Name: 절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 쥐 밸브 중간 세포(VIC) 분리 및 배양 방법을 통해 관상동맥 밸브 석회화 질환(CAVD)의 세포적 기전을 연구하세요. 이 기법은 심혈관 질환 치료 전략 개발에 중요한 생리학적 체외 모델을 제공합니다.

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CD31 항 체 사용 박사 카 렌 탄, 에든버러 대학에서에서 관대 한 선물 했다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC)는 연구소 전략적 프로그램 그랜트 (BB/J004316/1;의 형태로 자금에 의해 지원 되었다 BBS/E/D/20221657) (누구와 CF)는 연구소 경력 경로 친목 BB/F023928/1 (누구), 그리고 재학 BBSRC 경우 재학 BB/K011618/1 (LC)를 통해 자금.

모든 동물 실험 위원회 사용자는로 슬 린 연구소의 동물에 의해 승인 했다 및 동물 치료 동물의 사용에 대 한 홈 오피스 (영국) 지침에 따라 유지 되었다. 아래에 설명 된 프로토콜에 대 한 5 주 오래 된, 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 되었다.
1. 시 약 조리법
<ol><li>Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)과 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12)를 사용 하 여 문화 매체 를 준비 합니다. 10% 소독 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1 %gentamicin 추가 합니다.</li>
	<li>석 회화 매체 문화 매체와 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이 사용 하 여 준비 합니다.<ol>
<li>555 mg CaCl2 개 무게와 1m CaCl2의 5 mL을 증류수 5 mL 물에 용 해 하 여 1 M 칼슘 염화 물 (CaCl2)를 준비 합니다. 솔루션 솔루션 소독 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링.</li>
		<li>710 mg 무수 염기 나트륨 인산 염 (Na2HPO4)과 각각 별도로 증류수 5 mL에 용 해의 무수 이수소 나트륨 인산 염 (NaH2포4), 600 밀리 그램 무게 1 M 나트륨 인산 염 을 준비합니다 물입니다. 솔루션을 소독 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 나2HPO4 의 3,870 µ L와 1130 µ L NaH2포4, 및 필터를 결합 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼를 세척 포함 하는 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 및 1 %gentamicin 준비.</li>
</ol>2입니다. 절 개 후드의 준비
<ol><li>모든 해 통풍 후드, 이전 샘플 및 시 약의 무 균을 보장 하기 위해 70% 에탄올으로 소독을 실시 합니다.</li>
	<li>압력가 마로 소독 그들 뒤에 70% 에탄올 이전 사용에 들어 있는 비 커에 도구 팁을 immersing에 의해 해 부 도구를 소독.</li>
	<li>워시 버퍼를 포함 하는 비 커를 준비 하 고 해 부 도구 동물 또는 조직 접촉으로 오기 전에 워시 버퍼에 담근 다. 모든 시간에 얼음에 워시 버퍼를 유지.</li>
</ol>3입니다. 기본 쥐 피해자의 추출
참고: 아래에서 설명 하는 프로토콜에 대 한 5 주 오래 된, 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 되었다.
<ol><li>쥐를 추려 (~ 100 g) 영국 본사 지침에 따라 자 궁 경부 전위에 의해.</li>
	<li>각 쥐의 심장 밖으로 해 부하는 동물 부정사 유리 해 부 보드에 놓고 70% 에탄올을 분사 하 여 피부를 소독 합니다.</li>
	<li>해 부가 위, 복 부 구멍을 노출 하 고 흉 곽과 폐, 심장 폭로 조심 스럽게 제거의 도움으로 쥐의 중간에 4 cm 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>샤 프의 쌍을 가진 심 혼을 제거 하 고 곡선된가 위, 봄은 쥐의 모든 총 해 완료 될 때까지 해 부 심장 얼음 차가운 워시 버퍼에 저장.</li>
	<li>마이크로 해 부 각 심장, 페 트리 접시에 후자 전송 워시 버퍼에 덮여. 오름차순 대동맥 및 대동맥 루트 작은 지역으로 남아 있을 봄 연속가 위 (6 m m 블레이드)와 심장 근육을 잘라.</li>
	<li>동일을 사용 하 여 직선 위 (6 m m 블레이드) 봄, 신중 하 게 자르면 오름차순 대동맥 좌 심 실 쪽으로 고 노출 대동맥 밸브 전단지.</li>
	<li>신선 하 고, 멸 균 페 트리 접시에 전송 열린된 대동맥 HBSS 가득합니다. 대동맥 밸브 전단지, 욕실이 형 capsulotomy 마이크로-가 위 (3 m m 블레이드)와 대동맥의 기지에서 그들의 독특한 'U' 모양으로 표시를 해 부.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브 모든 해 완료 될 때까지 얼음 차가운 워시 버퍼의 1 mL에 모든 전단지를 저장 합니다.</li>
	<li>일단 모든 전단지 수확 되어, 워시 버퍼를 제거 하 4 ° C에서 1 분 x 100g에 그들을 원심.</li>
	<li>살 균을 위해 셀 문화 후드에서 다음 단계를 수행 합니다. 100 µ L 425 U/mL 콜라 II 37 ° c.에 5 분에 전단지 소화에 VECs를 제거 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 소화를 방해.</li>
