Name: 네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 네이티브 ChIP-seq 라이브러리 구축 방법으로 MNase 가용성과 히스톤 변형을 결합하여 단일 뉴클레오솜 수준에서 후성유전학적 특징을 분석하고 염색질 역학을 이해하는 데 활용합니다.

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앨 러 배 마 건강 연구의 캐나다 학회에서 캐나다 대학원 장학금에 의해 지원 되었다. 이 작품은 게놈 브리티시 컬럼비아 및 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR-120589) 캐나다 Epigenetics, 환경 및 건강 연구 컨소시엄 이니셔티브의 한 부분으로에서 교부 금에 의해 그리고 테리 폭스 연구 연구소 프로그램에 의해 지원 되었다 프로젝트 부여 #TFF-122869 수소와 수소에 테리 폭스 연구소 새로운 탐정 수상 (부여 # 1039)

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<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+in+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone methylation in transcriptional control.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).</li>
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<li>Lorzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Density+ChIP-Seq+Identifies+Distinct+Chromatin+Modification+Signatures+Associated+with+MNase+Accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility.</a> Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).</li>
<li>Noll, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+micrococcal+nuclease+on+chromatin+and+the+location+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1.</a> J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome+wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding.</a> eLife. 4, 09225(2015).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+approaches+to+determining+nucleosome+occupancy+in+metazoans+using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq.</a> Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Mieczkowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNase+titration+reveals+differences+between+nucleosome+occupancy+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility.</a> Nat. Commun. 7, 11485(2016).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22JOVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> JOVE. (41), (2010).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Foxp3+target+genes+in+developing+and+mature+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells.</a> Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).</li>
<li>Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Binding+of+PARP-1+and+Histone+H1+at+Promoters+Specifies+Transcriptional+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes.</a> Science. 319 (5864), 819-821 (2008).</li>
<li>Mendenhall, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+editing+of+histone+modifications+at+endogenous+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers.</a> Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Chromatin 수정 및 transcriptional 규칙에서 위치 하는 nucleosome의 조합 성격을 감안할 때, 이러한 기능의 동시 측정 하는 방법 후 성적인 규정에 새로운 통찰력을 제공 것입니다. 여기에 제시 된 ndChIP-seq 프로토콜은 히스톤 수정 및 드문 1 차 셀9,10nucleosome 밀도 동시 심문 수 있도록 최적화 된 네이티브 칩 seq 프로토콜이입니다. ndChIP-seq 활용 chromatin의 효소 소화, 쌍 간 대규모 병렬 시퀀싱 및 가우스 혼합 배포 모델을 사용할 경우, 단일 nucleosome 수준 조사 히스톤 수정에 대 한 수 고는 deconvolution epigenomic 프로필 인구 내에서 성분에 의해 구동. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 이전 면역을 시 켰 던 조각 크기, 쌍 간 경계, ChromHMM10,24에 의해 정의 된 특정 chromatin 상태와 관련 된 읽기에 의해 결정의 독특한 분포를 보고 있다.
NdChIP-seq 도서관의 질 항 체 특이성, 감도, 최적의 MNase 소화 조건, 및는 chromatin의 품질 등 여러 요인에 따라 달라 집니다. 사용 하는 항 체의 특이성은 성공적인 ndChIP-seq 라이브러리 생성에서 결정적 이다. 이상적인 항 체 다른 epitopes와 작은 교차 반응성으로 관심의 피토 프에 대 한 높은 선호도 보여줍니다. 그것은 동등 하 게 자석 구슬 선택의 항 체에 대 한 높은 선호도 선택 하는 것이 중요입니다.
MNase 소화가이 프로토콜에 중요 하 고 시간 및 농도 민감한 반응입니다. 따라서, 여러 개의 샘플을 처리할 때 그것은 중요 한 시간의 상응 하는 금액에 대 한 각 반응에 대 한 알을 품는 (단계 2.2 참조). chromatin의 품질이 크게 ndChIP이 Fragmented chromatin 리드 낮은 신호 대 잡음 비와 최적의 MNase 소화 프로필 및 라이브러리에서 결과의 결과 초래 하는 또 다른 요인은. 낮은 기본 샘플 세포 생존 능력 또는 염색 질, 타락 한 같은 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직이이 프로토콜에 대 한 권장 하지 않습니다.
Chromatin 추출 하는 동안 그림의 추가 감소 (즉, 무작위) chromatin 조각화 및 보존의 무결성 히스톤 꼬리를 바라지 않는. 따라서, 그림 사용 하 여 세포의 용 해 버퍼와 그냥 이전 immunoprecipitation 버퍼에 추가 해야 합니다. Cytometry 통해 선택 셀 가능한 셀을 선택 하 고 확인 하는 동안 셀 셀 번호 추정의 정확성과 세포의 생존 능력을 증가 하는 낮은 흐름 율에 정렬 됩니다. 세포 세포의 용 해 버퍼에 직접 정렬 하지 마십시오. 칼 집 버퍼 세포의 용 해 버퍼를 희석 하 고 세포 막의 효과적인 permeabilization MNase를 방지. 셀 또는 유기 체의 종류에 따라 적정 MNase의 최적의 소화를 얻기 위해 필요할 수 있습니다.
ndChIP-seq 포유류 세포에 광범위 한 표시 및 입력에 대 한 좁은 표시 및 100 백만 쌍 읽기 (50 백만 조각) 50 백만 쌍 읽기 (25 백만 조각)의 최소 시퀀싱 깊이 필요합니다. 가우스 혼합물 분배 알고리즘 라이브러리가이 추천 아래 크게 깊이 시퀀스에 최적으로 수행 되지 않습니다. ndChIP-seq는 모노 또는 디 nucleosome 지배 발기인으로 모노 및 디 nucleosome 조각 길이 대 한 가중치 분포 값 간의 구분이 약간 발기인 분류 하지 것입니다. 따라서, 이러한 발기인 이후 분석에서 제거 되어야 합니다. 생물 복제 예측된 배포판에 대 한 자신감을 증가 하 고 MNase 소화 및 도서관 건설에서 기술 변화를 식별을 생성할 수 있습니다.
네이티브 칩 seq 프로토콜의 이전 반복, 달리 ndChIP-seq nucleosome 밀도, 통합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation를 이용 하 여 염색 질 구조와 히스톤 수정의 조합 효과 조사 하는 수단 제공 MNase 접근성, 히스톤 수정 측정에 의해 결정. NdChIP-seq의 응용 프로그램 기본 세포와 조직에 epigenetic 규제의 통합 특성에 새로운 통찰력을 제공 하 고 인구 내의 성분으로 인해 후 서명 식별을 허용.

