Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

이 방법의 전반적인 목표는 생물안전 격리 구역 내의 바이러스 시료를 위한 간단하고 효과적인 TEM 음성 염색 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 조사 중인 바이러스의 형태와 구조에 관한 바이러스학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생물안전 격리 환경 내에서 전자현미경 그리드를 쉽고 효과적으로 취급할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 모든 환경의 바이러스 시료에 쉽게 적용할 수 있으므로, 미지의 바이러스에 대한 TEM 진단의 일부로서 유용합니다. 주로 바이러스 TEM 연구를 돕기 위해 이 방법을 사용해 왔으나, 적용 범위가 훨씬 넓어 대부분의 나노입자에 대한 EM 조사에도 사용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 캡슐에 그리드를 넣고 뺄 때 TEM 그리드가 손상되지 않도록 하는 데 어느 정도 숙련도가 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.

우리는 생물안전 격리 구역에서 작은 EM 그리드를 다루는 데 어려움을 겪으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다.

이 절차를 시작하려면, Formvar 및 탄소 코팅된 TEM 구리 그리드를 준비하거나 구매하십시오. 코팅된 TEM 그리드를 캡슐에 삽입합니다. 그다음, 충전된 캡슐을 다른 소모품 및 시약과 함께 생물안전구역(biocontainment)으로 옮깁니다. 먼저, 캡슐을 피펫에 부착합니다. 바이러스 현탁액 40 µL를 캡슐 안으로 흡입합니다. 그리드가 수평이 되도록 피펫을 옆으로 눕혀 10분 동안 둡니다. 그다음, 피펫을 들어 올려 바이러스 용액을 폐기물 컨테이너에 배출합니다. 2% glutaraldehyde 고정액 40 µL를 캡슐 안으로 흡입합니다. 피펫을 옆으로 눕혀 20분 동안 둡니다. 이후, 고정액을 배출하고 탈이온수 40 µL를 캡슐 안으로 흡입하여 고정액을 씻어냅니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.

다음으로, 1% uranyl acetate 또는 1% potassium phosphotungstic acid 40 µL를 캡슐 속으로 흡입합니다. 캡슐을 30초 동안 그대로 둡니다. 그 후, 피펫에서 캡슐을 제거합니다.

필터 페이퍼 조각을 그리드 가장자리에 대어 습기를 제거합니다. 필터 페이퍼를 15 milliliters 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 필터 페이퍼를 1% osmium tetroxide 용액에 담급니다.

뚜껑을 연 상태의 캡슐을 튜브 안에 넣습니다. 오스뮴 테트록사이드 증기가 완전히 침투할 수 있도록 튜브를 밀봉하여 1시간 동안 둡니다. 그 후, 튜브를 오염 제거하고 생물안전 격리 구역에서 BSL-2 EM 시설로 옮깁니다.

원심분리 튜브에서 캡슐을 꺼내 피펫 위에 올립니다. 탈이온수를 40 µL 흡입하여 캡슐에 넣은 후, 폐기물 용기에 배출합니다. 이 세척 과정을 세 번 반복합니다.

다음으로, 피펫에서 캡슐을 제거합니다. 거름종이를 사용하여 그리드를 닦아 건조시킵니다. 그리드를 공기 중에 건조시킨 후, TEM 이미징을 수행할 때까지 그리드 박스에 보관합니다.

먼저, 바이러스 현탁액에 동일한 부피의 4% glutaraldehyde를 혼합하여 glutaraldehyde의 최종 농도가 2%가 되도록 합니다. 고정액을 사용하여 바이러스를 최소 24시간 동안 불활성화합니다. 튜브를 오염 제거한 후 BLS-2 EM 시설로 옮깁니다. 그 후, 그리드가 장착된 캡처 장치를 피펫에 부착합니다. 혼합물을 캡슐 안으로 흡입합니다. 그리드가 수평이 되도록 피펫을 옆으로 눕혀 10분 동안 둡니다.

다음으로, 피펫을 들어 바이러스 혼합물을 폐기물 용기에 배출합니다. 탈이온수 40 µL를 캡슐 내로 흡입한 후 폐기물 용기에 버립니다. 이 세척 과정을 3회 반복합니다.

그 다음, 1% UA 또는 1% PTA 40 µL를 캡슐에 넣고 30초 동안 유지합니다. 캡슐을 피펫에서 제거합니다. 거름종이를 사용하여 그리드의 수분을 닦아 건조시킵니다.

그 다음, 그리드를 공기 중에서 건조시킵니다.

본 연구에서는 수동 방울법(manual droplet method)과 캡슐법(capsule method)을 모두 사용하여 Zaire Ebola virus 시료의 음성 염색을 진행합니다. 두 방법으로 생성된 TEM 이미지는 모두 명확한 세부 구조를 보여주며, 비리온 중심부의 뉴클레오캡시드 구조와 표면의 당단백질이 관찰됩니다. 따라서 캡슐법은 수동 방울법으로 생성된 것과 유사한 품질의 TEM 이미지를 제작할 수 있습니다. 다음으로, Chikungunya virus를 사용하여 서로 다른 시료 불활성화 방법을 비교합니다. 시료 불활성화는 2% glutaraldehyde로 20분간 처리한 후 1% osmium tetroxide에 1시간 동안 노출시키는 급속 방법 또는 2% glutaraldehyde를 사용하여 24시간 동안 처리하는 하룻밤 방법으로 수행됩니다. 확인 결과, osmium tetroxide를 사용하지 않고 불활성화 과정을 더 길게 유지했을 때 초미세 구조의 세부 사항이 더 많이 관찰됨을 알 수 있습니다.

그 다음, 캡슐 방법을 이용하여 알데히드 고정 바이러스 유사 입자를 사용하여 두 가지 염색법을 비교하였습니다. Uranyl acetate와 phosphotungstic acid 모두 경계가 뚜렷하고 당단백질이 관찰되는 고품질의 결과를 보여주었습니다.

이 기술에 숙달되면 샘플 수에 따라 약 1시간 30분 정도 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 실험 목적에 맞는 적절한 고정액과 염색 시약을 선택하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 입자 계수와 같은 다른 방법을 수행하여 바이러스 농도를 계산함으로써 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 기술은 바이러스학자가 바이러스의 형태 및 구조 정보를 더욱 쉽게 탐구할 수 있는 방법을 개선하며, 특히 BLS-3 및 4 수준의 바이러스에서 유용합니다. 이 영상을 시청한 후에는 생물안전 격리 구역 내에서 음성 염색을 위해 TEM 그리드를 쉽게 다루는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 알데하이드, 오스뮴 사산화물 및 우라닐 아세테이트를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장구 착용 및 화학 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.