	<li>30 100 x g에서 원심 분리기 전단지, 펠 렛은 상쾌한을 신중 하 게 삭제 하는 s. 500 µ L 워시 버퍼와 두 번 세척 하 고 다시 30 100 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 s.</li>
	<li>전단지에서 피해자를 수확, 2 h, 425 U/mL 콜라 II의 100 µ L를 소화 하 고 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 부드럽게 pipetting으로 피해자를 놓습니다.</li>
	<li>문화 매체 및 작은 피해 자들은 고 나머지 밸브 전단지 파편을 5 분 동안 670 x g에서 원심 분리기의 19 ml에서 콜라 II 희석. 상쾌한, 취소 및 전단지 피해 자들은 문화 접시/플라스 크에 따라 전송 (표 1).</li>
	<li>문화 문화 매체, confluency 37 ° C, 5% (이산화탄소) CO2, 존재에 도달할 때까지 5-7 일에 대 한 피해 자들은 후 72 h 매체를 변경. 생체 외에서 실험에 사용에 대 한 통행 최대 5 배까지 일단 confluency에 도달 100% 합니다.</li>
</ol>4입니다. 쥐 피해자의 석 회화의 유도
참고: 모든 실험, 세포는 hemocytometer 포함.
<ol><li>시드 및 오염을 방지 하기 위해 소독된 후드에 뿌리고 모든 1 차 셀을 수행 합니다. 기본 쥐 피해 자들은 실험 체 외에 석 회화를 준비 하려면 셀 150, 000 셀/잘 6-잘 접시의 조밀도에 씨. ≥ 90 %confluency (일반적으로 72 h)까지 문화 매체에 유지 합니다.</li>
	<li>제어 매체 대 석 회화와 피해자를 취급 하 고 37 ° C, 5% CO2, 추가 72 h에 대 한 존재에서 품 어.</li>
	<li>석 회화 기본 쥐 피해 자들은 후속 다운스트림 분석에 대 한 연구, 석 회화/제어 매체를 제거 하 고 세척 비 바운드 Ca 및 Pi 이온 제거에 워시 버퍼와 monolayers.</li>
</ol>5. 쥐 빅 특성화
<ol><li>Immunostaining vimentin와 α-SMA, 씨앗 150, 000 셀/잘 6 잘 플레이트의 밀도에 쥐 피해 자들은 같은 phenotypic 표식에 대 한 모니터링에 대 한 커버 전표 (셀 커버 전표의 표면에 성장할 것입니다)를 포함 하 고 50 %confluency 성장.</li>
	<li>문화 매체를 발음 하 고 수정 셀 monolayers 4 %paraformaldehyde (PFA)와 10 분 동안 그들 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 3 시간을 세척 하기 전에 5 분 각 시간에 대 한. 주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
	<li>차단 하 고 permeabilization 버퍼와 셀 단층을 품 어 (1 x PBS, 2 차 항 체로 동일한 종에서 정상적인 혈 청의 5%, 0.3% 트라이 톤 X-100) 실 온에서 1 h.</li>
	<li>마우스 안티 vimentin 및 토끼 안티-α-SMA 항 체 항 체 희석 버퍼에 희석 된 셀 monolayers를 품 어 (1% 소 혈 청 알 부 민 + 0.3 %PBS Triton X-100) 하룻밤 4 ° C에서 부드럽게 흔들어 로커에. 주: 부정적인 컨트롤 비 활용 된 마우스 IgG와 토끼 IgG, 같은 희석을 사용 하 여 테스트 샘플으로 구성 되어 있습니다.</li>
	<li>다음 날, 3 번 5 분 때마다 PBS로 1 차 항 체를 씻어.</li>
	<li>부드럽게 로커에 떨고 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 fluorophore 활용으로 셀 monolayers를 품 어.</li>
	<li>PBS, 3 번 세척 하 고 부드럽게 핀셋 (쥐 피해 자들은 포함)는 coverslips에 밖으로 한 쌍의 집게와 coverslip 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)에와. 4 ° C에서 24 시간 이상 형광 현미경으로 시각화 하기 전에 치료 하는 슬라이드를 둡니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 분석에 대 한 150, 000의 밀도에서 피해 자들은 셀/6 잘 플레이트에 잘하고 confluent 100%까지 문화 매체에 성장에 두고 쥐 씨.</li>
	<li>단백질의 8 µ g를 사용 하 여 실행 CD31 표현을 측정 하 여 VEC 오염을 배제 서쪽 오 점. 참고: 앞에서 설명한9표준 서쪽 오 점 프로토콜 미행 했다.</li>
	<li>유전자 연구에 대 한 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 ribonucleic 산 (RNA)을 추출 합니다.</li>
	<li>반전 녹음 방송을 사용 하 여 대상 유전자 식 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 측정 하는 cDNA를 취득 및 실시간 PCR (RT-PCR; 일컬어 정량) 녹색 fluorophore 감지 Gapdh 이전 참조 유전자로 사용 하 여 설명된10.<ol>
<li>다음 프로그램을 사용 하 여 PCR 분석: 30 94 ° C의 30 주기 3 분, 94 ° C의 1 주기 s, 63 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 35 s, 그리고 5 분 동안 72 ° C의 마지막으로 1 사이클.</li>
