Sialoglycan Microarray Assay를 사용하여 Human Sera에서 Anti-Neu5Gc IgG 프로파일 링

sialoglycan 마이크로어레이 분석의 전반적인 목표는 다양한 sialoglycan 컬렉션에 대해 고처리량 방식으로 인간 혈청에서 Anti-Neu5Gc IgG를 평가하는 것입니다. 이 방법은 Anti-Neu5Gc 항체가 암, 심장 질환 및 이종 이식을 포함한 다양한 인간 질병과 어떻게 관련되어 있는지와 같은 당면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수많은 시알로글리칸 항원에 대한 Anti-Neu5Gc 항체의 고처리량 프로파일링이 가능하다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 석사 과정 학생인 Sharon Yehuda입니다. 어레이 제작 및 레이아웃에 대한 신중하고 상세한 계획은 성공을 보장하는 데 중요합니다. 이 프로세스는 텍스트 프로토콜 및 추가 정보에 자세히 설명되어 있습니다.

마이크로 원심분리기 튜브에서 각 글라이칸을 총 100마이크로리터의 글라이칸 인쇄 버퍼에 100마이크로몰로 희석합니다. 다음으로, 마커 버퍼를 사용하여 형광 염료를 함유한 1차 아민을 밀리미터당 1밀리그램으로 준비합니다. 그런 다음 총 부피 1밀리리터에서 밀리리터당 1마이크로그램으로 희석합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 human IgG 표준 곡선 희석액을 준비합니다. 얼음 위에 384웰 플레이트를 놓습니다. 전자 멀티 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 있는 플레이트 레이아웃에 따라 각 글라이칸, 마커 및 스타다드 곡선 IgG의 7마이크로리터를 분취합니다.

파라필름으로 접시를 덮고 250배 g 및 섭씨 12도에서 2분 동안 회전합니다. 인쇄는 습도가 60-70%인 먼지가 없는 곳에서 수행해야 합니다.여기에서 모든 단계는 보호를 위해 적절한 장갑과 의복이 있는 클린룸에서 수행됩니다. 나노 프린터 기기와 가습기를 켭니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 인쇄기를 프로그래밍한 후 분주된 샘플이 있는 384웰 플레이트를 어레이 데크의 해당 위치에 배치하고 파라필름 덮개를 제거합니다. 이 시점에서 인쇄를 시작합니다. 알코올 용제 저항성 마킹 펜으로 슬라이드에 번호를 매기고 어두운 곳에서 진공 밀봉 상자에 보관하십시오.

어레이를 처리하려면 먼저 진공 밀봉 상자에서 슬라이드를 제거하고 어레이가 위를 향하도록 하여 화학 후드에 5분 동안 넣어 여분의 액체를 증발시킵니다. 다음으로, 슬라이드를 탈이온수로 채워진 염색 튜브에 넣어 수분을 공급합니다. 튜브를 호일로 덮고 실온에서 느리고 부드럽게 흔들면서 5분 동안 배양합니다.

슬라이드의 반응성 에폭시기 그룹을 차단하려면 예열된 에탄올아민 차단 용액으로 채워진 50ml 염색 튜브에 슬라이드를 담그십시오. 튜브를 호일로 덮고 실온에서 천천히 부드럽게 흔들면서 30분 동안 배양합니다. 에탄올아민 차단 용액을 적절한 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오.

그런 다음 슬라이드를 섭씨 50도의 탈이온수로 채워진 깨끗한 새 염색 튜브에 넣습니다. 튜브를 호일로 덮고 실온에서 천천히 부드럽게 흔들면서 10분 동안 배양합니다. 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮깁니다.

장치를 스윙 플레이트 홀더에 놓고 슬라이드를 원심분리하여 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 16웰 칸막이에 놓습니다. 웰을 미리 적신 후 멀티 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 PBST를 슬라이드 웰로 분취합니다.

그런 다음 뚜껑이 있고 습한 방에 넣고 5분 동안 흔든다. 깨끗한 종이 타월을 가볍게 두드려 PBST를 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBS-Ovalbumine 차단 완충액을 각 웰에 분취합니다.

슬라이드를 습한 챔버에 놓고 실온에서 부드럽게 흔들어 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBS-OVA 차단 버퍼에 희석된 1차 검출을 준비합니다. PBS-OVA 차단 버퍼를 슬라이드에서 튕기고 웰당 200마이크로리터의 1차 항체를 추가합니다.

습한 챔버에서 슬라이드를 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드에서 기본 감지를 튕기고 PBST로 세 번 씻습니다. PBST로 마지막으로 세척하기 전에 습한 챔버에서 PBST로 슬라이드를 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 PBS로 한 번 씻으십시오. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBS에서 2차 항체를 준비합니다. 슬라이드에서 PBS를 튕기고 200마이크로리터의 2차 항체를 추가합니다.

슬라이드에서 2차 항체를 튕겨내고 이전과 같이 PBST로 4회 세척합니다. 프레임을 조심스럽게 제거한 다음 PBS로 채워진 50ml 슬라이드 염색 튜브에 슬라이드를 넣고 5분 동안 흔듭니다. 다음으로, 두 개의 슬라이드 염색 수조에 탈이온수를 채웁니다.

슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 슬라이드를 첫 번째 수조에 담그십시오. 슬라이드를 빠르게 10번 담그십시오. 그런 다음 슬라이드를 두 번째 수조로 옮기고 10회 더 담그십시오.

담근 후 실온에서 10분 동안 흔들면서 슬라이드를 배양합니다. 배양 후에는 물을 버리고 슬라이드를 유리 염색 홀더에 옮깁니다. 유리 염색 홀더를 스윙 플레이트 홀더에 놓고 슬라이드를 원심 분리하여 건조시킵니다.

스캐너 도어를 열고 어레이가 아래를 향하도록 슬라이드를 내부에 놓습니다. 이 시점에서 스캔을 시작합니다. 스캔한 슬라이드를 TIFF 파일로 저장합니다.

분석을 위해 슬라이드를 준비하려면 "배열 목록 로드"를 선택하고 슬라이드의 각 블록에 있는 배열을 매핑하는 적절한 GAL 파일을 업로드합니다. 슬라이드는 각 블록에 하나씩 16개의 서로 다른 1차 감지 부분으로 개발되었습니다. 식물 Lectin SNA는 a2-6 결합 시알산과 결합합니다.

식물 Lectin MALII는 a2-3 연결된 시알산과 결합합니다. Polyclonal Anti-Neu5Gc IgY는 Neu5Gc 함유 시알로글리칸과 결합하지만 Neu5Ac 함유 시알로글리칸에는 결합하지 않습니다. Anti-Neu5Gc IgG를 프로파일링하기 위해 건강한 인간 기증자의 혈청 12개를 인쇄된 시알로글리칸 마이크로어레이에서 분석하고 마이크로리터당 나노그램으로 정규화된 형광 표지된 항인간 IgG를 사용하여 개발했습니다.

테스트된 모든 인간 혈청에는 다양한 수준의 Anti-Neu5Gc IgG가 포함되어 있었으며, 일치하는 Neu5Ac-함유 시알로글리칸 쌍은 거의 인식되지 않았습니다. 또한, Anti-Neu5Gc IgG 인식 패턴은 강도와 다양성 수준 모두에서 이 12가지 혈청 간에 매우 다양합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 글라이칸 마이크로어레이 시스템을 사용하여 다양한 인간 샘플에서 Anti-Neu5Gc 항체를 고처리량 방식으로 프로파일링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.