네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

본 절차의 전반적인 목적은 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 네이티브 크로마틴 면역침전 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이 방법은 단일 뉴클레오솜 수준에서 세포 집단의 후성유전학적 특징을 밝히고, 이질적인 크로마틴 시그니처를 연속적인 요소로 분해하는 것과 같은 후성유전학적 질문에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 개방형 크로마틴 영역에 우선적으로 접근하는 MNase의 특성을 활용하여 MNase 접근성과 히스톤 수식을 결합한 측정값을 생성하는 것입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 MNase 소화를 최적화하는 데 어려움을 겪습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 준비부터 이 프로토콜을 시작하십시오. 1일 차에는 각 세포 펠렛을 37°C 항온수조에서 10초 동안 해동합니다.

그런 다음, 세포를 얼음으로 옮깁니다. 각 세포 펠릿에 얼음처럼 차가운 1X lysis buffer와 1X PIC를 즉시 첨가하여 최종 농도가 20 µL당 10,000 cells가 되도록 합니다. 기포가 생기지 않도록 피펫팅으로 10회 섞어줍니다.

얼음 위에서 작업하며, 생성된 용해물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 20 µL씩 분주합니다. 플레이트를 플라스틱 씰로 덮은 후 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 플레이트에 MNase라고 라벨을 붙이고, 웰 정보를 템플릿 키에 기록합니다.

20분간의 용해가 완료되기 직전에, MNase one 효소를 MNase one 희석 버퍼로 희석하여 최종 농도가 20 units/µL가 되도록 만든 후 얼음 위에 보관하십시오. 얼음 위에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MNase one 소화 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음, 샘플의 각 행당 20 µL의 마스터 믹스를 분주하고, 96-웰 리저버 플레이트에 5 µL의 여유분을 추가로 분주하십시오.

용해물(lysate)의 배양이 끝나면, 얼음에서 MNase 소화 플레이트를 꺼냅니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 샘플 열에 MNnase one 소화 마스터 믹스 20 µL를 추가하고, 피펫팅을 10회 반복하여 혼합합니다. 각 열 사이에는 팁을 교체하십시오.

그 후, 플레이트를 실온에서 정확히 5분 동안 배양합니다. 5분 후 반응을 중단시키기 위해, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 시료 행에 250 µM EDTA 6 µL를 첨가하고 위아래로 몇 번 섞어줍니다. 행을 바꿀 때마다 반드시 팁을 교체하십시오.

EDTA를 첨가한 후, 피펫 설정을 20 µL로 변경하고 이전과 동일하게 10회 혼합하여 소화 반응이 완전히 중단되도록 합니다. 마지막으로, MNase로 소화시킨 각 샘플 열에 10X lysis buffer 6 µL를 첨가하고 피펫팅을 10회 반복하여 잘 혼합합니다. 플레이트를 플라스틱 씰로 덮고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체 비드 복합체 플레이트와 사전 제거(pre-clearing) 플레이트를 준비합니다. 두 플레이트를 200 ×g에서 10초 동안 원심분리하여 빠르게 스핀합니다. 그런 다음, 항체 비드 복합체 플레이트를 플레이트 자석 위에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드가 흐트러지지 않도록 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.

그 다음, 플레이트를 플레이트 마그넷에서 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 전처리 세척(pre-clearing) 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 놓고, 비드가 분리되어 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며, 피펫을 사용하여 상층액을 얼음 위에 보관된 항체-비드 복합체 플레이트의 해당 웰로 조심스럽게 옮깁니다.

피펫팅으로 15회 부드럽게 위아래로 섞어 각 웰을 혼합합니다. 알루미늄 플레이트 커버로 플레이트를 잘 밀봉하고, 회전 플랫폼 위에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트에 IP Reaction이라고 다시 라벨을 붙입니다.

둘째 날, 가열 믹서를 65 °C로 설정한 다음, 저염 세척 버퍼와 고염 세척 버퍼를 얼음 위에서 준비합니다. IP 반응 플레이트를 200 ×g에서 10초 동안 빠르게 원심 분리합니다. IP 반응 플레이트를 플레이트 자석 위에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.