		<li>다음 프로그램을 사용 하 여 정량 분석: 95의 40 주기 10 분 동안 95 ° C의 1 주기 30 s, 및 95 ° C 30에 대 한 15 초, 1 분, 1 분, 55 ° C 95 ° C의 추가 주기 위한 60 ° C에 ° C s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트리 스/Borate/EDTA (TBE) 버퍼에는 2 %agarose 젤을 사용 하 여 PCR 제품 분석을 젤 전기 이동 법을 실행 합니다.</li>
</ol>6. 쥐 빅 석 회화 연구
<ol><li>알리자린 레드 S 및 생 화 확 적인 석 회화 연구, 4 섹션에 설명 된 시드 및 석 회화 지침을 따르시기 바랍니다.</li>
	<li>5% 붉은 알리자린 S 솔루션, 부드럽게 20 분 통에 락 셀 monolayers 얼룩. 이후 5 분 때마다 증류수 3 번 씻어. 각 잘의 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>생화학 Ca 분석 결과 키트를 사용 하 여 계량 Ca 증 착. 캘리포니아2 + 이온 0.6 M 염 산 (HCl)를 사용 하 여 부드러운 동요와 4 ° C에서 24 h에 대 한 거.</li>
	<li>수확은 상쾌한 측정 분석 결과 Ca를 사용 하 여 Ca 농도 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.</li>
	<li>총 세포질 단백질의 일부분으로 칼슘 농도 계산 합니다. 0.1 M 수산화 나트륨 (NaOH) + 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 세포 monolayers에서 세포질 단백질 변성 제조업체의 지침에 따라 세제 호환 (DC) 단백질 분석을 사용 하 여 총 단백질 농도 결정 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 상세한 프로토콜 기본 쥐 피해 자들은, 효소 소화를 통해 쥐 심장 밸브에서 이러한 셀의 사용의 수집에 대 한 실제적인 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 더 지원 하 고 관상동맥 밸브 석 회화13연구 모델 생체 외에서 이전에 보고 된 쥐의 사용을 확장 합니다. 대동맥 밸브에서 피해자의 격리 이웃 VECs에서 오염에 대 한 가능성을 소개합니다. 그러나, 우리의 면역 형광 검사 데이터 초기 소화 단계 고립 된 세포를 내 피 세포 마커, CD31 부정적인 렌더링 VECs 제거 충분 한지 확인 합니다. 또한, α-SMA 얼룩 확인는 피해자의 활성화 형은 석 회화12필요 합니다.
빅 격리 이전에 보고 된 큰 동물 모델6,,78. 그러나, 이러한 종 다운스트림 연구로 전 세계 실험실에서 그들의 제한 된 액세스에 사용할 수 있는 제한 된 유전 및 분자 도구에 의해 제약 됩니다. 반면, 이러한 도구를 쉽게 사용할 수 있는 설치류에 따라서 능력을 분리 쥐 파생 된 피해자 수는 큰 실험 설계 용량 잘 설립 있습니다. 젊은 쥐에서 피해자의 사용 또한 세포는 상대적으로 더 오래 된 쥐, 따라서 더 많은 세포를 더 적은 동물이 요구 보다 증식을 의미 합니다. 마우스는 쉽게 액세스할 수, 하지만 쥐 때문 특히 작은 마음, 격리 하는 데 기본 마우스의 피해자 더 많은 시간이 소요 될 것 이라고 하 고 상당히 많은 동물 쥐 모델 셀의 동일한 수익률을 격리 하는 데 필요한 것입니다.
이 기술된 접근의 중요 한 이점은 피해 자들은 야생 종류와 유전자 변형 쥐 뿐만 아니라 심혈 관 질환과 밸브 상해의 쥐 모델에서 일시적으로 고립 될 수 있다 이다. 쥐 모델을 사용 하 여 필요 동물의 더 큰 수 대규모 실험, 따라서 동물 사용을 줄이기 위해, 그것을 잘 특징은 일단 셀 라인 생산 주 쥐 피해 자들은 변형 될 수 있다.
CAVD의 심각한 임상 의미 널리 인식 하 고, 하는 동안 근본적인 원인이 메커니즘은 아직 확인할 수 있다. 또한, 효과적인 약물 치료를 방지 하 고 잠재적으로 관상동맥 밸브 석 회화 치료 수 있습니다에서 사용할 수 있습니다 선물. 석 회화 조건 아래 피해자의 문화는 그러므로 CAVD의 관련성이 높은 생체 외에서 모델을 제공 합니다. 우리는 높은 Ca 및 Pi 수준 osteogenic 유전자 마커 Msx2, Alpl및 Phospho1의 표현에 수 반하는 증가 가진 고립 된 쥐 피해자의 체 외에 석 회화 유도 보여. 그것은 널리 이러한 마커 혈관 석 회화14,,1516의 병 적인 프로세스와 관련 된 설립. 우리의 데이터는 따라서 쥐 피해 자들은 중간 석 회화에 문화는 관상동맥 밸브 석 회화 시험관을 공부 하는 적절 한 모델을 보여준다. 실제로, 우리의 실험실에서 최근 연구는 캘리포니아 빅 파생 매트릭스 소포17의 Annexin VI 농축을 통해 관상동맥 밸브 석 회화 촉진 입증이 모델을 활용 하 고 있다.
쥐 피해 자들은 그들의 효율적인 특성을 사용 하 여의 혜택에도 불구 하 고 몇 가지 제한이 여전히 존재 한다. 첫째, 쥐 밸브 내 빅 인구의 크기는 매우 작습니다, 그리고 따라서 많은 동물 광범위 한 생체 외에서 연구에 대 한 충분 한 셀 번호를 생성 하기 위해 필요. 그러나, 그것은 불멸 하 게 밸브 중간 셀 라인, 최근에18, 우리가 보고 하 고 이후 주 문화를 고용 확인 하 고 이러한 연구 결과 확장 사업 예비 연구 하 여이 제한을 극복 하기 위해 가능 하다.
요약, 설명된 방법 성공적인 절연, 문화, 및 기본 쥐 수 있습니다 이후에 평가 분석을 포함 한 생 화 확 적인 분석 실험 단백질 및 RNA 분석의 다양 한을 사용 하 여 피해자의 석 회화를 설명 합니다. 이 모델 CAVD에서 생체 외에서조사 하는 안정적이 고 편리한 시스템 고이 파괴적인 질병에 대 한 책임 분자 메커니즘을 조사에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다.

