Name: 이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 수정된 효모 원 하이브리드 시스템을 사용하여 이성질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검증하는 방법입니다. 이 기술은 기능적 게놈 연구에서 유전자 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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SS Wang, M. Amar, A. Galla에게 원고를 읽는 것에 대해 감사드립니다. 이 간행물에보고 된 연구는 보너스 번호 RO1GM067837 및 RO1GM056006 (SAK로)하에 국립 보건원 국립 의학 종합 연구소 (National Institute of Health)의 지원을 받았다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.

<html> 1. 플라스미드 준비 및 리포터 <ol><li> PCR은 대장균 (TOP10)을 사용하여 진입 벡터에 추가로 클로닝하기 위해 분석 될 표적 DNA의 프로모터 영역 / &quot;단편&quot;(바람직하게 ~ 250-500bp)을 증폭시킨다. </li><li> 시퀀싱 확인시 이전에 설명한 8 , 9 , 10 , 11 과 같이 호환 가능한 pGLacZi 발현 벡터 7 에서 양성 클론을 서브 클론합니다. </li><li> 이전 12 , 13에서 설명한대로 효모 리포터 변형을 생성 pGLacZi의 상 동성 재조합에 의해 발기인 통합 (YM4271)에 대한 효모 변형을 변환합니다. 매체의 제조법과 함께 DNA 영역을 갖는 효모 균주의 형질 전환 및 확인 단계는 단계가 고전적인 Y1H 프로토콜과 유사하기 때문에 여기서 설명하지 않는다ass = &quot;xref&quot;&gt; 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . pEXP - AD502 제어 플라스미드는 정상화 목적으로 사용할 수 있으며 이전에 설명한대로 β - 갈 락토시다 아제 활성을 quantifiying 8 . </li><li> 관심있는 TF 또는 단백질을 클론하고 상호 작용하는 단백질 파트너를 pDEST22 및 pDEST32ΔDBD (pDEST32 마이너스 DNA 결합 도메인) 발현 벡터로 클로닝한다. 형질 전환 된 효모 프로모터 단편 및 TF 클론은 추후에 프로토콜에서 더 사용된다. </li></ol> 2. 수정 된 Y1.5H 프로토콜 <ol><li> 1 일 (오후), 페트리 접시 또는 글리세롤 주식에서 SD - Ura 의 문화의 5 ML로 시작하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 품어. 참고 :이 문화는 신선 줄무늬 접시 또는 효모의 25 % 또는 30 % 글리세롤 주식에서 직접 시작할 수 있습니다DNA 조각으로 복제하십시오. </li><li> 2 일차 (오후)에 YPDA 배지 10 mL에 밤새 배양액 500 μL를 접종하고 30 ° C 쉐이커에서 밤새 배양합니다. </li><li> 3 일차 (아침 일찍 및 오후 내내) : 능력있는 세포 준비 (아침 일찍). <ol><li> 밤새 문화 2 ML와 YPDA 미디어 100 ML을 접종하고 30 ° C의 쉐이 커에서 품어. OD 600 이 0.4-0.8 (3-5 h)에 도달 할 때까지이 신선한 배양 물을 성장시킵니다. 참고 : 하룻밤 문화의 OD 600을 확인하고이 단계의 시작 지점 OD 600 0.1 있는지 확인 - 0.2. 과도한 성장이나 미성숙 된 문화를 사용하면 실험 기간이 길어질 수 있습니다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 소용돌이 또는 피펫 팅 (pipetting)을 사용하여 10 mL의 멸균 수로 펠렛을 재생한다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 재구성2 mL의 Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / Lithium acetate (LiAc)에 vortex를 사용하거나 위아래로 pipetting하여 펠렛을 만든다. 참고 : 표 1의 TE / LiAc 제조법을 참조하십시오. