 활성화의 상대적으로 높은 배경을 가지고 있으므로 NF-κB / AP-1 활성화에 THP-1-XBlue 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 NF-κB / AP-1 및 IRF 활성화를보고하는 데 이중 세포를 사용하는 것이 가능합니다. </li></ol></li><li> 색상 개발IRF 활성화에 대한 NF-κB / AP-1 활성화 및 루시퍼 라 아제 발광 분석을위한 이미 트 (imetric) 분석. <ol><li> NF - κB / AP - 1 활성화를 평가하기 위해 각 샘플의 상등액 20 μL를 새로운 96- 웰 평평한 바닥 배양 플레이트에 옮기십시오. 예열 된 SEAP 기질 용액 180 μL를 각 웰에 첨가한다. 37에서 플레이트를 품어 1 - 2 H 색상 개발 (짙은 파란색으로 핑크색)을 허용합니다. 플레이트 판독기에서 655 nm에서 흡수를 수집합니다. 주의 : 배양 시간은 발색 (30 분에서 밤새 배양)에 따라 달라질 수 있습니다. 발색의 포화 (OD&gt; 3)를 피하면서 가장 어두운 색상의 광학 농도 (OD)가 1 이상이 될 때까지 기다리는 것이 좋습니다. </li><li> IRF 활성화 분석을 위해 각 샘플의 상등액 10 μL를 96- 웰 투명 평면 바닥 판에 옮긴다. 루시퍼 레이즈 용액 (50 μL)을 넣고 즉시 발광 w잘 ~. 참고 : 자동 주입 기능이있는 발광 판 판독기를 사용하여 우물에서 우물로, 그리고 판에서 판으로의 판독시 일관성을 보장 할 것을 적극 권장합니다. 기질 용액을 수동으로 주사하는 경우 각 웰에 대해 일관된 배양 시간 및 판독 설정을 보장하십시오. </li></ol></li><li> 10 ng / mL LPS 자극 (3.1 기준)으로 다양한 peptide-GNP 잡종에 대한 screening assay를 수행하십시오. 리포터 분석 개발을 위해 3.2에서 동일한 절차를 따르십시오. <ol><li> 원심 분리 방법을 사용하여 펩타이드 - GNP 잡종을 R10 배지에서 200nM로 농축시킨다. 30 분 동안 18,000 xg에서 하이브리드 솔루션 (10 NM)의 20 볼륨을 원심 분리하고 신중하게 표면에 버려집니다. 튜브에 하이브리드 (튜브의 하단)를 수집하여 PBS로 두 번 씻어서 R10 배지의 한 부피에 하이브리드를 다시 부순다. </li><li> 같은 양의 농축 된 잡종과하이브리드 및 LPS의 최종 농도가 각각 100 nM 및 10 ng / mL가되도록 R10 배지를 함유하는 LPS (20 ng / mL). </li><li> 배양 플레이트 (2.2.3)에서 배양 배지를 제거하고 혼합 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하십시오 (각 조건별로 3 복제). 음성 대조군 (중간 정도)과 LPS 대조군 (잡종이없는 10 ng / mL LPS)을 포함한다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 부화 후, 튜브에 각 우물의 매체를 전송하고 30 분 18,000 XG, 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기. 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에 뜨는 (50-80 μL / 튜브)을 수집하고 3.2에서 설명한대로 리포터 분석을 수행합니다. 