건강 한 관상동맥 밸브는 밸브의 개폐 중 기계적 스트레스의 분포는 똑같이 apportioned 세 전단지의 구성 됩니다. 밸브 전단은 3 개의 명료한 층의 정의 구조: fibrosa, spongiosa, 및 ventricularis, 어떤 집 우위 한 세포 유형으로 중간 셀 (피해 자들은) 밸브. 이러한 3 개의 계층 밸브 내 피 세포 (VECs)1의 두 침대 사이 끼워 넣으면 됩니다.
피해자의 Calcific 대동맥 밸브 석 회화 (CAVD), 서방 세계에서 가장 일반적인 심장 밸브 질병 진행에서 중요 한 역할을 한다. CAVD은 적극적으로 판 막 병 조직과 그 주변 microenvironment에 의해 규제 진보적인 조건으로 설명 되어 있습니다. 세포질 변화는 처음 거리 두껍게, 그리고 결국 대동맥 밸브 전단의 광범위 한 석 회화 발생할. 이 다음 중요 한 관상동맥 밸브 협 착 증에 지도 하 고 궁극적으로, 왼쪽 심 실 유출 방해2, 떠나는 유일한 치료로 수술 밸브 교체.
CAVD의 이상 복잡 하지만 생리 뼈 강화 작용3비슷한 메커니즘을 공유 합니다. 연구의 숫자 osteogenic 트랜스-차별화 및 석 회화4,5을 피해자의 능력을 보여 준, 하는 동안이 과정을 underpinning 메커니즘은 아직 완전히 해명 될 강조는 모델을 실현 하 고 관련 생체 외에서 CAVD의 중요 한 요구 사항입니다.
실험실 수로 이전 작업, 돼지와 소 모델에서 피해자를 고립 된 성공적으로 있으며 조건6,,78석 회화에서이 세포 배양. 이러한 모델에 관상동맥 밸브의 큰 크기로 인해 효소 소화를 통해 세포의 고립 세포의 순수한 인구 생성에 매우 효과적인 되었습니다. 그러나,이 모델은 대형 동물 종에 대 한 분자 도구의 한정 된 가용성으로 인해 제한 수 있습니다. 대조적으로, 설치류 모델 상대적으로 낮은 비용, 유전자 조작에 대 한 잠재력 및 분자 도구를 쉽게 사용할 수의 광범위 한 배열 유리한 유지. 그러나, 작은 동물 모델에서 피해자의 격리 하지 널리 채택 된다, 작은 조직 샘플을 작업할 때 발생 하는 어려움의 가능성이 결과입니다.
이 상세한 프로토콜 쥐 피해자의 직접 격리에 대 한 포괄적인 방법을 보고합니다. 밸브, 일련의 효소 소화 다음의 주의 해 부에 의해 피해자는 절연 고 실험 기법, 셀 문화, 석 회화, 및 진 식 등의 다양 한 고용 될 수 있습니다. CAVD의 모델 관련성이 높은 생체 외에서 이 의심할 여 지 없이이 병 적인 과정의 우리의 지식을 증가에 필수적인 기여를 하게된다.