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 4 ML의 TE / LiAc + 400 μL 연어 정자 DNA (10 MG / ML) pipetting 위아래로 펠렛을 다시 일시 중지하고 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 공동 변형 : 세포에 열 충격 (오후 늦게) <ol><li> 96 잘 혼합 접시 (U - 하단)에 잘 당 세포의 20 μL를 배포 할 수 있습니다. </li><li> 우물에 pDEST22 : TF 플라스미드, pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드 및 pEXP - AD502 플러스 pDEST32ΔDBD : TF (정상화 제어)를 각각 150 ng (~ 1.5 μL)를 추가합니다. 참고 : ~ 150 ng 각각의 pDEST22 : TF 및 pDEST32ΔDBD : TF 플라스미드로 최적의 결과가 예상됩니다. 구조 및 플라스미드 표현에 따라 달라질 수 있으므로모든 실험마다 최적화해야합니다. 또 다른 컨트롤 인 pDEST22-TF와 pDEST32deltaDBD는 사용자의 재량에 따라 포함될 수 있습니다. </li><li> 웰 당 100 μL의 TE / LiAc / 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 첨가한다 (3 회 혼합 ). 참고 : 표 1의 TE / LiAc / PEG 제조법을 참조하십시오. </li><li> 통기성이있는 뚜껑으로 플레이트를 덮고 30 ° C (교반 필요 없음)에서 20 - 30 분 (더 길어질 수 있음) 동안 배양하십시오. </li><li> 42 ° C에서 20 분 동안 열충격 ( 정밀 ). </li></ol></li><li> 세포를 판다. <ol><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 상징액을 제거하십시오. 110 μL의 TE를 넣고 섞는다. </li><li> 1000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 뜨는의 100 μL를 제거합니다. 구멍을 뚫어 펠렛을 다시 매달아 라. </li><li> SD - Trp - Leu 한천 플레이트에 세포를 전송합니다. 플레이트를 부화시키다.30 ° C에서 다음 단계까지. </li></ol></li><li> 5 일 (오후) : 펀처 / 마이크로 플레이트 복제기를 사용하여 새 플레이트에 세포를 옮깁니다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 멸균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)에 50 μL의 TE를 채 웁니다. TE의 구멍을 미리 닦으십시오. 참고 :이 단계 전에 그리고 이후 프로토콜에서 펀처 또는 마이크로 플레이트 리플리케이터를 멸균해야합니다. 에 펀치 (100 %, 분자 생물학 등급이 아님)에 담그고 화염에 태우는 것과 같이 구멍을 뚫는 일반적인 방법이 적용될 수 있습니다. 펀처 핀을 식히기 위해 1 분 정도 기다리십시오. 주의 : 벤치에서 살균을 수행하는 경우; 벤치를 에탄올로 사전 청소하고 가연성 물질이 없어야합니다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. </li><li> 식민지를 펀치하고 TE로 채워진 플레이트에 다시 부순다. 참고 : 플레이트에 부드럽게 성장하면 식민지를 직접 펀치 할 수 있습니다TE- 채워진 플레이트 또는 대안으로, 단일 콜로니 (다중 콜로니의 경우)는 TE 채워진 플레이트에 살균 된 이쑤시게를 사용하여 골라야하고,이어서 펀처를 사용하여 다음 단계에 사용할 수 있습니다. </li><li> 최적의 표면 커버리지를 위해 새로운 SD-Trp-Leu 한천 플레이트 로 옮기십시오 . 30 ° C에서 다음 단계까지 플레이트를 배양하십시오. </li></ol></li><li> 7 일 (오후) : β- 갈 락토시다 아제 활성을 측정하기위한 배양을 시작한다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 SD - Trp - Leu 미디어 50 μL와 살균 96 - 웰 혼합 판 (U - 하단)을 작성하십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 180 μl의 SD-Trp-Leu 배지로 96 웰 멸균 블록을 채 웁니다. </li><li> 미디어에 구멍을 뚫어 미리 젖혀 놓은 다음 플레이트에서 식민지를 미디어 50 μL로 옮깁니다. </li><li> SD-Trp-Leu 배지 180 μL에 효모 20 μL를 옮기고 통기성이있는 막을 밀봉합니다. 