주의 : 원심 분리 후 상청액을 버릴 때는 튜브의 바닥에서 잡종을 동요시키지 마십시오. NOTE : 단계 3.3.4의 원심 분리는 비 - 내재화 된 나노 입자 잡종을 배양 배지에서 제거하는 데 매우 중요하며, 교배종과의 교잡을 피할 수있다로리 메트릭 / 루미넌스 독서. 이것은 금 나노 입자가 크기와 응집에 따라 넓은 파장의 빛을 흡수 할 수 있기 때문입니다. </li></ol></li></ol> 4. 잠재적 후보자의 억제 효과 검증 참고 : 선별 검사에서 잠재적 후보자의 억제 효과를 확인하기 위해 두 가지 방법이 사용됩니다. 하나는 고정 하이브리드 농도 (또는 그 반대 방향)에서 각성제 (LPS)의 용량 반응을 검사하는 것입니다. 다른 하나는 immunoblotting을 통해 NF-κB / AP-1 및 IRF3 신호의 저해를 직접 관찰하는 것입니다. <ol><li> 접근법 1에서, 3.3에 설명 된 것과 동일한 절차에 따라 1 ng / mL 및 10 ng / mL에서 리드 하이브리드 및 2 개의 LPS 농도 100 nM으로 리포터 분석을 수행합니다. 비교를위한 하이브리드 컨트롤로서 비활성 하이브리드 (스크리닝 결과에 근거)를 포함시킨다. </li><li> 면역 블로 팅 접근법에 대해서는 표준 experimental 절차. <ol><li> R10 배지에서 THP-1 세포를 배양하고 세포를 12- 웰 배양 플레이트 (2 × 106 세포 / 웰)에 접종하고 24 시간 동안 50 ng / mL PMA로 세포를 처리하여 대식 세포로 분화시킨다 2 일 동안. </li><li> 세포 분화 후 시간이 지남에 따라 (최대 4 시간) 잡종 (100nM)의 유무에 관계없이 10ng / mL LPS로 세포를 자극합니다. 다양한 시점 (0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240 분)에서 immunoblotting을 위해 세포 용 해물을 준비하십시오. 비활성 하이브리드를 컨트롤로 포함하십시오. </li><li> IκBα, 인산화 된 p65 및 인산화 된 IRF3의 신호를 조사하여 NF-κB 및 IRF3의 활성화에 대한지도 교배종의 억제 효과를 검사합니다. 내부 통제로 β-actin과 총 IRF3 신호를 조사하십시오. 참고 : 신호 변환은 종종 훨씬 빠르게 (몇 시간 내에) 발생하고 리포터 효소 SEAP 및 루시퍼 라제 (24 시간)의 발현이 발생합니다. 또한 perfor에 매우 좋습니다다른 검증 방법으로서 24 시간에서 테스트 된 잡종의 생존 능력 분석. </li></ol></li></ol> 5. TLR 특이성 평가 참고 : 리드 펩타이드 - GNP 하이브리드의 TLR 특이성을 조사하기 위해 TLR2, TLR3 및 TLR5를 비롯한 다른 TLR 신호 전달 경로가 테스트됩니다. THP-1 유래 대 식세포 인해 TLR7, 팔의 부족과 대 식세포 (34) 9 표현이 TLR에의 자극에 잘 반응하지 않기 때문에 TLR7, 8, 9는 제외됩니다. <ol><li> TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (폴리 I : C) 및 TLR5 (플라 젤 린)에 특이적인 리간드를 다양한 농도로 (1 ng / mL ~ 25 μg / mL) 절차 3.1 및 3.2. </li><li> 납 하이브리드 (100 nM)와 각 TLR 리간드의 혼합물을 5.1에서 얻은 농도로 처리하여 납 h의 억제 특이성을 평가합니다이브 리드는 3.3에 설명 된 실험 절차에 따라. 비활성 하이브리드를 비교 대조군으로 포함시킵니다. </li></ol>

