July 19th, 2017
이 프로토콜은 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 음성 염색 바이러스 샘플을 제공합니다. 여기에는 투과 전자 현미경 그리드를 보호하고 생체 내에서 난기류 환경에서 사용자가보다 쉽게 취급 할 수있게 해주는 혁신적인 가공 캡슐의 사용이 포함됩니다.
이 방법의 전반적인 목표는 생물 봉쇄 내 바이러스 샘플에 대해 간단하고 효과적인 TEM 음성 염색 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 조사 중인 바이러스의 형태와 구조에 대한 바이러스학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생물 봉쇄 환경 내에서 전자 현미경 그리드를 쉽고 효과적으로 처리할 수 있다는 것입니다.
이 기술은 모든 환경에서 바이러스 샘플에 쉽게 적용할 수 있기 때문에 알려지지 않은 바이러스의 TEM 진단의 일부로 사용됩니다. 우리는 주로 바이러스 TEM 연구를 돕기 위해 이 방법을 사용했지만 훨씬 더 광범위하게 응용 분야를 가지고 있으며 대부분의 나노 입자의 EM 조사에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 캡슐에서 적재 및 하역할 때 TEM 그리드가 손상되지 않도록 하기 위해 약간의 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 방법에 대한 아이디어는 생물 봉쇄에서 작은 EM 그리드를 처리하는 데 문제가 있었을 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시작하려면 바이러스 및 탄소 코팅된 TEM 구리 그리드를 준비하거나 구입하십시오. 코팅된 TEM 그리드를 캡슐에 삽입합니다.
다음으로, 장전된 캡슐을 다른 공급품 및 시약과 함께 생물 격리로 옮깁니다. 시작하려면 캡슐을 피펫에 부착하십시오. 캡슐 내로 40마이크로리터의 바이러스 팽창을 흡인합니다.
그리드가 10분 동안 수평을 향하도록 피펫을 옆으로 눕힙니다. 다음으로, 피펫을 집어 들고 바이러스 용액을 폐기물 격납고에 분배합니다. 40마이크로리터의 2%글루타르알데히드 고정액을 캡슐에 흡인합니다.
피펫을 20분 동안 옆으로 눕힙니다. 그런 다음 고정액을 배출하고 40마이크로리터의 탈이온수를 캡슐로 흡입하여 고정액을 씻어냅니다. 이 세척을 세 번 반복합니다.
다음으로, 40 마이크로 리터의 1 % 우라닐 아세테이트 또는 1 % 포타슘 포스 포 텅스텐 산을 캡슐에 흡입합니다. 캡슐을 30초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 피펫에서 캡슐을 제거합니다.
여과지 조각을 그리드 가장자리에 대고 닦아내십시오. 여과지를 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 다음으로, 여과지를 1% 사산화오스뮴 용액에 담그십시오.
뚜껑을 연 상태로 캡슐을 튜브에 넣습니다. 오스뮴 테트록사이드 증기가 완전히 침투할 수 있도록 튜브를 1시간 동안 밀봉합니다. 그런 다음 튜브의 오염을 제거하고 생물 봉쇄에서 BSL-2 EM 시설로 옮깁니다.
원심분리기 튜브에서 캡슐을 제거한 다음 피펫에 놓습니다. 40마이크로리터의 탈이온수를 캡슐에 흡입한 다음 물을 폐기물 용기에 분배합니다. 이 물 세척을 세 번 반복하십시오.
그런 다음 피펫에서 캡슐을 제거합니다. 여과지를 사용하여 그리드를 닦아내십시오. 그리드를 자연 건조시킨 다음 TEM 이미징을 수행할 준비가 될 때까지 그리드 상자에 보관합니다.
시작하려면 바이러스 현탁액을 동일한 부피의 4%글루타르알데히드와 혼합하여 2%글루타르알데히드의 최종 농도를 얻습니다. 고정제를 사용하여 최소 24시간 동안 바이러스를 비활성화합니다. 튜브의 오염을 제거하고 BLS-2 EM 시설로 옮깁니다.
