Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

이것은 혈장 분석을 위한 샘플 준비를 위한 프로토콜입니다. 무결성을 보장하기 위해 모든 샘플과 표준물질은 수집 및 처리 중에 섭씨 2도에서 8도로 유지되어야 합니다. 취급이 완료되면 모든 샘플을 영하 20도에서 보관하십시오.

표준 제제의 경우, 메탄올에 각 아닐라이드, 이바카프토르, M1 대사산물, M6 대사산물 및 루마카프토르의 두 개의 독립적인 원액을 100마이크로리터 및 밀리리터당 10마이크로그램으로 준비합니다. 화합물은 벤치 탑에서 10일 후에 만료됩니다. 표준의 경우, 100마이크로리터의 인간 플라즈마를 1.5밀리리터 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다.

다른 모든 샘플에 대해 계속 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 각 튜브에 내부 표준물질을 추가합니다. 예를 들어, 준비된 표준물질에서 밀리리터당 0.01마이크로그램을 선택합니다.

이제 이 튜브에는 내부 표준물질로 스파이크된 플라즈마가 포함되어 있습니다. 다른 모든 표준과 함께 이와 같이 진행하십시오. 표준을 잡고 몇 초 동안 회전시켜 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인하십시오.

40가지 표준 모두에 대해 이 작업을 계속하십시오. 환자 샘플의 경우 환자 샘플 튜브에서 마이크로 원심분리기 튜브로 100마이크로리터를 옮깁니다. 실제 환자 샘플에는 내부 표준물질이 첨가되어 있지 않습니다.

환자 샘플을 몇 초 동안 회전시켜 모든 액체가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. 다음 단계는 샘플과 표준물질 모두에 맞게 설계되었습니다. 아세토니트릴에 함유된 0.1%포름산 200마이크로리터를 각 샘플 튜브에 첨가하여 혈장 단백질을 침전시킵니다.

모든 표준 및 환자 샘플에 대해 계속 이 작업을 수행합니다. 약 15초 동안 각 샘플을 격렬하게 소용돌이치십시오. 모든 표준 및 발생한 샘플에 대해 계속 이 작업을 수행합니다.

강수량을 용이하게 하기 위해 냉장고에 10분 동안 그대로 두십시오. 시연을 위해 하나의 샘플과 하나의 표준물질만 원심분리하겠습니다. 4도에서 Eppendorf Centrifuge 5430을 10, 000rpm으로 10분 동안 원심분리하고 있습니다.

이제 상층액을 Phenomenex 바이알로 여과합니다. 이를 위해 미국에서 구입한 0.45마이크로미터 나일론 그레이스 필터가 있는 13mm 주사기 필터를 사용하고 있으며, 1.5밀리리터를 포함할 수 있는 HPLC 바이알로 필터링하고 있습니다. 여과 후 LC/MS 분석을 위해 100마이크로리터의 상등액을 LC/MS 바이알로 옮깁니다.

이제 이 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 이제 모든 샘플을 바이알 랙에 넣기만 하면 됩니다. 당사는 삼중 사중극자 질량 분석기와 결합된 Shimadzu 8030 LC/MS 시스템을 사용하고 있습니다.

분석하기 전에 시스템이 평형을 이루도록 합니다. 약 15분이 소요되는 평형이 되면 시작 버튼을 누르기만 하면 됩니다. 각 대사 산물에 대해 보정 표준물질의 공칭 농도 대비 아닐라이드의 피크 면적 비율을 표시하여 보정 곡선을 구성합니다.

검량선에 대한 회귀 방정식을 사용하여 발생한 샘플의 아닐라이드 농도를 계산합니다. 일반적인 크로마토그램이 이 그림에 표시되어 있습니다. Phenomenex Kinetex C8 컬럼에서 그래디언트 용리와 함께 물에서 100% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산의 이동상을 사용하여 최적화된 크로마토그래피 분리능을 얻었습니다.

LC 머무름 시간은 다음과 같습니다. M6의 경우 1분. M1의 경우 1.3분.

이바카프터의 경우 1.55분. lumacaftor의 경우 2.3 분. 모든 블랭크 플라즈마 샘플에서 아닐라이드 중 하나의 체류 시간에 대한 간섭은 관찰되지 않았으며, 이바카프터와 루마카프토르의 조합에서도 간섭이 검출되지 않았습니다.

많은 양의 환자 샘플에 대한 고처리량 분석을 통해, 현재의 등용매 용리 대신 더 작은 공극 크기의 역상 크로마토그래피 컬럼 Phenomenex C8 컬럼과 그래디언트 용매 시스템을 사용하여 보고된 방법을 최적화했습니다. 이를 통해 세척 단계를 포함하여 샘플당 실행 시간이 6분으로 단축됩니다. 이 신뢰할 수 있고 새로운 방법은 이바카프터 및 이바카프토르-루마카프터 조합 및 생물학적 유체의 치료 약물 모니터링을 위한 간단하고 민감하며 신속한 접근 방식을 제공합니다.

약물 효능을 극대화하고 의료 비용을 억제하기 위해 노출-반응 관계를 개발해야 할 필요성을 감안할 때, 제안된 분석 방법을 임상 약동학 및 약력학 연구에 적용하는 CF.By 으로 고통받는 환자를 위해 임상의가 증거 기반 요법 및 고처리량 분석 기술을 사용할 수 있도록 지원하기 위해 보다 민감한 도구를 개발하고 검증해야 합니다. 더 큰 환자 집단에 대한 IVacaftor-Lumacaftor 조합.