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TLR은 많은 염증성 질환의 발병 기전에 관여하기 때문에 면역 반응 및 염증 상태의 조절을위한 치료 표적으로 부상하고있다. 그러나, TLR 신호 전달 경로를 억제하는 치료제의 임상 개발은 지금까지 제한된 성공을 거두었 다. TLR7과 TLR9를 억제하는 항 말라리아제 인 하이드 록시 클로로퀸 (hydroxychloroquine)은 임상 적으로 사용됩니다 35 , 36 . 마찬가지로, 화합물의 제한된 수가 eritoran 포함한 임상 시험을 진행 한에 강력한 억제 효과 전시 TLR4 길항제, 전임상 연구 37, 38에서 염증 반응을 LPS가 매개 위상에서 긍정적 인 결과를 보였다 I / II 임상 임상 시험 39 , 40</su...

Toll-like receptors (TLRs)는 감염에 대한 첫 번째 방어선에 기여하는 타고난 면역 체계의 핵심 요소 중 하나입니다. TLRs는 병원체 관련 분자 패턴 (또는 PAMPs)의 레퍼토리를 인식하고 신호 전달의 계단식을 통해 방위 반응을 탑재하여 침입 병원체를 감지하는 책임이 있습니다 1 , 2 . 확인 된 10 개의 인간 TLR이 있습니다. 리간드가 불분명 한 TLR10을 제외하고, 각각의 TLR은 구별되고 보존 된 PAMP 군을 인식 할 수있다. 예를 들어, 주로 세포 표면에 위치한 TLR2와 TLR4는 그람 양성균과 그람 음성균의 지단백질과 당지질을 각각 검출 할 수 있습니다. 주로 엔도 솜 구획에 존재하는 TLR3, TLR7 / 8 및 TLR9는 바이러스 및 세균으로부터 RNA 및 DNA 생성물을 감지 할 수 있습니다 3 . PAMPs에 의해 자극되면 TLR은 pro-inf를 방출하여 필수 면역 반응을 유발합니다염증 매개체, 효과기 면역 세포의 모집 및 활성화, 후속 적응 면역 현상 조정 4 . TLR 신호 전달은 두 가지 주요 경로 5 , 6 으로 간단히 분류 할 수 있습니다. 하나는 어댑터 단백질 골수 분화 인자 88 (MyD88) - MyD88- 의존 경로에 의존한다. TLR3을 제외한 모든 TLR은 활성화 된 B 세포 (NF-κB)와 mitogen-associated protein kinases (MAPKs)의 핵 인자 κ-light-chain-enhancer를 활성화시키기 위해이 경로를 이용하여 TNF-α와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 유도한다. α, IL-6, IL-8 등이있다. 두 번째 경로는 인터페론 (IFN) 조절 인자 (IRFs)와 NF-κB를 활성화시키기 위해 TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론 -β (TRIF), 즉 TRIF 의존적 경로 또는 MyD88 독립적 경로를 사용하여 I 형 IFN. 손상되지 않은 TLR 신호미생물 및 바이러스 감염으로부터 우리의 일상적인 보호에 중요합니다. TLR 신호 전달 경로의 결함은 면역 결핍을 초래할 수 있으며 종종 인간의 건강에 해로울 수 있습니다. 7 그러나 TLR 신호는 &#39;양날의 검&#39;이며 과도한 통제되지 않은 TLR 활성화는 해롭다. 과도한 TLR 반응은 많은 급성 및 만성 인간 염증성 질환에서 병인 발생에 기여합니다 8 , 9 . 예를 들어, 전신성 염증 및 다기관 손상으로 특징 지어지는 패혈증은 주로 패혈증 병태 생리학 10 , 11 , 12 에서 중요한 역할을하는 TLR2 및 TLR4와 함께 감염에 대한 급성, 압도적 인 면역 반응 때문입니다. 또한, TLR5는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 염증에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다 13, 14 . 또한, 조절 이상 엔도 좀 TLR 신호 전달 (예를 들어, TLR7 및 TLR9)을 강하게 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) 및 류마티스 관절염 (RA) (15, 16)를 포함한 여러자가 면역 질환의 발생 및 진행과 연관된다. 이러한 수렴되는 증거는 TLR 신호가 많은 염증성 질환 17에 대한 잠재적 인 치료 표적임을 확인합니다. TLR 응답의 약리학 규제 많은 염증성 질환에 유용 할 것으로 예상되지만, 불행히도, 현재 TLR 9, 17, 18 시그널링 억제 임상 가능한 매우 적은 화합물이있다. 이것은 부분적으로 면역 항상성과 병리에 관련된 TLR 경로의 복잡성과 중복으로 인한 것입니다. 따라서, 소설, poten 검색다중 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 치료제는 근본적인 차이를 메워 줄 수 있으며 TLR 억제제를 진료소로 진출시키는 문제를 극복 할 수 있습니다. 나노 과학과 나노 기술의 급속한 발전에 비추어 볼 때, 나노 디바이스는 고유 한 특성 19 , 20 , 23 으로 인해 차세대 TLR 변조기로 부상하고 있습니다. 나노 크기는 이러한 나노 치료제가보다 나은 생체 분포와 지속적인 순환을 가능하게합니다 24 , 25 , 26 . 이들은 원하는 약물 동태 학 및 약물 동태 프로파일 27 , 28 , 29 를 충족시키기 위해 더 기능화 될 수있다. 보다 흥미롭게도,이 새로운 나노 디바이스의 생체 활성은 그 고유 한 특성에 기인한다.단순히 치료제의 전달 수단으로서의 역할을하기보다는 특정 의료 응용 분야에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 고밀도 지단백질 (HDL) 유사 나노 입자는 TLR4 리간드 LPS 23 을 제거함으로써 TLR4 신호 전달을 억제하도록 설계되었습니다. 또한, 우리는 펩타이드 - 금 나노 입자 하이브리드 시스템을 개발했다.이 시스템은 장식 된 펩타이드가 금 나노 입자의 표면 특성을 변화시켜 다양한 생체 활성 30 , 31 , 32 , 33 을 가질 수있게한다. 이것은 차세대 나노 치료제로서 그들에게 특별한 종류의 약물 (또는 &quot;나노 약물&quot;)을 만듭니다. 이 프로토콜에서는 탐식 면역 세포에서 여러 TLR 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 새로운 종류의 펩타이드 - 금 나노 입자 (peptide-GNP) 하이브리드를 확인하는 접근법을 제시합니다 32 , </sup&gt; 33 . 