그런 다음 그리드가 로드된 캡처를 피펫에 부착합니다. 혼합물을 캡슐에 흡입하십시오. 그리드가 수평을 향하도록 피펫을 10분 동안 옆으로 눕힙니다.
그런 다음 피펫을 들고 바이러스 혼합물을 폐기물 용기로 배출합니다. 40마이크로리터의 탈이온수를 캡슐에 흡입한 다음 물을 폐기물 용기에 버립니다. 이 세척을 세 번 반복합니다.
그런 다음 40마이크로리터의 1% QA 또는 1%PTA를 캡슐에 30초 동안 흡입합니다. 피펫에서 캡슐을 제거합니다. 여과지를 사용하여 그리드를 닦아내십시오.
그런 다음 그리드를 자연 건조시킵니다. 이 연구에서 자이르 에볼라 바이러스 샘플은 수동 액적 방법과 캡슐 방법을 모두 사용하여 음성 염색을 거칩니다. 이러한 방법에서 생성된 TEM 이미지는 둘 다 변리 중앙의 뉴클레오캡시드 구조와 표면의 가시적인 당단백질과 함께 명확하게 정의된 세부 사항을 보여줍니다.
따라서 캡슐 방법은 수동 액적 방법으로 생성된 것과 유사한 품질의 TEM 이미지를 생성할 수 있습니다. 다음으로, Chikungunya 바이러스를 사용하여 다양한 샘플 불활성화 방법을 비교합니다. 시료 불활성화는 2% 글루타르알데히드를 20분 동안 사용한 후 1% 오스뮴 테트록사이드에 1시간 동안 노출시켜 신속하게 수행하거나 2% 글루타르알데히드를 24시간 동안 사용하여 하룻밤 사이에 달성됩니다.
보시다시피, 사산화오스뮴이 없는 불활성화 과정이 길면 더 많은 초구조적 세부 사항을 볼 수 있습니다. 그런 다음 캡슐 방법을 활용하여 알데히드 고정 바이러스 유사 입자를 사용하여 두 가지 염색을 비교했습니다. 우라닐 아세테이트와 포스포텅스텐 산은 모두 명확하게 정의된 경계와 눈에 보이는 당단백질을 통해 고품질 결과를 나타냅니다.
일단 숙달되면 이 기술은 샘플 수에 따라 약 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험 목표에 맞는 적절한 정착성 및 염색 시약을 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 바이러스 농도를 계산하여 추가 질문에 답하기 위해 입자 계수와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
이 기술은 바이러스학자들이 특히 BLS-3 및 4 레벨 바이러스에서 바이러스 형태학을 탐색하고 정보를 더 쉽게 구조화할 수 있는 방법을 개선합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생물 봉쇄 내에서 negative staining에 대한 TEM 그리드를 쉽게 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 알데히드, 사산화오스뮴 및 우라닐 아세테이트로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비 및 화학 흄 후드와 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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이 프로토콜은 바이오컨테인먼트 내 바이러스 샘플에 대한 간단하고 효과적인 음성 염색 절차를 제공합니다. 여기에는 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 전자 현미경 격자의 처리를 향상시키는 혁신적인 처리 캡슐이 포함됩니다.
Handling electron microscopy grids in high-containment laboratories presents significant operational challenges due to environmental turbulence and restricted dexterity from personal protective equipment. This capsule-based method improves sample preparation reliability and throughput for virology discovery workflows in BSL-3 and BSL-4 settings. By minimizing manual grid manipulation, the technique supports consistent ultrastructural characterization of viral targets, enabling more confident go/no-go decisions in early-stage antiviral target validation.
The method integrates into the discovery continuum by enabling reliable negative staining of viral samples after inactivation and prior to imaging, supporting hypothesis testing and lead confirmation stages.