이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

본 실험의 전반적인 목표는 일반적인 실험실 환경에서 기능성 유전체 연구를 위해 이종 시스템 내 헤테로머 단백질 복합체-DNA 상호작용을 연구하고 검증하는 것입니다. 이 방법은 계획된 유전체학(planned genomics)과 같이 기능성 유전체 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나 이상의 단백질 또는 전사 인자가 관여하는 단백질-DNA 상호작용을 검출할 수 있다는 점입니다.

이 절차는 1일차로 지정된 날의 오후에 시작하십시오. 신선하게 스트리킹한 페트리 접시에서 우라실이 없는 합성 정의 배지 또는 SD 배지를 사용하여 5 milliliter 배양을 시작합니다. 30 degree Celsius 셰이커에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

다음 날 오후, 500 µL의 하룻밤 배양액을 10 mL의 YPDA 배지에 접종하고 30 °C 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 이른 아침, 2 mL의 하룻밤 배양액을 100 mL의 YPDA 배지에 접종합니다. 이 신선한 배양액을 600 nm에서의 광학 밀도가 0.4에서 0.8에 도달할 때까지 30 °C에서 배양합니다.

1000 ×g, 21°C에서 5분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 제거하십시오. 멸균수 10 mL를 첨가하고 볼텍싱하여 펠렛을 재구성하십시오.

1000 ×g, 21 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 2 mL의 TE lithium acetate를 첨가한 후, 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁합니다. 1000 ×g, 21 °C에서 5분간 원심분리합니다.

상청액을 제거합니다. 4 milliliters의 TE 리튬 아세테이트와 400 microliters의 연어 정자 DNA를 첨가하고 피펫팅하여 펠렛을 재현탁합니다. 이제 세포는 다음 섹션에서 설명하는 형질전환 준비가 완료되었습니다.

세포의 공동 형질전환은 96-웰 U-바닥 믹싱 플레이트에서 수행합니다. 먼저, 96-웰 플레이트의 각 웰에 컴피턴트 세포 20 µL를 분주합니다. 그런 다음, 각 웰에 두 종류의 플라스미드와 정규화 대조군을 각각 150 ng씩 첨가합니다.

이 도식은 관심 단백질을 이용한 효모 세포의 공동 형질전환을 위한 일반적인 플레이트 설정을 보여줍니다. 플레이트 설정은 실험의 필요성과 테스트할 DNA 영역 또는 단편의 수에 따라 수정할 수 있습니다. 각 웰에 100 µL의 TE 리튬 아세테이트 폴리에틸렌 글리콜을 넣고 피펫팅하여 세 번 섞어줍니다.

플레이트를 통기성 씰로 덮고 30 °C에서 20~30분 동안 배양합니다. 정확히 20분 동안 42 °C에서 열충격을 줍니다. 열충격 후, 1000 ×g, 21 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.

멀티채널 파이펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. TE 110 µL를 첨가하고 혼합합니다. 5분 동안 다시 원심분리합니다.

각 웰에서 상층액 100 µL를 제거합니다. 펀처를 100% ethanol에 담근 후 화염 멸균하고, 펀처 핀이 식을 때까지 1분간 기다립니다. 그 후 멸균된 펀처를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 tryptophan과 lucine이 결핍된 SD dropout agar 플레이트로 옮깁니다.

플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. 5일 차 오후에 인큐베이터에서 auger 플레이트를 꺼냅니다. 멸균된 96-well u-bottom 혼합 플레이트의 각 웰에 50 µL의 TE를 채웁니다. 멸균된 펀처를 TE로 미리 적신 후, SD tryptophan 및 lucine 결핍 플레이트에서 콜로니를 펀칭하여 TE가 채워진 플레이트에 재현탁합니다.

최적의 표면 도포를 위해 콜로니를 새로운 SD tryptophan 및 lucine 결핍 배지 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 30 °C에서 2일 동안 배양합니다. 7일째 오후에 배양기에서 플레이트를 꺼냅니다.

멸균된 96-웰 u-bottom 혼합 플레이트의 각 웰에 50 µL의 SD tryptophan 및 lucine drop out 배지를 채웁니다. 멸균된 96-딥 웰 블록의 각 웰에 180 µL의 SD tryptophan 및 lucine drop out 배지를 채웁니다. 펀처를 멸균하고, 펀처와 배지를 미리 적신 후, 플레이트의 콜로니를 50 µL의 배지가 들어 있는 웰로 옮깁니다.

효모 20 µL를 180 µL의 SD tryptophan 및 lucine 결핍 배지에 옮깁니다. 블록을 통기성 씰로 밀봉하고, 30 °C에서 36시간 동안 흔들며 배양합니다. 9일째 되는 날 아침에, 배양액 100 µL를 멸균된 96-deep well 블록에 담긴 500 µL의 YPDA 배지로 옮깁니다.

통기성 씰로 덮고 30 °C에서 200 rpm으로 교반하며 3~5시간 동안 배양합니다. 3~5시간 후, 배양물을 재현탁하고 각 웰에서 125 µL를 분주하여 분광광도계 플레이트로 옮깁니다. 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 0.3에서 0.6 사이인지 확인합니다.

딥웰 블록에 남아 있는 세포들을 3000 ×g, 21 °C에서 10분 동안 원심분리하십시오. 뒤집어서 상층액을 제거합니다. 각 웰에 200 µL의 Z buffer를 추가하고 볼텍싱하십시오.

3000 G, 21°C에서 5분 동안 원심분리하십시오. 뒤집어서 상층액을 제거합니다. 각 웰에 21 µL의 Z buffer를 넣고 볼텍싱하십시오.

동결-해동 사이클에 내성이 있는 밀봉 호일로 플레이트를 덮습니다. 흄 후드 내에서 액체 질소와 42 °C 항온수조를 사용하여 동결-해동 사이클을 4회 반복합니다. 각 웰에 갓 조제한 Z buffer beta mercaptoethanol ONPG 용액 200 µL를 첨가합니다.

30°C에서 17~24시간 동안 또는 색이 나타날 때까지 배양합니다. 10일 차 아침에 색이 발현되었는지 확인합니다. 반응을 중단시키기 위해 각 웰에 1 M 탄산나트륨 110 µL를 첨가합니다.

시간을 기록하고 플레이트를 볼텍싱합니다. 3000 ×g, 21 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 125 µL의 상층액을 분광광도계 플레이트로 옮깁니다.

420 나노미터에서 광학 밀도를 측정하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 스프레드시트를 사용하여 베타 갈락토시다아제 활성을 계산하십시오. 본 연구에서는 전사 시작 지점에서 상위 2600 염기쌍의 프로모터 영역을 6개의 영역 또는 단편으로 나누었습니다.

이 사진은 프로토콜 5일 차 이후 잘 성장한 양성 플레이트의 예시입니다. 이 대표적인 결과에서 DNA 단편 1과 4은 단백질 A 및 B 복합체와 양성 상호작용을 보입니다. 베타-갈락토시다아제(beta galactisidase) 활성을 측정한 결과, 단편 1은 리포터 유전자 활성이 4배 유도되었음을 보여줍니다.

이 절차는 제안된 단백질-단백질 상호작용이 확인된 후에만 DNA 영역에 대한 정보를 얻기 위해 권장되며, 표적 부위(target sites)에 대한 정보를 제공하도록 설계되지 않았음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에, 생체 내(in vivo) 표적 부위 식별과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 ChIP 분석이나 Msar와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 공통 DNA 표적에 결합하는 다량체 단백질 복합체의 역할을 테스트하고 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.