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 THP-1 리포터 세포주를 기반으로합니다. 기자 세포는 2 개의 안정한 유도 성 기자 구조로 이루어져있다. 하나는 전사 인자 NF-κB 및 활성화 제 단백질 1 (AP-1)에 의해 유도되는 프로모터의 제어하에 분비 된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 유전자를 보유한다. 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에 분비 된 루시 페라 제 리포터 유전자를 함유한다. TLR 자극시, 신호 전달은 NF-κB / AP-1 및 / 또는 IRFs의 활성화를 유도하며, SEF 및 / 또는 루시퍼 라제를 비밀하기 위해 리포터 유전자를 활성화시킨다. 이러한 이벤트는 분광 광도계 또는 루미넌스로 대응하는 기질 시약을 사용하여 쉽게 검출 할 수 있습니다. 이전에 확립 된 peptide-GNP 잡종 라이브러리를 스크리닝하기 위해이 방법을 사용하여 우리는 TLR4 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 납 후보 물질을 동정했다. 리드 펩티드 -그런 다음 GNP 잡종을 면역 블로 팅의 또 다른 생화학 적 접근법을 사용하여 검증하고 다른 TLR 경로를 평가했다. 이러한 접근법은 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 신규 약제의 신속하고 효과적인 스크리닝을 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>THP-1-XBlue 리포터 세포</td><td>InvivoGen</td><td>thpx-sp</td><td>세포 배양 통로를 20 미만으로 유지</td></tr><tr><td>THP-1-Dual repoter 세포</td><td>InvivoGen</td><td>thpd-nfis</td><td>세포 배양 통로를 20</td></tr><tr><td>RPMi-1640 (L-글루타민 없음)</td><td>GE Health Care</td><td>SH30096.02</td><td>37°C까지 워밍; C는 사용하기 전에; 보충제를 추가하여 완전한 매체 R10</td></tr> 소 태아 <tr><td>혈청(적격)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td>열 비활성화; RPMI-1640</td></tr><tr><td>L-글루타민</td> 10% <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>2 mM 완전한 매체 R10</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>1 mM 완전한 매체 R10</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1X, 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>GE Health Care</td><td>SH30028.02</td><td>세포 세척 및 시약 준비에 사용</td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td>SEAP 기질</td></tr><tr><td>QUANTI-Luc</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qlc2</td><td>Luciferase 기질</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-zn-1</td><td>리포터 세포</td></tr><tr>용 항생제 선택<td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td> 리포터 세포용 <td>항-bl-1</td><td>선택 항생제</td></tr><tr><td>분자생물학용 디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigmal-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>시약 준비에 사용</td></tr><tr><td>분자생물학용 Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA) Sigmal-Aldrich</td><td></td><td>P1585-1MG</td><td>세포 분화에 사용</td></tr><tr><td>E. coli K12 InvivoGen의 세포 분화에 사용 지질다당류(LPS)</td><td></td><td>tlrl-eklps</td><td>TLR4 리간드</td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pms</td><td>TLR2/1 리간드</td></tr><tr><td>폴리(I:C) HMW</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-pic</td><td>TLR3 리간</td></tr><tr><td>드 S. Typhimurium(FLA-ST)의 편모, 초순수</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-epstfla</td><td>TLR5 리간드</td></tr><tr><td>SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>N/A</td><td>비색 분석 읽기</td></tr><tr><td>인피니트 M200 Pro 멀티모드 마이크로플레이트 리더(인젝터 포함</td>) <td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Read luminiscience</td></tr><tr><td>마이크로퓨지 22R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>온도 제어 마이크로 원심분리기(최대 18,000g)</td></tr><tr><td>Allegra X-15R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>온도 제어 범용 원심분리기(세포 배양용)</td></tr><tr><td>Costar 분석 플레이트, 투명한 평평한 바닥이 있는 96웰 화이트, 조직 배양 처리된</td><td>Corning Costar</td><td>3903</td><td>발광 분석에 사용</td></tr></tbody></table>