진 핵 게놈 DNA1,2의 146의 기본적인 쌍에 의해 circumscribed 4 개의 히스톤 단백질 (예를 들어, H2A, H2B, H3, H4)의 두 개의 복사본으로 구성 하는 nucleosome 구조 반복을 통해 chromatin에 패키지 됩니다. Chromatin 개장 단지 유전자 발기인 경계 내 nucleosome 위치 제어 및 유전자 발현의 규칙에 참여 하는 전사 인자와 RNA 중 합 효소 기계3, DNA의 액세스 가능성을 변경 하 여 4.
nucleosome 내 히스톤의 아미노 맨끝 꼬리 acetylation, 메 틸 화, 인 산화, ubiquitylation, sumoylation, formylation, 및 특정 아미노산5 의 hydroxylation를 포함 하 여 다양 한 화학식 수정 대상이 되는 , 6 , 7 , 8. 위치 및 이러한 변경의 영향 전사7의 정품 인증을 허용 하는 분자 복합물의 염색 질 구조 및 제어 액세스 chromatin 상태 지시. 그 두 nucleosome 밀도 히스톤 수정 유전자 전사의 로컬 컨트롤에서 역할을 할 우리 네이티브 칩 접근 nucleosome 밀도 히스톤 수정9의 동시 측정을 가능 하 게 개발 10.
기본 칩 seq endonuclease micrococci nuclease 핵11,12, nucleosome13 위치를 지도에 활용 되는 속성 내에서 기본 상태에서 그대로 chromatin 소화 (MNase)의 활용 , 14 , 15. nucleosome 밀도 칩 seq (ndChIP-seq) 히스톤 수정10MNase 접근을 결합 하는 측정을 생성 하는 chromatin의 영역을 열려면 MNase의 특혜 접근의 속성 활용. ndChIP-seq는 히스톤 수정 드문 1 차 셀, 조직 및 배양된 세포에서의 프로 파일링 적합 합니다. 여기, 선물이 적합 조각 크기 게시물 immunoprecipitation, 쌍 간 경계, 읽기에 의해 결정을 통합 하는 앞에서 설명한 분석 프레임 작업10 시퀀스 데이터 집합 생성을 가능 하 게 상세한 프로토콜 동시에 히스톤 수정 측정 MNase 접근성 조사. 이전에, 10000 기본 인간 코드 혈액이 프로토콜의 응용 프로그램 파생 CD34+ 세포와 인간 배아 줄기 세포 염색 질 구조와 히스톤 수정이 내 간의 독특한 관계 셀 유형10 공개 . NdChIP-seq 단일 nucleosome 수준에서 세포 인구에서 epigenomic 기능을 공개 하 고 다른 유형의 서명으로 해결은 nucleosome 접근성 및 히스톤 수정 동시에 측정 하는 능력을 감안할 때, 그들의 구성 요소입니다. NdChIP-seq에 의해 다른 유형의 세포 인구의 탐험의 예는 어디 H3K4me3, 적극적인 마크와 H3K27me3, 억압 적인 마크는 현재10가 발기인의 조사입니다.