품다30 ° C 쉐이커에서 36 시간 동안. </li></ol></li><li> 9 일째 (아침) : 효소 측정을위한 배양을 시작하십시오. <ol><li> 멸균 96 깊은 우물 블록에서 YPDA 미디어의 500 μL에 문화의 100 μL을 전송합니다. </li><li> 호흡 할 수있는 씰로 멸균 된 깊은 웰 플레이트를 덮고 200 rpm에서 교반하면서 30 ° C에서 3-5 시간 동안 배양합니다 (OD 600 0.3-0.6까지). </li><li> 문화를 다시 일시 중지하고 분광 광도계 플레이트 (측정 OD 600 )에 멀티 채널 피펫을 사용하여 125 μL를 전송합니다. 참고 :주의 : OD 600 이 0.3 - 0.6 미만인 경우 마지막 방울을 분사하지 마십시오. OD 600 이 판독 값에 따라 1 - 2 시간 동안 더 배양하십시오. 이 단계에서 사용 된 125 μL 배양 물은 폐기되거나 사용자의 재량에 따라 원래의 깊은 웰 블록으로 다시 옮길 수 있습니다. </li><li> 3000 XG 및 21 ° C에서 10 분 동안 깊은 우물 블록에 남아있는 세포를 원심 분리기. supernatan 제거t를 반전 시켜서. </li><li> Z 버퍼 및 와동의 200 μL를 추가합니다. 참고 : 표 1 에서 Z 버퍼의 제조법을 참조하십시오. </li><li> 3000 xg 및 21 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오. 거꾸로하여 뜨는을 제거합니다. </li><li> 20 μL Z-buffer와 vortex를 첨가한다. </li><li> 동결 융해 사이클에 견딜 수있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮으십시오. 흄 후드에서 액체 질소를 사용하여 4 사이클의 동결 / 해동을 수행 한 다음 수조에서 42 ℃ (각 2 분)를 수행합니다. </li><li> 200 μL Z 버퍼 / 베타 - 머 캅토 에탄올 (β-ME) / 오르토 니트로 - β 갈 락토 (ONPG)에 추가 (12 ㎖, 21 μL를 8.4 mg을 각각 20 ㎖의 용액을 수득한다; 항상 신선한 준비). 참고 : ONPG는 올바르게 분해하기 위해 약간의 시간이 걸리므로이 단계에 도달하기 전에 1 시간 전에 용액을 준비하십시오. ONPG는 β- 갈 락토시다 아제 활성의 측정을위한 기질 역할을한다. </li><li> 30 ° C에서 최대 17 - 24 시간 동안 배양하십시오. (색상이 이전 pr다음 단계로 넘어가십시오). </li></ol></li><li> 10 일째 (아침) : 반응을 멈추고 측정하십시오. <ol><li> 110 μL 1M Na 2 CO 3 을 첨가하여 반응을 멈추고 시간을 기록하십시오. </li><li> 3000 xg 및 21 ° C에서 10 분 동안 와동과 원심 분리. </li><li> 멀티 채널을 사용하여 125 μl의 상층 액을 취하여 OD 420을 측정하십시오. 참고 : 거품이 발생하지 않도록 마지막 방울을 분사하지 마십시오. </li><li> 스프레드 시트에서 β-gal 활성 : 1000 x OD 420 / (시간 (분) x 체적 (mL) x OD 600) 을 계산한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

기존의 Y1H 표준 절차는 DNA 미끼에 결합하는 단일 단백질 먹이를 확인하는 데 적합합니다. 다양한 기술적 변경에 따라, 기존의 시스템은 전사 조절 네트워크를 정의하는 데 이용되어왔다. 그러나 TF는 두 개 이상의 TF 또는 단백질을 포함하는 복합체의 일부로 기능하는 것으로 알려져 있으며 TF의 일부만이 DNA에 결합 할 수 있습니다. 단백질 결합 도메인만을 갖고 DNA에 결합하는 능력이 결핍 된 단백질 또는 TF는 복합체에서, 바람직하게는 DNA에 결합 할 수있는 TF로 작용할 가능성이 더 크다. 전통적인 Y1H를 사용하는 고효율 화면은 종종 생물학적으로 중요한 상호 작용을 놓칩니다. 따라서 heteromeric protein-DNA 상호 작용을 검출하기 위해 Y1H 분석법을 적용하는 것이 필수적이다. 여기 제시된 방법은 하나 이상의 단백질 또는 TF를 포함하는 단백질 -DNA 상호 작용을 검출하는 능력을 가진 하나의 적응이다. 독특한 f기술 된 방법의 성숙은 효모 시스템...