toll-like receptor signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll-like receptor (TLR) 반응의 약리학 적 조절은 많은 염증성 질환의 치료에 큰 도움이됩니다. 그러나, TLR 신호 전달을 약화시키기 위해 지금까지 이용 가능한 제한된 화합물이 있으며, 임상 적으로 임상 적으로 승인 된 TLR 억제제 (항 말라리아 약물 하이드 록시 클로로퀸)는 없다. 나노 기술의 급속한 발전에 비추어, 나노 장치를 이용한 면역 반응의 조작은 이러한 질병을 치료하기위한 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 발명자들은 식세포 면역 세포에서 TLR 신호 전달을 억제하는 신규 한 생체 활성 나노 입자를 신속하게 동정하기위한 고 처리량 스크리닝 방법을 제시한다. 이 스크리닝 플랫폼은 표색계 및 루시퍼 라제 분석법을 갖춘 THP-1 세포 기반 리포터 세포를 기반으로합니다. 리포터 세포는 두 개의 유도 성 리포터 구조물의 안정한 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 조작된다. 하나는 분비 된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 유전자를 발현한다(NF-κB 및 AP-1에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에), 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도 가능한 프로모터의 조절하에 분비 된 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현한다. TLR 자극에 따라, 이어서 상응하는 기질 시약을 사용하여 검출 할 수있는 SEAP 및 / 또는 루시퍼 라제를 생산할 수있다. 이전의 연구에서 확립 된 펩타이드 - 금 나노 입자 (GNP) 하이브리드 라이브러리를 예로 들면 본 발명자들은 프로토 타입 리간드 인 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 유발 된 TLR4 신호 전달 캐스케이드의 두 팔을 효과적으로 억제 할 수있는 펩티드 - GNP 하이브리드를 확인했다. 연구 결과는 면역 블로 팅을 포함한 표준 생화학 기술로 검증되었습니다. 추가 분석 결과,이 납 하이브리드는 TLR2, 3, 4 및 5를 비롯한 여러 TLR 경로에 작용하는 광범위한 저해 스펙트럼을 가지고 있음이 입증되었습니다.이 실험적 접근 방식은ra nanoparticle (또는 다른 치료 화합물)은 식균 성 면역 세포에서 특이 적 TLR 신호 전달을 조절할 수있다.