<table><tbody><tr><td>1M 트리스-HCl &ndash; pH 7.5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M 트리스-HCl &ndash; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>시그마</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시그마</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-데옥시콜레이트</td><td>시그마</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-중탄산염</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA V-bottom 96 웰 플레이트(AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P100 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P200 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P1000 피펫맨</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (가열 블록 믹서)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12채널 Pipit P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12채널 Pipit P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml LoBind 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml LoBind 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 플레이트 커버</td><td>엣지 Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>PCR 커버</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 플레이트 커버</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>용출 버퍼 (EB 버퍼)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 원심분리기&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure</td><td>water Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein G dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protein A dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor Cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Rotating platform</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 자석</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>돔형 12캡 스트립</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>튜브 자석(DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>튜브 자석(DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>V 모양 플라스틱 저장소</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>미니 Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>분석 스케일</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>빠른 결찰 반응 버퍼, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I, 대형(Klenow) 단편</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Klenow 단편(3'-5' 엑소)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td></td><td>NEB M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드 용액 혼합물, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>dATP 용액 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>빠른 T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 완충염 용액</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A3160702</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>세포 신호</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; super-paramagnetic 비즈</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

네이티브 chromatin immunoprecipitation nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

선물이 시퀀싱 (칩 seq) 실험 프로토콜 호환 가우스 혼합물 배급 기반 분석 방법론 (nucleosome 밀도 칩 seq; ndChIP-seq)의 생성을 가능 하 게 수정 된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 게놈 넓은 micrococcal nuclease (MNase) 접근의 결합 된 측량. Nucleosome 위치 및 로컬 밀도, 그리고 그들의 히스톤 subunits posttranslational 수정 로컬 전송 상태를 조절 하는 콘서트에서 행동. NdChIP-seq에 의해 생성 된 히스톤 수정 nucleosome 접근의 조합 측정 이러한 기능의 동시 심문 수 있습니다. NdChIP-seq 방법론 1 차 셀 기반된 칩 seq 프로토콜 cross-linking에 액세스할 수의 작은 숫자에 적용 됩니다. 함께 찍은, ndChIP-seq 드문 1 차 셀 인구 내에서 RNA 전사 조절 공유 메커니즘에 새로운 통찰력을 얻기 위해 로컬 nucleosome 밀도와 히스톤 수정 조합에서의 측정을 수 있습니다.