<table><tbody><tr><td>해부 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>사용하기 전에 오토클레이브.</td></tr><tr><td>스프링 스트레이트(8mm 블레이드)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15905</td><td>사용 전 오토클레이브.</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas 가위 (5mm 날, 8cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>사용 전 오토 클레이브.</td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋(11cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>사용 전 오토클레이브.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>배양 배지에 첨가하기 전 10500064 필터.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td><td>증류수에서 70% v/v로 희석합니다.</td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1150PB17</td><td>증류수를 0.6M로 희석합니다.</td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1823</td>은 <td>증류수로 0.1M로 희석합니다.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>1/250 항체 희석 완충액 희석.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 항토끼 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>1/250 항체 희석 완충액 희석.</td></tr><tr><td>Superscript II kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borate/EDTA (TBE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>1x로 희석 사용하기 전에 물을 추출하십시오.</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500</td><td>2% 1x Tris/Borate/EDTA(TBE).</td></tr><tr><td>용해 완충액(RIPA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>T175 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>Rat Msx2 프라이머</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>Rat Alpl 프라이머</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00190680</tr><tr><td>쥐 Enpp1 프라이머</td><td>Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>Sigma</td><td>CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic 인산염</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산염</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td> 시<td>그마</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 황산염 (SDS)</td> <td>시그마</td><td>5030</td><td>0.1M NaOH로 0.1 %로 희석합니다.</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td>은 <td>PBS로 4%로 희석합니다.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>알리자린 레드 S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td>증류수로 최대 2%까지 만들고 pH 4.2로 조정합니다.</td></tr><tr><td>TGF&beta;-1 프라이머 쌍: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>사용된 시그마</td><td></td><td>농도: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TGF&beta;-2 프라이머 쌍: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG</td><td>사용된 시그마</td><td></td><td>농도: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>단클론 항 / 베타; - Actin &minus; 마우스</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1/50000 희석액에서 생성된 과산화효소 항체 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T).</td></tr><tr><강>항체 희석 완충액</강한> 내 <td>마우스 항-비멘틴 항체</td><td>Sigma</td><td>v6389</td><td>1/900 희석(1x 인산염 완충 식염수(PBS), 1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.3% Triton X-100).</td></tr><tr><td>마우스 IgG</td><td>Sigma</td><td>I5381</td>은 <td>항체 희석 완충액에 희석하기 전에 마우스 anti-vimentin 항체와 동일한 스톡 농도로 희석되었습니다.</td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX35035</td><td>항체 희석 완충액에서 희석하기 전에 rabbit anti-&alpha;-평활근 액틴 항체와 동일한 원료 농도로 희석합니다.</td></tr><tr><td>토끼 항 -& 알파; - 평활근 액틴 항체</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>1/200 항체 희석 완충액에 희석.</td></tr><tr><td>토끼 anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1/50 희석 5% BSA inTBS/T.</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit 항체</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>1/3000 희석액, TBS/T.의 5% BSA에 용해.</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>41512862</td><td>증류수로 425U/mL로 조정한 다음 여과합니다.</td></tr><tr><td>SYBR 그린 마스터믹스</td><td>Primerdesign</td><td>PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 분석 키트</td>, <td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>DC 단백질 분석 키트</td>, <td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>ECL 시약</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>하이퍼필름 ECL</td>, <td>GE 헬스케어</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>GE 헬스케어</td><td></td><td></td>10600007</tr><tr><td>PCR ladder</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>젤 전기영동용 로딩 염료</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 (0.22 &mu; m)</td> <td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>혈구 분석기</td><td>Marienfeld Superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>카메라 Alizarin 레드 이미지 설정 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Nikon D800</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1 : 2.8 GED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 겸자 10cm, 곡선 끝</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td>사용 전 오토 클레이브.</td></tr></tbody></table>