<html> 일반적으로 단백질 -DNA 상호 작용을 이해하기 위해 Y1H 분석이 실험실 환경에서 성공적으로 사용되는 선호 시스템입니다 1 . 기본적인 Y1H 분석은 두 가지 요소를 포함한다 : a) 리포터 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에서 성공적으로 복제 된 관심 DNA를 갖는 리포터 구조; 및 b) 관심있는 TF와 효모 전사 활성화 도메인 (AD) 사이에 융합 단백질을 생성시킬 발현 구조물. 융합 단백질은 &#39;먹이&#39;로 알려진 반면, 관심있는 DNA는 일반적으로 &#39;미끼&#39;라고합니다. 지난 몇 년 동안, Y1H 분석법의 여러 버전이 자신의 장점을 지닌 특정 요구에 맞게 개발되었습니다 2 . 기존 Y1H 분석법은 한 번에 한 단백질의 DNA 미끼와의 상호 작용을 확인하고 확인하기 위해 성공적으로 구현 될 수 있지만 이종이 량체 또는 다중 단백질 단백질 -DNA 상호 작용을 식별 할 수있는 능력이 부족합니다. &quot;여기에 설명 된 방법은 기존 Y1H의 변형 된 버전으로 연구원은 표적 DNA 서열에 결합하는 여러 단백질을 동시에 연구 할 수 있습니다.이 분석의 목표는 활성화 도메인 (pDEST22 : TF)와 상호 작용하는 단백질 파트너 (pDEST32ΔDBD-TF)의 존재 및 / 또는 부재 하에서 리포터에 융합 된 후보 DNA 영역의 활성화를 효모 시스템에서 평가할 수있다. 단백질은 목표의 활성화에 필요합니다. 이것은 GATEWAY 복제 호환 시스템이므로 정기적 인 실험실 환경에서 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 효모 시스템에서 여러 TF의 용이 한 동시 변형을 제공하는 직접 변환을 기반으로합니다. 따라서 in vitro 분자 및 기능 검증을 위해 가능한 DNA 표적에 결합하는 단백질 복합체를 검증하는 것이 유리한 전략이다. f또는 어떤 시스템. Tandem affinity purification (TAP) 방법과 같은 현재의 기술은 값 비싸고 노동 집약적이지만 대규모로 단백질 hetrocomplexes를 검출 할 수 있습니다 3 , 4 , 5 . 이 변형 된 효모 원 하이브리드는 작은 규모의 정규 실험실 환경에서 성공적으로 수행 될 수 있으며 ( 그림 1 ) 또한 비용 효율적입니다. Y1.5H 분석은 이종 시스템을 사용하여 공통 DNA 표적에 결합하는 다중 단백질 복합체의 역할을 정의하는 방향으로 자신의 가설을 테스트하고 검증하기 위해 지역 사회 전체의 연구자를 용이하게 할 수 있습니다. 연구 결과에 따르면이 가설은 바람직한 연구 시스템 에서 생체 내 에서 검증 될 수있다. 최근 우리는이 접근법을 사용하여 TF의 역할과 Arabidopsis 6의 개화를 조절하는 작용 기전을 정의했습니다.