선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

본 절차의 전반적인 목적은 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 네이티브 크로마틴 면역침전 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이 방법은 단일 뉴클레오솜 수준에서 세포 집단의 후성유전학적 특징을 밝히고, 이질적인 크로마틴 시그니처를 연속적인 요소로 분해하는 것과 같은 후성유전학적 질문에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점는 개방형 크로마틴 영역에 우선적으로 접근하는 MNase의 특성을 활용하여 MNase 접근성과 히스톤 수식을 결합한 측정값을 생성하는 것입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 MNase 소화를 최적화하는 데 어려움을 겪습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 준비부터 이 프로토콜을 시작하십시오. 1일 차에는 각 세포 펠렛을 37°C 항온수조에서 10초 동안 해동합니다.그런 다음, 세포를 얼음으로 옮깁니다. 각 세포 펠릿에 얼음처럼 차가운 1X lysis buffer와 1X PIC를 즉시 첨가하여 최종 농도가 20 µL당 10,000 cells가 되도록 합니다. 기포가 생기지 않도록 피펫팅으로 10회 섞어줍니다.얼음 위에서 작업하며, 생성된 용해물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 20 µL씩 분주합니다. 플레이트를 플라스틱 씰로 덮은 후 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 플레이트에 MNase라고 라벨을 붙이고, 웰 정보를 템플릿 키에 기록합니다.20분간의 용해가 완료되기 직전에, MNase one 효소를 MNase one 희석 버퍼로 희석하여 최종 농도가 20 units/µL가 되도록 만든 후 얼음 위에 보관하십시오. 얼음 위에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MNase one 소화 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음, 샘플의 각 행당 20 µL의 마스터 믹스를 분주하고, 96-웰 리저버 플레이트에 5 µL의 여유분을 추가로 분주하십시오.용해물(lysate)의 배양이 끝나면, 얼음에서 MNase 소화 플레이트를 꺼냅니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 샘플 열에 MNnase one 소화 마스터 믹스 20 µL를 추가하고, 피펫팅을 10회 반복하여 혼합합니다. 각 열 사이에는 팁을 교체하십시오.그 후, 플레이트를 실온에서 정확히 5분 동안 배양합니다. 5분 후 반응을 중단시키기 위해, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 시료 행에 250 µM EDTA 6 µL를 첨가하고 위아래로 몇 번 섞어줍니다. 행을 바꿀 때마다 반드시 팁을 교체하십시오.EDTA를 첨가한 후, 피펫 설정을 20 µL로 변경하고 이전과 동일하게 10회 혼합하여 소화 반응이 완전히 중단되도록 합니다. 마지막으로, MNase로 소화시킨 각 샘플 열에 10X lysis buffer 6 µL를 첨가하고 피펫팅을 10회 반복하여 잘 혼합합니다. 플레이트를 플라스틱 씰로 덮고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 항체 비드 복합체 플레이트와 사전 제거(pre-clearing) 플레이트를 준비합니다. 두 플레이트를 200 ×g에서 10초 동안 원심분리하여 빠르게 스핀합니다. 그런 다음, 항체 비드 복합체 플레이트를 플레이트 자석 위에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드가 흐트러지지 않도록 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.그 다음, 플레이트를 플레이트 마그넷에서 제거하고 얼음 위에 보관하십시오. 전처리 세척(pre-clearing) 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 놓고, 비드가 분리되어 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 비드가 흐트러지지 않도록 주의하며, 피펫을 사용하여 상층액을 얼음 위에 보관된 항체-비드 복합체 플레이트의 해당 웰로 조심스럽게 옮깁니다.피펫팅으로 15회 부드럽게 위아래로 섞어 각 웰을 혼합합니다. 알루미늄 플레이트 커버로 플레이트를 잘 밀봉하고, 회전 플랫폼 위에서 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트에 IP Reaction이라고 다시 라벨을 붙입니다.둘째 날, 가열 믹서를 65 °C로 설정한 다음, 저염 세척 버퍼와 고염 세척 버퍼를 얼음 위에서 준비합니다. IP 반응 플레이트를 200 ×g에서 10초 동안 빠르게 원심 분리합니다. IP 반응 플레이트를 플레이트 자석 위에 놓고 용액이 투명해질 때까지 15초 동안 기다립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.플레이트를 플레이트 마그넷에서 분리하여 얼음 위에 놓습니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 얼음처럼 차가운 저염 세척 버퍼 150 µL를 첨가하고, 비드를 완전히 재부유시키기 위해 천천히 10회 위아래로 혼합합니다. IP 반응 플레이트를 다시 플레이트 마그넷 위에 놓고 이전과 동일하게 상층액을 제거합니다.그 다음, 플레이트를 다시 얼음에 올려두고 세척 단계를 총 2회 반복합니다. 얼음 위에서 작업하며, IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 150 µL의 고염 세척 버퍼를 추가합니다. 파이펫으로 10회 천천히 흡입 및 배출하여 샘플을 섞어 비드를 완전히 재현탁합니다.이전과 동일하게 상층액을 제거한 후, IP 반응 플레이트를 얼음 위에 두고 그 옆에 새로운 96-웰 플레이트를 미리 냉각시켜 둡니다. IP 반응 플레이트의 각 샘플 열에 150 µL의 고염 세척 버퍼를 첨가하고, 피펫팅으로 10회 천천히 섞어 비즈를 완전히 재현탁시킵니다. 재현탁 후, 각 샘플 열을 미리 냉각된 새 96-웰 플레이트의 해당 열로 옮깁니다.사용했던 플레이트를 폐기하십시오. 새로운 IP 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 놓고 이전과 동일하게 상층액을 제거하십시오. 플레이트를 실온에서 보관하십시오.IP 반응 플레이트의 각 샘플 행에 ChIP 용출 버퍼 30 µL를 첨가하고, 피펫팅을 10회 반복하여 천천히 혼합합니다. 이때 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 PCR 커버로 밀봉하고, 가열 믹서에서 65 °C의 온도로 믹싱 속도 1,350 RPM으로 1시간 30분 동안 배양합니다.1시간 30분 동안 배양한 후, IP 반응 플레이트를 4°C에서 200 ×g로 1분간 원심 분리합니다. 그 다음, IP 반응 플레이트를 플레이트 마그넷 위에 올려놓고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 비드를 건드리지 않도록 주의하며, 각 행마다 새 팁을 사용하여 상층액 20 µL를 새로운 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.플레이트에 IP Reaction이라고 표시하고 상온에서 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 소화와 이에 이은 라이브러리 구축 단계를 진행하십시오. 여기에는 라이브러리 생성 전, 최적 상태, 미흡하게 소화된 상태 및 과하게 소화된 MNase 소화 크로마틴의 대표적인 결과가 나타나 있습니다.최적으로 소화된 프로파일은 단일 뉴클레오솜 단편 크기가 지배적이며, 고차 뉴클레오솜 단편의 회수가 가능하도록 과도하게 소화되지 않은 상태입니다. 염색질의 미흡한 소화는 IP 물질로부터 생성된 시퀀싱 라이브러리의 프로파일에서도 분명하게 나타납니다. qPCR을 통해 라이브러리를 검증하기 위해, 양성 및 음성 타겟에 대해 입력 라이브러리 대비 IP 라이브러리의 농축 배수를 평가하였습니다.또한, qPCR로 평가한 fold enrichment 값이 높은 라이브러리의 정렬된 리드(aligned reads)를 게놈 브라우저에서 확인하면, 입력(input) 라이브러리에 비해 시각적으로 감지 가능한 농축(enrichment)이 나타나야 합니다. 성공적인 뉴클레오솜 밀도 ChIP-sequencing 라이브러리는 높은 상관관계를 가진 반복 시료를 포함하며, 정렬된 리드의 상당 부분이 MACS2로 식별된 농축 피크 내에 존재하게 됩니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 만에 완료할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 뉴클레오솜 밀도 분석을 위한 네이티브 염색질 면역침전 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 염색질이 최적으로 소화되었는지 확인하고, 관심 있는 에피토프와 높은 친화력을 가지며 다른 에피토프와는 교차 반응성이 거의 없거나 없는 항체만을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 세포 집단 내의 이질성으로 인한 후성유전학적 특징과 같은 질문에 답하기 위해 MNase 접근성에 대한 계산 모델링을 수행할 수 있습니다.이 방법은 뉴클레오솜 위치와 국소 밀도의 조합 효과뿐만 아니라 히스톤 하위 단위의 번역 후 수정을 파악할 수 있게 해주며, 인간 또는 생쥐, 일차 세포 및 냉동 조직과 같은 모든 시스템에 적용 가능합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오에서는 단백질 결합 염색질 단편의 선택적 면역침전을 통해 희소돌기아교세포 전구체 세포의 게놈 DNA의 특정 영역에서 단백질 결합 부위를 식별하는 염색질 면역침전 기술을 보여줍니다. 이 방법은 유전자 조절에 관여하는 전사 인자를 포함한 여러 조절 단백질의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

