Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

본 프로토콜은 혈장 분석을 위한 시료 준비 과정입니다. 시료의 무결성을 보장하기 위해, 모든 시료와 표준물질은 수집 및 처리 과정 동안 2~8°C로 유지해야 함에 유의하십시오. 취급이 완료되면 모든 시료를 -20°C에 보관하십시오.

표준물질 조제를 위해, 각 아닐라이드(anilide), ivacaftor, M1 대사체, M6 대사체 및 lumacaftor를 메탄올에 녹여 100 µg/mL와 10 µg/mL 농도의 독립적인 스톡 용액을 각각 두 개씩 준비합니다. 해당 화합물들은 상온 보관 시 10일 후에 만료되므로 주의하시기 바랍니다. 표준물질의 경우, 1.5 mL 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 인간 혈장 100 µL를 옮깁니다.

나머지 모든 샘플에 대해서도 동일하게 진행하십시오. 그런 다음 각 튜브에 내부 표준물질을 첨가합니다. 예를 들어, 준비된 표준물질 중에서 0.01 µg/mL를 선택합니다.

이제 이 튜브에는 내부 표준 물질이 첨가된 혈장이 들어 있습니다. 다른 모든 표준 용액에 대해서도 동일하게 진행하십시오. 표준 용액들을 가져와 몇 초간 원심 분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 모이도록 하십시오.

나머지 40개의 모든 표준물질에 대해서도 이 과정을 반복하십시오. 환자 샘플의 경우, 환자 샘플 튜브에서 100 µL를 취해 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 실제 환자 샘플에는 내부 표준물질이 첨가되지 않습니다.

환자 샘플을 몇 초 동안 원심 분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 다음 단계들은 샘플과 표준품 모두에 동일하게 적용됩니다. 혈장 단백질을 침전시키기 위해 각 샘플 튜브에 acetonitrile에 녹인 0.1% formic acid 200 microliters를 첨가합니다.

모든 표준 물질과 환자 검체에 대해 동일하게 반복합니다. 각 검체를 약 15초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 모든 표준 물질과 실제 시료(incurred samples)에 대해 이 과정을 계속 수행합니다.

침전을 촉진하기 위해 냉장고에서 10분 동안 방치합니다. 시연을 위해 하나의 샘플과 하나의 표준품만 원심분리하겠습니다. Eppendorf Centrifuge 5430을 사용하여 4°C에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리합니다.

이제 상층액을 Phenomenex 바이알에 여과하겠습니다. 이를 위해 미국에서 구입한 0.45 micrometers 나일론 Grace 필터가 장착된 13 millimeter 시린지 필터를 사용하며, 1.5 milliliters를 담을 수 있는 HPLC 바이알에 여과합니다. 여과 후, LC/MS 분석을 위해 상층액 100 microliters를 LC/MS 바이알로 옮깁니다.

이제 이 샘플은 분석 준비가 완료되었습니다. 모든 샘플을 바이알 랙에 넣으십시오. 본 실험에서는 트리플 쿼드러폴 질량 분석기가 결합된 Shimadzu 8030 LC/MS 시스템을 사용합니다.

분석 전 시스템을 평형 상태로 둡니다. 약 15분이 소요되는 평형 상태에 도달하면, Start 버튼을 누르십시오. 각 대사물질에 대해, 검량 표준물질의 명목 농도에 따른 아닐라이드(anilide)의 피크 면적 비율을 도식화하여 검량선을 작성합니다.

검량선의 회귀 방정식을 사용하여 실제 시료 내 anilides의 농도를 계산하십시오. 전형적인 크로마토그램이 이 그림에 나타나 있습니다. Phenomenex Kinetex C8 컬럼에서 100% acetonitrile과 0.1% formic acid 수용액을 이동상으로 사용하여 기울기 용리(gradient elution)를 수행함으로써 최적화된 크로마토그래피 분해능을 얻었습니다.

LC 머무름 시간은 다음과 같았습니다. M6의 경우 1분, M1의 경우 1.3분이었습니다.

ivacaftor의 경우 1.55분, lumacaftor의 경우 2.3분이었습니다. 모든 공백 혈장 시료에서 두 anilide의 머무름 시간(retention time)에 대한 간섭은 관찰되지 않았으며, ivacaftor와 lumacaftor의 조합으로 인한 간섭 또한 검출되지 않았습니다.

많은 양의 환자 시료에 대한 고처리량 분석을 통해, 당사는 기존의 등용리 용리 대신 더 작은 공극 크기의 역상 크로마토그래피 컬럼인 Phenomenex C8 컬럼과 기울기 용매 시스템을 사용하여 기보고된 방법을 최적화하였습니다. 이를 통해 세척 단계를 포함하여 시료당 분석 시간을 6분으로 단축하였습니다. 이 신뢰성 있고 새로운 방법은 생체 시료 내 ivacaftor 및 ivacaftor-lumacaftor 병용 투여의 치료적 약물 모니터링을 위한 단순하고 민감하며 신속한 접근 방식을 제공합니다.

약물 효능을 극대화하고 의료 비용을 억제하기 위해 노출-반응 관계를 개발해야 할 필요성이 있음에 따라, CF 환자를 대상으로 증거 기반 치료와 고처리량 분석 기술을 사용하는 임상의를 지원할 수 있는 더 민감한 도구의 개발 및 검증이 필요합니다. 제안된 분석 방법을 임상 약동학 및 약역학 연구에 적용함으로써, 더 많은 환자 집단을 대상으로 ivacaftor 또는 ivacaftor-lumacaftor 병용 투여의 약동학적 파라미터를 추가로 조사할 수 있는 기회가 마련될 것입니다.