플레이트를 플레이트 마그넷에서 분리하여 얼음 위에 놓습니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 얼음처럼 차가운 저염 세척 버퍼 150 µL를 첨가하고, 비드를 완전히 재부유시키기 위해 천천히 10회 위아래로 혼합합니다. IP 반응 플레이트를 다시 플레이트 마그넷 위에 놓고 이전과 동일하게 상층액을 제거합니다.

그 다음, 플레이트를 다시 얼음에 올려두고 세척 단계를 총 2회 반복합니다. 얼음 위에서 작업하며, IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 150 µL의 고염 세척 버퍼를 추가합니다. 파이펫으로 10회 천천히 흡입 및 배출하여 샘플을 섞어 비드를 완전히 재현탁합니다.

이전과 동일하게 상층액을 제거한 후, IP 반응 플레이트를 얼음 위에 두고 그 옆에 새로운 96-웰 플레이트를 미리 냉각시켜 둡니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 열에 150 µL의 고염 세척 버퍼를 첨가하고, 피펫팅으로 10회 천천히 섞어 비즈를 완전히 재현탁시킵니다. 재현탁 후, 각 샘플 열을 미리 냉각된 새 96-웰 플레이트의 해당 열로 옮깁니다.

사용했던 플레이트를 폐기하십시오. 새로운 IP 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 놓고 이전과 동일하게 상층액을 제거하십시오. 플레이트를 실온에서 보관하십시오.

IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 ChIP 용출 버퍼 30 µL를 첨가하고, 피펫팅을 10회 반복하여 천천히 혼합합니다. 이때 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 PCR 커버로 밀봉하고, 가열 믹서에서 65 °C의 온도로 믹싱 속도 1,350 RPM으로 1시간 30분 동안 배양합니다.

1시간 30분 동안 배양한 후, IP 반응 플레이트를 4°C에서 200 ×g로 1분간 원심 분리합니다. 그 다음, IP 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 올려놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않도록 주의하며, 각 행마다 새 팁을 사용하여 상층액 20 µL를 새로운 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.

플레이트에 IP Reaction이라고 표시하고 상온에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 소화와 이에 이은 라이브러리 구축 단계를 진행하십시오. 여기에는 라이브러리 생성 전, 최적 상태, 미흡하게 소화된 상태 및 과하게 소화된 MNase 소화 크로마틴의 대표적인 결과가 나타나 있습니다.

최적으로 소화된 프로파일은 단일 뉴클레오솜 단편 크기가 지배적이며, 고차 뉴클레오솜 단편의 회수가 가능하도록 과도하게 소화되지 않은 상태입니다. 염색질의 미흡한 소화는 IP 물질로부터 생성된 시퀀싱 라이브러리의 프로파일에서도 분명하게 나타납니다. qPCR을 통해 라이브러리를 검증하기 위해, 양성 및 음성 타겟에 대해 입력 라이브러리 대비 IP 라이브러리의 농축 배수를 평가하였습니다.

또한, qPCR로 평가한 fold enrichment 값이 높은 라이브러리의 정렬된 리드(aligned reads)를 게놈 브라우저에서 확인하면, 입력(input) 라이브러리에 비해 시각적으로 감지 가능한 농축(enrichment)이 나타나야 합니다. 성공적인 뉴클레오솜 밀도 ChIP-sequencing 라이브러리는 높은 상관관계를 가진 반복 시료를 포함하며, 정렬된 리드의 상당 부분이 MACS2로 식별된 농축 피크 내에 존재하게 됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 네이티브 염색질 면역침전 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 염색질이 최적으로 소화되었는지 확인하고, 관심 있는 에피토프와 높은 친화력을 가지며 다른 에피토프와는 교차 반응성이 거의 없거나 없는 항체만을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 세포 집단 내의 이질성으로 인한 후성유전학적 특징과 같은 질문에 답하기 위해 MNase 접근성에 대한 계산 모델링을 수행할 수 있습니다.

이 방법은 뉴클레오솜 위치와 국소 밀도의 조합 효과뿐만 아니라 히스톤 하위 단위의 번역 후 수정을 파악할 수 있게 해주며, 인간 또는 생쥐, 일차 세포 및 냉동 조직과 같은 모든 시스템에 적용 가능합니다.