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD) 대동맥 밸브 전단의 진보적인 두껍게 특징 이다. 그것은 노인 및 끝 단계 신장 질병 (ESRD) 환자, 일반적으로 hyperphosphatemia와 아 고통에서 자주 발견 하는 조건이 다. 현재,의 진행을 막을 수 없습니다 약물 요법이 있다. 이 병 적인 과정의 기반이 되는 메커니즘은 불분명 남아 있다. 대동맥 밸브 전단 밸브 중간 셀 (피해자)는 VECs 사이 대동맥 cusps의 외부 표면에 얇은 층의 밸브 내 피 세포 (VECs)로 구성 된다. 쥐 모델의 사용에는 vivo에서 physiopathological 혈 청 인산 (Pi) 및 hyperphosphatemia와 아에서 고통 받는 환자의 칼슘 (Ca) 수준에 따라 소성 석 회화의 생체 외에서 연구를 수 있습니다. 설명된 프로토콜 세부 순수한 쥐 빅 인구의 빅 표시자의 식에 의해 표시 된 대로: 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA) vimentin 및 조직 성장 인자 베타 (TGFβ) 1과 2, 그리고 차별화 (CD) 31, 한 VEC의 클러스터의 부재 표식입니다. 이러한 피해자를 확대 하 여 연구 하 고 해명 CAVD underpinning 키 중재자 생화학, 유전, 및 이미징 연구를 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목표 기본 쥐 피해자의 격리를 설명 하 고 석 회화 실험 체 외에 문화를 했다. 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 쥐 피해 자들은 성공적으로 고립 되 고 CAVD에 대 한 책임 메커니즘의 연구에 대 한 확장.
쥐 주 피해자 공동 설립된 빅 마커 지역화:
격리 된 셀 빅 형 빅 표식에 대 한 면역 형광 검사를 통해 확인 했다: vimentin와 α-SMA (빨간색과 녹색, 각각 그림 1A), 이전 보고서11,12계약입니다. 비 활용 된 마우스와 토끼 IgG 사용 하 여 대표 부정적인 컨트롤 그림 1B에서 표시 됩니다. 또한, 빅-성장 레 귤 레이 터 TGFβ-1 TGFβ-2의 식 PCR 분석 (그림 1C)을 사용 하 여 확인 되었다. 서쪽 오 점 분석 그 쥐를 확인 하기 위해 수행 되었다, 고립 된 쥐 주 피해자 했다 내 피 오염에서 무료로 확인 피해 자들은 부정 했다 CD31, 내 피 세포 표식에 대 한 긍정적인 제어 ( 로 개 mitral VECs를 사용 하 여 그림 1D).
Ca와 Pi 쥐 빅 석 회화 유도:
높은 조직의 Ca 또는 Pi 농도 일반적으로 피해자 체 외의 석 회화를 드라이브. 피해 자들은 격리 된 쥐의 석 회화 가능성, 감사 셀 ESRD 환자에서 병 적인 아 및 hyperphosphatemia 조건 모방 Ca와 Pi의 높은 수준에 노출 되었다. 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이와 피해자의 치료 유도 석 회화, 알리자린 레드 S Ca 증 착 (그림 2A)와 HCl (81 배; leaching 다음 Ca 레벨의 색도계 결정에 대 한 얼룩에 의해 결정 되 학생의 t를 사용 하 여 p < 0.05-테스트; 그림 2B)입니다.
진 식 변경 빅 석 회화와 관련 된:
생체 외에서 혈관 세포의 석 회화 별개 분자 프로 파일에 연결 됩니다. 현재 연구에서 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이와 피해자의 치료 osteogenic 마커의 mRNA 식에 상당한 증가 유발: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 배 변화; p < 0.01; 그림 3A), 알칼리 성 인산 가수분해 효소, Alpl (1.49 배 변화; p < 0.001; 그림 3B), 및 phosphoethanolamine/phosphocholine 인산 가수분해 효소, Phospho1 (4.7 배 변화; p < 0.01 일방통행 ANOVA;를 사용 하 여 그림 3C)입니다. 그러나, osteogenic 표식, Runx2및 석 회화 억제 물 ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1의 식을 그대로 (그림 3D-E) 남아 있었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg"> 그림 1입니다. 빅 마커의 식. (A) 면역 형광 밸브 중간 셀 (피해자)에 더블 얼룩, 알파-부드러운 근육 말라 (α-SMA; 녹색)와 vimentin의 colocalization를 보여주는. (B) 마우스와 토끼 IgG 사용 하 여 부정적인 컨트롤의 대표 이미지. 핵은 블루 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 사용 하 여 (DAPI)에 물 들 다. 눈금 막대 = 50 µ m. (C) 변형 시키는 성장 인자 beta 1 (TGFβ-1)의 존재와 피해자에 TGFβ-2 (차선 1-3) PCR 분석에 의해 표시 된 대로. 레인 4 물 컨트롤입니다. 사용 하는 참조 유전자 Gapdh이었다입니다. (D) 서쪽 오 점 분석 CD31의 풍부한 식 식이 없는 피해자에 비해 개 승 모 판 내 피 세포 (VECs)에서 보여주는. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg"> 그림 2입니다. 쥐 피해 자들은의 석 회화 생체 외에서 . 피해 자들은 증 착 Ca 치료 2.7 m m Ca/2.5 m m Pi에 따라: (A) 사진 보여주는 알리자린 레드 S 잘, 그리고 (B) HCl leaching 다음 Ca 레벨의 색도계 결정에 전체 셀 monolayers의 얼룩. 학생의 t-테스트 두 데이터 그룹 간의 의미 분석을 수행 했다. 결과 ± S.E.M.를 의미 하는 대로 표시 됩니다 *p < 0.5 제어;와 비교 (n = 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg"> 그림 3입니다. 빅 석 회화와 관련 된 유전자 표현 변경. Msx2(A), (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2, 배 osteogenic 마커의 mRNA 식에서 변경 하 고 (E) Enpp1 피해자에서 Ca/2.5 m m에 대 한 Pi 2.7 m m로 치료 48 h. mRNA 식 생 참조 유전자에 비해 배 변화로 표시 됩니다 Gadph. 쌍 단위 비교를 통합 하는 일반 선형 모델을 사용 하 여 단방향 ANOVA 여러 그룹 간의 의미 분석을 수행 했습니다. 결과 ± S.E.M.를 의미 하는 대로 표시 됩니다 * *p < 0.01; p < 0.001 제어;에 비해 (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>밸브 전단의 수</td>
			<td>문화 접시/플라스 크</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 ~ 15</td>
			<td>1 12-잘 접시에 잘</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 ~ 30</td>
			<td>6 잘 플레이트에서 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 +</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 초기 시드에 필요한 전단지의 번호에 대 한 일반적인 지침.