전체 실험 접근법은 그림 1에 나와 있습니다. 두 개의 THP-1 리포터 세포주 인 THP-1-XBlue와 THP-1-Dual은 각각 NF-κB / AP-1 및 IRF의 활성화를 조사하여 TLR 반응을 빠르게 스크리닝합니다. NF-κB / AP-1의 활성화는 SEAP 표색 분석에 의해 검출 될 수있는 반면, IRF 활성화는 루시퍼 라제 발광에 의해 모니터링된다. 단핵 세포 THP-1 세포는 선천성 식세포 면역 세포에 대한 면역 조절 활성을 위해 나노 장치를 스크리닝하기 위해 대 식세포로 쉽게 유도 될 수있다. 리포터 시스템을 사용하여 스크리닝을 높은 처리량으로 수행 할 수 있습니다. 그러한 접근법은 새로운 면역 요법의 발견, 특히 TLR 신호 전달과 같은 타고난 면역 신호 전달을 목표로하는 발견에 다양하다. ...

Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

본 스크리닝 절차의 전반적인 목표는 톨 유사 수용체(toll-like receptor) 신호 전달을 억제할 수 있는 새로운 생물학적 활성 나노입자를 식별하는 것입니다. 이 방법은 선천 면역 세포의 톨 유사 수용체 신호 전달을 표적으로 하는 새로운 나노억제제를 물리적으로 식별하는 데 도움을 줍니다. 이 기술의 주요 장점은 리포터 세포 시스템을 사용하여 빠르고 견고하며 수행하기 쉽다는 점입니다.Toll-like 수용체 신호 전달이 이러한 질병의 발병 기전에 관여하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이 기술의 응용 분야는 많은 염증성 질환의 치료로 확장됩니다. 이 방법은 금 나노입자에 대한 고효율 스크리닝을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 나노입자 시스템은 물론 치료용 저분자 화합물 및 생물학적 제제에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양 배지를 준비하십시오.다음으로, 깨끗한 125 milliliter 유리 플라스크에 초순수 endotoxin-free water 100 milliliters를 넣습니다. 분비형 배아 알칼리성 인산분해효소(secreted embryonic alkaline phosphatase) 기질 분말 한 포를 넣고, 완전히 용해될 때까지 용액을 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 기질이 완전히 용해되도록 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.0.2 µm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하십시오. 사용 전까지 4 °C에서 보관하십시오. 다음으로, 25 mL의 초순수 endotoxin-free water가 담긴 50 mL 원심분리 튜브에 루시페라아제 기질 분말 한 포를 첨가하십시오.분말이 완전히 용해된 후, 사용 전까지 최대 일주일 동안 4°C에서 보관하십시오. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다른 모든 시약의 스톡 용액을 준비합니다. 세포를 배양하고 준비한 후, 배양 플라스크에서 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다.세포를 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후, 1 X 10^6 cells/mL 농도의 R-10 배지에서 세포를 재부유시킵니다. 최종 농도가 50 ng/mL가 되도록 PMA 용액의 일정량을 세포 현탁액에 첨가합니다.세포 현탁액을 멸균된 시약 리저버에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 96-well flat bottom 배양 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 µL를 분주합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C로 24시간 동안 배양합니

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

sialidase 분석은 미생물의 감염 라이브 macrophages의 세포 표면에 수용체 수준에서 염증성 질환에 관여 TLR 센서 소설 분자 메커니즘 (들)을 명료하게하다하는 간단한 기술 접근​​이다.

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

인간 단핵구 유래 미세아교세포 유사 세포를 배양합니다.항염증제를 함유한 나노입자를 실험 배양액에 도입하고 유리 약물을 대조군에 도입합니다.나노입자는 친수성 껍질과 친유성 약물을 캡슐화하는 소수성 코어를 특징으로 합니다.세포는 나노입자를 엔도사이토시하여 약물을 세포 내에서 방출하여 전달을 향상시킵니다.유리 약물은 농도 구배에 의해 제한되는 과정인 수동 확산에 의해 들어가 세포 내 농도가 낮아집니다.톨 유사 수용체에 결합하여 전염증성 사이토카인 방출을 유발하는 박테리아 항원을 추가합니다.실험군의 나노입자와 대조군의 유리 약물을 포함하는 신선한 배지와 함께 배양물을 배양합니다.이 두 번째 노출은 나노입자 전달을 통해 일관된 치료 약물 수준을 보장하여 사이토카인 생성을 억제하는 다운스트림 신호 전달을 유도합니다.유리 약물의 제한된 흡수는 치료 이하의 세포내 농도를 초래합니다.상청액을 수집하여 사이토카인 수준을 평가하고 나노입자 매개 약물 전달의 향상된 치료 효과를 평가합니다.

미세아교세포 유사 세포에서 나노입자 매개 항염증제의 향상된 전달

이 비디오는 TLR(Toll-like receptor) 신호 전달을 억제하는 잠재적인 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하기 위한 리포터 세포 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드와 혼합된 지질다당류(LPS)를 리포터 단백질인 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 및 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 리포터 대식세포에 도입하는 것을 포함합니다. 하이브리드에 의해 매개되는 LPS 유도 TLR 신호의 감소는 리포터 신호를 측정하여 결정됩니다.

톨 유사 수용체 신호 억제를 위해 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 분석

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

본 프로토콜은 말초혈액단핵구 유래 대식세포와 자동 현미경을 사용하여, 녹색 형광 단백질로 라벨링된 삼중음성 유방암 세포의 항체 의존적 대식세포 포식 작용을 시각화하는 타임랩스 살아있는 세포 이미징 방법을 설명합니다.

녹색 형광 단백질로 표지된 삼중음성 유방암 세포의 항체 유도 대식세포 식작용에 대한 타임랩스 이미징

학습하세요 THP-1 세포 기반 리포터 시스템을 활용하여 Toll-like 수용체 신호 전달을 억제하는 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 방법을. 이 기술은 염증성 질환 치료를 위한 신속하고 강건한 고처리량 선별 도구를 제공합니다.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

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