<table><tbody><tr><td>pDEST22 벡터</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two 하이브리드 시스템 키트</td></tr><tr><td>pDEST32delatDBD</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000102</td><td>Pro-Quest Two 하이브리드 시스템 키트; 이 vecor는 수정되었습니다. </td></tr> YPDA 매체11791020 클론텍 <tr><td>GATEWAY LR Clonase II효소 믹스</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>YM4271 Strain</td><td>Clontech</td><td>K1603-1</td><td>MATCHMAKER One-Hybrid System</td></tr><tr><td>pEXP-AD502</td><td>Invitrogen</td><td>PQ1000101</td><td>Pro-Quest Two Hybrid System</td>pEXP-AD502 Invitrogen</tr> PDEST32 마이너스 DNA 바인딩 도메인 <tr><td>pENTR/D-TOPO 클로닝 키트</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>SD-Agar</td><td>클론텍</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>SD 최소 매체</td><td>클론텍</td><td>630411</td><td></td></tr><tr><td>우라실 DO 보충제</td><td>클론텍</td><td>630416</td><td></td></tr><tr><td>트립토판 DO 보충제</td><td>클론텍</td><td>630413</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>LiAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Saplmon Sperm (10mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 라운드 바닥 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>PEG3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1546547</td><td></td></tr><tr><td>96-deep 웰 블록</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td></td></tr><tr><td>밀봉 가능한 호일</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td></td></tr><tr><td>Araseal</td><td>Excel Scientific</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>034461-100</td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223484</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</ 하위 >&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83266</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr><tr><td>Drybath</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voretx</td><td>Thermo Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td>SPECTRAMAX PLUS 마이크로플레이트 분광 광도계</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Fisher</td><td>모델 번호 5250-37도, 6250-30도</td><td></td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>뉴 브런 즈윅</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Thermo Fisher</td><td>IsoTemp 205</td><td></td></tr><tr><td>펀처</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falocn</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리플레이트(150mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이성질체 단백질 복합체 -dna 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

지난 수년간 효모 one-hybrid assay는 전사 인자 (TFs)와 DNA 표적과 같은 단백질 간의 물리적 상호 작용을 확인하고 검증하는 중요한 기술로 입증되었습니다. 여기에 제시된 방법은 Y1H의 기본 개념을 사용하지만 대상 DNA에 결합하는 단백질 복합체를 연구하고 검증하기 위해 추가로 변형됩니다. 따라서, 이는 변형 된 효모 일 - 하이브리드 (Y1.5H) 분석으로 지칭된다. 이 분석법은 비용 효과적이며 정기적 인 실험실 환경에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이종 시스템을 사용 함에도 불구 하고 기술 된 방법은 연구 시스템, 특히 식물 유전체학에서 기능적 유전체학을위한 DNA 표적 (들)에 결합하는 헤테로 성 단백질 복합체를 시험하고 검증하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.

관심 단백질 ( 그림 2 )와 효모 세포에서 DNA 영역의 공동 변환을위한 일반적인 플레이트 설정 절차. 플레이트 셋업은 실험의 필요성 및 테스트 된 DNA 영역 / 단편의 수에 따라 수정 될 수있다. 프로토콜의 5 일 이후 well-grown 및 positive plate는 그림 3 과 같이 보여야합니다. 우리의 연구에서, 전사 시작 부위의 시작으로부터 2600 bp 상류의 프로모터 영역은 6 개의 영역 또는 단편 (FR 1-6) 6 으로 분할되었다. 대표적인 그림 ( 그림 3 )에서 DNA 영역 1과 4는 단백질 A와 B 복합체와 양의 상호 작용을 나타냅니다. β- 갈 락토시다 제 활성 ( 보충 표 1 )의 측정시, 단편 -1 만이 리...

