이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

이 실험의 전반적인 목표는 일반 실험실 환경에서 모든 기능적 게놈 연구를 위해 이종 시스템에서 이질체 단백질 복합체-DNA 상호 작용을 연구하고 검증하는 것입니다. 이 방법은 계획된 유전체학(planned genomics)과 같은 기능유전체학(functional genomics) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나 이상의 단백질 또는 전사 인자를 포함하는 단백질 DNA 상호 작용을 감지한다는 것입니다.

첫째 날로 지정된 날 오후에 이 절차를 시작합니다. 갓 줄무늬를 만든 페트리 접시에서 우라실이 없는 합성 정의 배지 또는 SD 배지에서 5밀리리터 배양을 시작합니다. 섭씨 30도의 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 오후에 10ml의 YPDA 배지에 500마이크로리터의 야간 배양을 접종하고 섭씨 30도의 셰이커에서 밤새 배양합니다. 다음날 이른 아침에 100ml의 YPDA 배지에 2ml의 야간 배양을 접종합니다. 600 나노 미터의 광학 밀도가 0.4-0.8에 도달 할 때까지 섭씨 30도에서이 신선한 배양을 성장시킵니다.

1000배 G와 섭씨 21도에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 10ml의 멸균수를 넣고 볼텍싱으로 펠릿을 재구성합니다.

1000회 G와 섭씨 21도에서 5분 동안 원심분리기. 상등액을 버리고 TE 리튬 아세테이트 2ml를 첨가하고 볼텍싱으로 펠릿을 재구성합니다. 1000회 G와 섭씨 21도에서 5분 동안 원심분리기

상등액을 버리십시오. TE 리튬 아세테이트 4ml와 연어 정자 DNA 400마이크로리터를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 이제 세포는 다음 세그먼트에서 설명된 것처럼 변형할 준비가 되었습니다.

세포의 공동 형질전환은 96웰 U-바닥 혼합 플레이트에서 수행됩니다. 먼저, 96개의 웰 플레이트에 웰당 20마이크로리터의 유능한 세포를 분배합니다. 그런 다음 웰에 두 개의 플라스미드 각각을 150나노그램씩 추가하고 정규화 제어를 합니다.

이 회로도는 관심 단백질과 효모 세포의 공동 형질전환을 위해 설정된 일반 플레이트를 보여줍니다. 플레이트 설정은 실험의 필요성과 테스트된 DNA 영역 또는 단편의 수에 따라 수정할 수 있습니다. 웰당 100마이크로리터의 TE 리튬 아세테이트 폴리에틸렌 글리콜을 추가하고 피펫팅으로 3회 혼합합니다.

통기성 밀봉으로 플레이트를 덮고 섭씨 30도에서 20-30분 동안 배양합니다. 섭씨 42도에서 정확히 20분 동안 열 충격. 열충격 후 G 1000회, 섭씨 21도에서 5분간 원심분리한다.

멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 110마이크로리터의 TE를 넣고 섞습니다. 다시 5분 동안 원심분리기를 합니다.

각 웰에서 100마이크로리터의 상층액을 제거합니다. 펀처를 100% 에탄올에 담그고 화염을 피우고 펀처 핀이 식을 때까지 1분 동안 기다린 다음 멸균 펀처를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. SD 트립토판과 루신이 오거 플레이트를 떨어뜨립니다.

접시를 섭씨 30도에서 이틀 동안 배양합니다. 5일째 오후에 인큐베이터에서 오거 플레이트를 회수합니다. 멸균 96웰 u-바닥 혼합 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 TE를 채웁니다. 멸균 펀처를 TE에 미리 적시고, SD 트립토판 및 루신 드롭아웃 플레이트에서 콜로니를 펀칭하고, TE 충전 플레이트에 다시 현탁시킵니다.

최적의 표면 커버리지를 위해 콜로니를 새로운 SD 트립토판 및 루신 드롭아웃 오거 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 2일 동안 배양합니다. 7일째 오후에 인큐베이터에서 오거 플레이트를 회수합니다.

멸균 96웰 u-바닥 혼합 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 SD 트립토판 및 루신 드롭아웃 배지를 채웁니다. 멸균 96 딥 웰 블록의 각 웰에 180마이크로리터의 SD 트립토판 및 루신 드롭아웃 배지를 채웁니다. 펀처를 살균하고, 펀처와 배지를 미리 적시고, 플레이트에서 각각 50마이크로리터의 배지가 들어 있는 웰로 콜로니를 옮깁니다.

20마이크로리터의 효모를 180마이크로리터의 SD 트립토판 및 루신 드롭아웃 배지로 옮깁니다. 통기성 씰로 블록을 밀봉하고 섭씨 30도에서 36시간 동안 흔들면서 배양합니다. 9일째 아침, 100마이크로리터의 배양액을 멸균된 96 딥 웰 블록에서 500마이크로리터의 YPDA 배지로 옮깁니다.

통기성 씰로 덮고 섭씨 30도에서 200rpm으로 3-5시간 동안 교반하면서 배양합니다. 3-5시간 후에 배양물을 다시 현탁시키고 각 웰에서 125마이크로리터를 분광광도계 플레이트로 옮깁니다. 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 0.3에서 0.6 사이인지 확인합니다.

딥 웰 블록의 나머지 세포를 3000배 G와 섭씨 21도에서 10분 동안 원심분리합니다. 반전으로 상등액을 제거합니다. 200마이크로리터의 Z 버퍼를 각 웰과 와류에 추가합니다.

3000g에서 섭씨 21도에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. 반전으로 상등액을 제거합니다. 21마이크로리터의 Z 버퍼를 각 웰과 와류에 추가합니다.

동결 해동 주기에 강한 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 흄 후드에서 액체 질소와 섭씨 4도의 수조를 사용하여 42회 동결/해동을 수행합니다. 각 웰에 갓 준비된 Z 버퍼 베타 메르캅토에탄올 ONPG 용액 200마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 30도에서 17-24시간 동안 또는 색이 발현될 때까지 배양합니다. 10일째 아침에 색이 발병했는지 확인합니다. 반응을 중지하기 위해 각 웰에 110마이크로리터의 1몰 탄산나트륨을 추가합니다.

시간을 기록하고 접시를 소용돌이치십시오. 3000회 G와 섭씨 21도에서 10분 동안 원심분리기. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 125마이크로리터의 상등액을 분광광도계 플레이트로 이송합니다.

420나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스프레드 시트에서 베타 갈락토시다아제 활성을 계산합니다. 이 연구에서는 전사 시작 부위의 시작부터 업스트림에 있는 2600개 염기쌍의 프로모터 영역을 6개의 영역 또는 단편으로 분할했습니다.

이 사진은 프로토콜 5일차 이후 잘 성장한 긍정적인 플레이트의 예입니다. 이 대표적인 결과에서 DNA 단편 1과 4는 단백질 A 및 B 복합체와 긍정적인 상호 작용을 보여줍니다. 베타 골락티시다아제 활성을 측정한 결과, 단편 1은 리포터 유전자 활성의 4배 유도를 보여줍니다.

이 절차는 제안된 단백질 단백질 상호 작용이 확인된 후에만 DNA 영역에 대한 정보를 얻는 데 권장되며 표적 부위에 대한 정보를 제공하도록 설계되지 않았다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 칩 분석 및 Msar와 같은 다른 방법을 준비할 수 있습니다. 예를 들어, in vivo에서 대상 부위를 식별합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 공통 DNA 표적에 결합하는 다량체 단백질 복합체의 역할을 테스트하고 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.