이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 석회성 대동맥판막 질환의 메커니즘을 연구하기 위해 쥐의 판막 간질 세포(valve interstitial cells, VICs)를 분리하는 것입니다. 이 방법은 VICs가 왜 석회화되는지, 그리고 이러한 세포의 석회화를 방지하기 위해 무엇을 할 수 있는지와 같은 판막 석회화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 접근성이 좋으며, 추가 연구를 위해 세포주로 전환할 수 있는 가능성이 있다는 점입니다.시료와 시약의 무균 상태를 보장하기 위해, 70% ethanol로 미리 소독한 환기 후드 내에서 모든 해부를 수행하십시오. 해부 도구는 오토클레이브로 멸균한 후, 사용 전 70% ethanol이 담긴 비커에 도구의 팁 부분을 담가 소독하십시오. 동물이나 조직에 접촉하기 전, 해부 도구를 세척 완충액(wash buffer)이 담긴 비커에 적시십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 쥐를 안락사시킨 후, 동물을 유리 해부판 위에 등으로 눕히고 70% ethanol을 분사하여 피부를 소독합니다. 심장을 적출하기 위해 해부 가위를 사용하여 쥐의 정중선에 4 cm 절개를 넣어 복강을 노출시킨 다음, 흉곽과 폐를 조심스럽게 제거하여 심장을 노출시킵니다. 날카로운 가위로 심장을 제거합니다.모든 쥐의 육안 해부가 완료될 때까지 해부한 심장을 얼음처럼 차가운 세척 완충액에 보관하십시오. 각 심장을 미세 해부하려면, 해부한 심장을 세척 완충액이 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 스프링 직선 가위로 심근을 다듬어 상행 대동맥과 대동맥 근부 주변의 작은 영역만 남깁니다.동일한 스프링 직선 가위를 사용하여 상행 대동맥을 좌심실 방향으로 조심스럽게 절개하고 대동맥 판막 엽을 노출시킵니다. 그다음, 절개한 대동맥을 Hank's Balanced Salt Solution이 채워진 깨끗한 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 대동맥 기저부에서 특유의 U자 모양으로 구분되는 대동맥 판막 엽을 Vanna 가위로 박리합니다.모든 해부 과정이 완료될 때까지 모든 엽(leaflets)을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 담아 1 mL의 차가운 세척 완충액에 보관하십시오. 모든 엽을 수집한 후, 4 °C에서 100g로 1분간 원심분리하여 세척 완충액을 제거합니다. 판막 내피세포(VECs)를 제거하려면, 37 °C에서 100 µL의 425 U/mL Collagenase II로 엽을 5분 동안 소화시킵니다.200 µL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 소화를 중단시킵니다. 100g에서 30초 동안 원심분리하여 판막엽을 펠렛화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 500 µL의 세척 완충액으로 판막엽을 세척하고 100g에서 30초 동안 다시 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.엽편(leaflet)에서 VIC를 수확하려면, 37°C에서 100 µL의 Collagenase II로 1.5~2시간 동안 소화시킵니다. 그런 다음 200 µL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 파이펫팅하여 VIC를 분리합니다. Collagenase II를 19 mL의 배지로 희석하고 670g에서 5분 동안 원심분리하여 VIC와 남은 밸브 엽편 잔해를 펠렛으로 만듭니다.상층액을 제거한 후, 엽편과 VIC를 배양 플레이트 또는 플라스크로 옮깁니다. 37°C, 5% CO2 조건에서 VIC를 배양액으로 5~7일간 배양하여 세포가 합류(confluency) 상태에 도달하게 하며, 72시간 후에 배지를 교체합니다. 인 비트로(in vitro) 석회화 실험을 위한 일차 쥐 VIC를 준비하려면, 6-웰 플레이트의 웰당 150,000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다.세포의 밀도가 90% 이상이 될 때까지 배양액에서 유지합니다. VIC를 석회화 유도 배지와 대조군 배지로 처리한 후, 5%CO2 조건의 37°C 인큐베이터에서 72시간 동안 추가로 배양합니다. 이후의 하위 분석을 위해 석회화된 일차 쥐 VIC를 연구하려면, 석회화 배지 또는 대조군 배지를 제거합니다.본문 프로토콜에 상세히 설명된 쥐 VIC 특성 분석을 수행하기 전, 결합되지 않은 칼슘 및 인산 이온을 제거하기 위해 세척 완충액으로 단층 세포를 세척합니다. 쥐 VIC 석회화 연구의 경우, 5% Alizarin Red S 용액으로 세포 단층을 염색하고 쉐이커 위에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그 후, 증류수로 5분씩 세 번 세척합니다.칼슘 침착량을 정량화하려면 생화학적 칼슘 분석 키트를 사용하십시오. 0.6 M 염산을 사용하여 4 °C에서 24시간 동안 부드럽게 교반하며 칼슘 이온을 용출시킵니다. 상층액을 수집하고 제조사의 지침에 따라 칼슘 분석 키트를 사용하여 칼슘 농도를 측정하십시오.마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 총 세포 단백질의 분율로 칼슘 농도를 계산합니다. 분리된 세포의 VIC 표현형은 VIC 마커인 vimentin 및 alpha smooth muscle actin에 대한 면역형광 염색을 통해 확인하였습니다. 또한, VIC 성장 조절 인자인 tissue growth factor beta-1 및 2의 발현을 PCR 분석을 사용하여 확인하였습니다.개 판막 혈관 내피세포(VECs)를 양성 대조군으로 사용하여, 쥐 밸브 간질세포(VICs)가 내피세포 마커인 CD 31에 대해 음성임을 확인하기 위해 Western blot 분석을 수행하였습니다. 쥐 VICs를 병리적 고칼슘혈증 및 고인산혈증 상태를 모사하는 높은 수준의 칼슘과 인산염에 노출시켰습니다. 칼슘 침착에 대한 Alizarin Red 염색과 염산 침출 후 칼슘 농도의 비색법 측정 결과, VICs를 칼슘과 인산염으로 처리했을 때 석회화가 유도되었음을 확인하였습니다.VICs를 칼슘과 인산염으로 처리한 결과, 골형성 마커인 MSX2, ALPL 및 PHOSPHO1의 mRNA 발현이 유의미하게 증가했습니다. 숙련된 경우, 판막 엽 18개에 대한 소화 과정을 제외하고 이 기술은 1~2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 박리 및 소화 과정 동안 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청하고 나면 일차 쥐 밸브 간질 세포(VIC)를 분리하는 방법과 이를 이용하여 VIC 석회화의 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차 이후에는 VIC의 생리와 행동을 연구하기 위해 유세포 분석 및 현미경 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술이 발전되면 심혈관 연구 분야의 연구자들이 쥐 모델을 사용하여 인간의 대동맥판막 석회화 기전을 탐구하는 길을 열어줄 수 있을 것입니다.