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

본 실험의 전반적인 목표는 일반적인 실험실 환경에서 기능성 유전체 연구를 위해 이종 시스템 내 헤테로머 단백질 복합체-DNA 상호작용을 연구하고 검증하는 것입니다. 이 방법은 계획된 유전체학(planned genomics)과 같이 기능성 유전체 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나 이상의 단백질 또는 전사 인자가 관여하는 단백질-DNA 상호작용을 검출할 수 있다는 점입니다.이 절차는 1일차로 지정된 날의 오후에 시작하십시오. 신선하게 스트리킹한 페트리 접시에서 우라실이 없는 합성 정의 배지 또는 SD 배지를 사용하여 5 milliliter 배양을 시작합니다. 30 degree Celsius 셰이커에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날 오후, 500 µL의 하룻밤 배양액을 10 mL의 YPDA 배지에 접종하고 30 °C 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 이른 아침, 2 mL의 하룻밤 배양액을 100 mL의 YPDA 배지에 접종합니다. 이 신선한 배양액을 600 nm에서의 광학 밀도가 0.4에서 0.8에 도달할 때까지 30 °C에서 배양합니다.1000 ×g, 21°C에서 5분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 제거하십시오. 멸균수 10 mL를 첨가하고 볼텍싱하여 펠렛을 재구성하십시오.1000 ×g, 21 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 2 mL의 TE lithium acetate를 첨가한 후, 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁합니다. 1000 ×g, 21 °C에서 5분간 원심분리합니다.상청액을 제거합니다. 4 milliliters의 TE 리튬 아세테이트와 400 microliters의 연어 정자 DNA를 첨가하고 피펫팅하여 펠렛을 재현탁합니다. 이제 세포는 다음 섹션에서 설명하는 형질전환 준비가 완료되었습니다.세포의 공동 형질전환은 96-웰 U-바닥 믹싱 플레이트에서 수행합니다. 먼저, 96-웰 플레이트의 각 웰에 컴피턴트 세포 20 µL를 분주합니다. 그런 다음, 각 웰에 두 종류의 플라스미드와 정규화 대조군을 각각 150 ng씩 첨가합니다.이 도식은 관심 단백질을 이용한 효모 세포의 공동 형질전환을 위한 일반적인 플레이트 설정을 보여줍니다. 플레이트 설정은 실험의 필요성과 테스트할 DNA 영역 또는 단편의 수에 따라 수정할 수 있습니다. 각 웰에 100 µL의 TE 리튬 아세테이트 폴리에틸렌 글리콜을 넣고 피펫팅하여 세 번 섞어줍니다.플레이트를 통기성 씰로 덮고 30 °C에서 20~30분 동안 배양합니다. 정확히 20분 동안 42 °C에서 열충격을 줍니다. 열충격 후, 1000 ×g, 21 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.멀티채널 파이펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. TE 110 µL를 첨가하고 혼합합니다. 5분 동안 다시 원심분리합니다.각 웰에서 상층액 100 µL를 제거합니다. 펀처를 100% ethanol에 담근 후 화염 멸균하고, 펀처 핀이 식을 때까지 1분간 기다립니다. 그 후 멸균된 펀처를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 tryptophan과 lucine이 결핍된 SD dropout agar 플레이트로 옮깁니다.플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. 5일 차 오후에 인큐베이터에서 auger 플레이트를 꺼냅니다. 멸균된 96-well u-bottom 혼합 플레이트의 각 웰에 50 µL의 TE를 채웁니다. 멸균된 펀처를 TE로 미리 적신 후, SD tryptophan 및 lucine 결핍 플레이트에서 콜로니를 펀칭하여 TE가 채워진 플레이트에 재현탁합니다.최적의 표면 도포를 위해 콜로니를 새로운 SD tryptophan 및 lucine 결핍 배지 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. 7일째 오후에 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다.