네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

이 절차의 전반적인 목표는 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 네이티브 염색질 면역침전 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이 방법은 단일 뉴클레오솜 수준에서 세포 집단의 후성유전체 특징을 밝히고 이질적인 염색질 서명을 연속 요소로 분해하는 것과 같은 후성유전학의 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 열린 염색질 영역에 대한 우선적 접근의 MNase 속성을 활용하여 MNase 접근성과 히스톤 변형을 결합한 측정을 생성하는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 최적의 MNase 분해를 얻을 수 없기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 준비로 이 프로토콜을 시작합니다. 첫째 날에는 각 세포 펠릿을 섭씨 37도의 수조에서 10초 동안 해동합니다.

그런 다음 세포를 얼음으로 옮깁니다. 각 세포 펠릿에 즉시 얼음처럼 차가운 one-X lysis buffer와 one-X PIC를 20 microliter당 10,000 cells의 최종 농도로 첨가하십시오. 거품이 생기지 않도록 위아래로 피펫팅하여 10회 혼합합니다.

얼음에서 작업하면서 생성된 용해물을 웰당 20마이크로리터씩 96웰 플레이트에 분취합니다. 얼음에서 20분 동안 배양하기 전에 플라스틱 씰로 접시를 덮으십시오. 플레이트에 MNase로 레이블을 지정하고 웰을 템플릿 키에 기록합니다.

20분 용해가 완료되기 직전에 MNase 1 효소를 MNase 1 희석 완충액으로 희석하여 마이크로리터당 20단위의 최종 농도로 희석하고 얼음 위에 보관합니다. 얼음에서 작업하면서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MNase one 소화 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 샘플의 각 행당 20마이크로리터의 마스터 믹스와 5마이크로리터의 추가 부피를 96웰 저장 플레이트에 분취합니다.

용해물이 배양이 끝나면 얼음에서 MNase 소화 플레이트를 제거합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 MNnase one digestion master mix를 각 시료 행에 추가하고 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 행 사이의 팁을 변경합니다.

그런 다음 플레이트를 실온에서 정확히 5분 동안 배양합니다. 5분 후에 반응을 중지하려면 멀티채널 피펫을 사용하여 6마이크로리터의 250마이크로몰 EDTA를 각 샘플 행에 추가하고 위아래로 몇 번 혼합합니다. 행 간에 팁을 변경해야 합니다.

EDTA 첨가 후 피펫의 설정을 20마이크로리터로 전환하고 이전과 같이 10회 혼합하여 분해 반응이 완전히 중지되도록 합니다. 마지막으로, 6마이크로리터의 10X 용해 완충액을 MNase 분해된 샘플의 각 행에 추가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 접시를 플라스틱 씰로 덮고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.

항체 bead complex plate와 pre-clearing plate를 Text Protocol에 설명된 대로 준비합니다. 200회 G.그런 다음 항체 비드 복합체 플레이트를 플레이트 자석에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.

그런 다음 플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 사전 세척 반응 플레이트를 플레이트 자석에 놓고 비드가 분리되고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 상등액을 얼음 위에 보관된 항체 비드 복합 플레이트의 해당 웰로 조심스럽게 옮깁니다.

각 웰을 위아래로 15회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 알루미늄 플레이트 커버로 플레이트를 잘 밀봉하고 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 플레이트에 IP Reaction이라는 레이블을 다시 지정합니다.

둘째 날에는 가열 믹서를 섭씨 65도로 설정한 다음 얼음 위에 저염 세척 버퍼와 고염 세척 버퍼를 준비합니다. IP 반응판을 10회씩 200초 동안 빠르게 회전 G. IP 반응판을 판 자석에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 다채널 피펫을 사용하여 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.

플레이트 자석에서 플레이트를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 저염 세척 버퍼를 추가하고 비드를 완전히 재현탁시키기 위해 10회 동안 천천히 위아래로 혼합합니다. IP 반응판을 플레이트 자석에 다시 놓고 이전과 같이 상등액을 제거합니다.