isolation-characterization-primary-rat-valve-interstitial-cells-new

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 분리하고 심장 밸브 내피 세포 (VEC)의 culturing 순수한 인구를위한 방법을 제공합니다. VEC는 (雨 期) 또는 전단지의 양쪽으로부터 격리하고 즉시 다음과 같은 수 있습니다 기본 중간 세포 (VIC) 격리는 간단합니다.

판막병 내피 세포의 분리

이 비디오에서는 성인 마우스의 심장에서 대동맥 판막 간질 세포를 2단계 콜라겐분해효소 절차를 사용하여 분리하고 이후 소량의 성장 배지에서 배양하는 방법을 보여줍니다.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

이 비디오는 in vitro에서 대동맥 판막 간질 세포의 석회화를 평가하기 위한 분석 기술을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘 이온과 반응하여 자주색 칼슘-비소 복합체를 형성하는 칼슘에 민감한 염료인 arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

대동맥 판막 간질 세포의 칼슘 농도를 측정하기 위한 석회화 분석

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

혈관 석회화는 인간의 심혈관 질환을 예측하는 중요한 인자이자 기여자입니다. 이 프로토콜은 근적외선 형광 이미징을 사용하여 배양된 1차 혈관 평활근 세포의 석회화를 유도하고 동물 대동맥의 석회화 및 대식세포 부담을 정량화하는 방법을 설명합니다.

대동맥 석회화와 염증의 혈관 평활근 세포 및 이미지의 석회화

이 연구에서는, 우리는 유동 세포 분석분석을 사용하여 적응성 백혈구 하위 집합의 특성화를 위한 T 세포 복제의 신선한 견본 및 T 세포 복제의 분석 단계에서 T 림프구 절연의 과정을 기술합니다.

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

이 프로토콜은 외과적 대동맥 판막 치환술 중 또는 사체 조직에서 추출한 인간 대동맥 판막의 수집과 환자 특이적 일차 판막 내피 및 간질 세포의 후속 분리, 확장 및 특성화를 설명합니다. 세포 생존율 및 표현형 특이성을 보장하는 데 필요한 프로세스에 대한 중요한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

체외 질병 모델링을 위한 인간 일차 판막 세포의 분리

이 프로토콜은 심장 판막의 동종 활성에 대한 연구를 허용하기 위해 신장 캡슐 아래에 대동맥 판막 전단지를 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

설치류의 이종 주제 심장 판막 이식을위한 단순화 된 모델

대동맥판막협착증(AVS)의 기저에 있는 병리학적 기전을 이해하고 치료적 개입의 효능을 평가하기 위해서는 적절한 동물 모델이 필요하다. 본 프로토콜은 생체 내에서 직접 풍선 손상을 통해 AVS 토끼 모델을 개발하기 위한 새로운 절차를 설명합니다.

직접적인 풍선 손상으로 인한 토끼 대동맥 판막 협착증 모델

배우세요 쥐 밸브 중간 세포(VIC) 분리 및 배양 방법을 통해 관상동맥 밸브 석회화 질환(CAVD)의 세포적 기전을 연구하세요. 이 기법은 심혈관 질환 치료 전략 개발에 중요한 생리학적 체외 모델을 제공합니다.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

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