멸균된 96-웰 u-bottom 혼합 플레이트의 각 웰에 50 µL의 SD tryptophan 및 lucine drop out 배지를 채웁니다. 멸균된 96-딥 웰 블록의 각 웰에 180 µL의 SD tryptophan 및 lucine drop out 배지를 채웁니다. 펀처를 멸균하고, 펀처와 배지를 미리 적신 후, 플레이트의 콜로니를 50 µL의 배지가 들어 있는 웰로 옮깁니다.효모 20 µL를 180 µL의 SD tryptophan 및 lucine 결핍 배지에 옮깁니다. 블록을 통기성 씰로 밀봉하고, 30 °C에서 36시간 동안 흔들며 배양합니다. 9일째 되는 날 아침에, 배양액 100 µL를 멸균된 96-deep well 블록에 담긴 500 µL의 YPDA 배지로 옮깁니다.통기성 씰로 덮고 30 °C에서 200 rpm으로 교반하며 3~5시간 동안 배양합니다. 3~5시간 후, 배양물을 재현탁하고 각 웰에서 125 µL를 분주하여 분광광도계 플레이트로 옮깁니다. 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 0.3에서 0.6 사이인지 확인합니다.딥웰 블록에 남아 있는 세포들을 3000 ×g, 21 °C에서 10분 동안 원심분리하십시오. 뒤집어서 상층액을 제거합니다. 각 웰에 200 µL의 Z buffer를 추가하고 볼텍싱하십시오.3000 G, 21°C에서 5분 동안 원심분리하십시오. 뒤집어서 상층액을 제거합니다. 각 웰에 21 µL의 Z buffer를 넣고 볼텍싱하십시오.동결-해동 사이클에 내성이 있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 흄 후드 내에서 액체 질소와 42 °C 항온수조를 사용하여 동결-해동 사이클을 4회 반복합니다. 각 웰에 갓 조제한 Z buffer beta mercaptoethanol ONPG 용액 200 µL를 첨가합니다.30°C에서 17~24시간 동안 또는 색이 나타날 때까지 배양합니다. 10일 차 아침에 색이 발현되었는지 확인합니다. 반응을 중단시키기 위해 각 웰에 1 M 탄산나트륨 110 µL를 첨가합니다.시간을 기록하고 플레이트를 볼텍싱합니다. 3000 ×g, 21 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 125 µL의 상층액을 분광광도계 플레이트로 옮깁니다.420 나노미터에서 광학 밀도를 측정하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스프레드시트를 사용하여 베타 갈락토시다아제 활성을 계산하십시오. 본 연구에서는 전사 시작 지점에서 상위 2600 염기쌍의 프로모터 영역을 6개의 영역 또는 단편으로 나누었습니다.이 사진은 프로토콜 5일 차 이후 잘 성장한 양성 플레이트의 예시입니다. 이 대표적인 결과에서 DNA 단편 1과 4은 단백질 A 및 B 복합체와 양성 상호작용을 보입니다. 베타-갈락토시다아제(beta galactisidase) 활성을 측정한 결과, 단편 1은 리포터 유전자 활성이 4배 유도되었음을 보여줍니다.이 절차는 제안된 단백질-단백질 상호작용이 확인된 후에만 DNA 영역에 대한 정보를 얻기 위해 권장되며, 표적 부위(target sites)에 대한 정보를 제공하도록 설계되지 않았음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 생체 내(in vivo) 표적 부위 식별과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 ChIP 분석이나 Msar와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 공통 DNA 표적에 결합하는 다량체 단백질 복합체의 역할을 테스트하고 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 &gt; 1000 TFs 단일 실험에서.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

배우세요 수정된 효모 원 하이브리드 시스템을 사용하여 이성질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검증하는 방법입니다. 이 기술은 기능적 게놈 연구에서 유전자 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

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