그런 다음 접시를 다시 얼음 위에 놓고 세척 단계를 반복하여 총 두 번 세척합니다. 얼음에서 작업하면서 150마이크로리터의 고염 세척 버퍼를 IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 추가합니다. 비드를 완전히 재현탁하기 위해 위아래로 10회 피펫팅하여 샘플을 천천히 혼합합니다.

이전과 같이 상등액을 제거한 후 IP 반응 플레이트를 얼음 위에 놓고 그 옆에 새로운 96웰 플레이트를 예냉각합니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 150마이크로리터의 고염 세척 버퍼를 추가하고 비드를 완전히 재현탁하기 위해 위아래로 피펫팅하여 천천히 10회 혼합합니다. 재현탁 후, 샘플의 각 행을 사전 냉각된 새로운 96웰 플레이트의 해당 행으로 옮깁니다.

오래된 접시를 버리십시오. 새 IP 반응 플레이트를 플레이트 자석에 놓고 이전과 같이 상등액을 버립니다. 접시를 실온에 보관하십시오.

IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 ChIP 용리 완충액 30마이크로리터를 추가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 천천히 혼합합니다. 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. PCR 커버로 플레이트를 밀봉하고 섭씨 65도의 가열 믹서에서 1, 350RPM의 혼합 속도로 1 1/2시간 동안 배양합니다.

1 1/2시간 배양 후 IP 반응 플레이트를 섭씨 4도에서 1분 동안 200배 G로 회전시킵니다. 그런 다음 IP 반응 플레이트를 플레이트 자석에 놓고 용액이 제거될 때까지 기다립니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 비드를 방해하지 않고 각 줄에 대한 새로운 팁을 사용하여 20 마이크로 리터의 상등액을 새로운 96 웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.

플레이트에 IP Reaction이라는 라벨을 붙이고 실온에 보관하십시오. 단백질 분해를 진행한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리 구축을 진행합니다. 여기에 표시된 것은 라이브러리 생성 전에 최적, 과소 소화 및 과소화된 MNase 분해 염색질의 대표적인 결과입니다.

최적으로 분해된 프로파일은 단일 뉴클레오솜 단편 크기에 의해 지배되는 반면, 고차 뉴클레오솜 단편의 회수를 허용하기 위해 과도하게 소화되지 않습니다. 차선의 염색질 분해는 IP 물질에서 생성된 염기서열분석 라이브러리의 프로필에서도 명백합니다. qPCR에 의해 라이브러리를 검증하기 위해 입력 라이브러리에 대한 IP 라이브러리의 폴드 보강을 긍정적 및 부정적 목표에 대해 평가했습니다.

또한 게놈 브라우저에서 qPCR 평가 폴드 농축이 높은 라이브러리의 정렬된 판독을 검사하면 입력 라이브러리와 비교하여 시각적으로 감지 가능한 농축을 확인할 수 있습니다. 성공적인 뉴클레오솜 밀도 ChIP 염기서열분석 라이브러리에는 MACS2로 식별된 농축 피크 내에서 정렬된 판독의 상당 부분과 함께 높은 상관관계가 있는 복제가 포함됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 비변성 염색질 면역침전 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 염색질이 최적으로 분해되었는지 확인하고 관심 있는 항원결정기와 높은 친화력을 보이고 다른 항원결정기와의 교차 반응이 거의 또는 전혀 없는 항체만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 MNase 접근성의 전산 모델링을 수행하여 세포 집단 내의 이질성으로 인한 후성유전학적 서명과 같은 질문에 답할 수 있습니다.

이 방법은 뉴클레오솜 위치 및 국소 밀도의 조합 효과와 히스톤 소단위체의 번역 후 변형에 대한 통찰력을 제공하며 인간 또는 마우스, 일차 세포 및 동결 조직과 같은 모든 시스템에 적용할 수 있습니다.