게놈 DNA의 표적 단백질 결합 부위를 확인하기 위한 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation)

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

생체 내 단백질-DNA 상호 작용 매핑 방법은 게놈 연구의 모든 측면에서 중요해지고 있지만 힘들고 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸립니다. 여기에서는 제한된 양의 세포와의 생체 내 단백질-DNA 상호 작용을 매핑하기 위해 염색질 면역침전을 자동화하는 상업적으로 이용 가능한 로봇 액체 처리 시스템이 제시됩니다.

칩 서열 실험을 자동화하면 10,000 헬라 세포에 성적인 프로필을 생성합니다

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

이 논문은 ChIP 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 특정 히스톤 수정(H3K27ac)과 관련된 DNA 영역의 반자동 마이크로스케일드 ChIP-Seq 프로토콜을 설명하고 태그를 사용하여 라이브러리 준비를 수행합니다. 이 절차는 품질 및 수량 목적에 대한 제어 평가를 포함하고 다른 히스톤 수정 또는 전사 요인에 채택 될 수있다.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

배우세요 네이티브 ChIP-seq 라이브러리 구축 방법으로 MNase 가용성과 히스톤 변형을 결합하여 단일 뉴클레오솜 수준에서 후성유전학적 특징을 분석하고 염색질 역학을 이해하는 데 활용합니다.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

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