절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

이 프로토콜의 전반적인 목표는 쥐 판막 간질 세포 또는 VIC를 분리하여 석회성 대동맥 판막 질환의 메커니즘을 연구하는 것입니다. 이 방법은 VIC가 석회화되는 이유와 이러한 세포가 석회화되는 것을 방지하기 위해 할 수 있는 것과 같은 판막 석회화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 접근성과 추가 연구를 위해 세포주로 변형될 수 있는 잠재력입니다.

샘플과 시약의 멸균을 보장하기 위해 이전에 70% 에탄올로 소독한 환기 후드에서 모든 해부를 수행합니다. 해부 도구를 고압증기멸균하여 멸균한 다음 사용하기 전에 70% 에탄올이 함유된 비커에 도구 끝을 담그십시오. 동물이나 조직에 닿기 전에 세척 버퍼의 비커에 해부 도구를 담그십시오.

텍스트 프로토콜에 설명 된대로 쥐를 도태 한 후 유리 해부 보드에 누운 동물을 놓고 70 % 에탄올을 분사하여 피부를 소독합니다. 심장을 해부하려면 해부 가위를 사용하여 쥐의 정중선을 4cm 절개하여 복강을 드러내고 흉곽과 폐를 조심스럽게 제거하여 심장을 노출시킵니다. 날카로운 가위로 심장을 제거하십시오.

쥐의 모든 전체 해부가 완료될 때까지 해부된 심장을 얼음처럼 차가운 세척 완충액에 보관하십시오. 각 심장을 미세해부하려면 절개된 심장을 세척 완충액으로 덮인 페트리 접시에 옮깁니다. 스프링 스트레이트 가위로 심장 근육을 상행 대동맥과 대동맥 뿌리를 둘러싼 작은 영역이 있는 왼쪽으로 다듬습니다.

같은 스프링 스트레이트 가위를 사용하여 좌심실 쪽으로 상행 대동맥을 조심스럽게 잘라 열고 대동맥 판막 첨판을 노출시킵니다. 다음으로, 열린 대동맥을 Hank's Balanced Salt Solution으로 채워진 신선한 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. 대동맥 기저부에 독특한 U자 모양으로 표시된 대동맥 판막 첨판을 Vannas 가위로 해부합니다.

모든 전단지를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 1.5ml의 얼음처럼 차가운 세척 버퍼에 넣어 모든 해부가 완료될 때까지 보관하십시오. 모든 전단지를 수확하면 섭씨 4도에서 1분 동안 100g으로 원심분리하여 세척 버퍼를 제거합니다. 판막 내피 세포 또는 VEC를 제거하려면 Collagenase II의 밀리리터당 425단위씩 100마이크로리터의 첨판을 섭씨 37도에서 5분 동안 분해합니다.

200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 소화를 방해합니다. 100g에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 소엽을 펠릿으로 만듭니다. 상층액을 조심스럽게 버린 후 500마이크로리터의 세척 완충액으로 첨판을 세척하고 100g에서 30초 동안 원심분리하여 세포를 다시 펠릿

전단지에서 VIC를 채취하려면 100마이크로리터의 콜라겐분해효소 II를 섭씨 37도에서 1.5-2시간 동안 소화합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 VIC를 분리합니다. 콜라겐분해효소 II를 19ml의 배양 배지에 희석하고 670g에서 5분 동안 원심분리하여 VIC과 남은 판막 첨판 파편을 펠릿화합니다.

상층액을 버린 후 첨판과 VIC를 배양 플레이트 또는 플라스크로 옮깁니다. 5%CO2가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 합류도에 도달할 때까지 배양 배지에서 VIC를 5-7일 동안 배양하고 72시간 후에 배지를 변경합니다. 체외 석회화 실험을 위해 1차 랫드 VIC를 준비하려면 6웰 플레이트에서 웰당 150, 000개의 세포 밀도로 세포를 파종합니다.

배양 배지에서 세포를 90% 포화도 이상으로 유지합니다. VIC를 석회화 대 대조군 배지로 처리하고 추가로 72시간 동안 5%CO2가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 후속 다운스트림 분석을 위해 석회화된 1차 쥐 VIC를 연구하려면 석회화 또는 대조 매체를 제거합니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 rat VIC 특성화를 수행하기 전에 비결합 칼슘 및 인산염 이온을 제거하기 위해 세척 버퍼로 단층을 세척합니다. 쥐 VIC 석회화 연구의 경우, 세포 단층을 5% Alizarin Red S 용액으로 염색하고 셰이커에서 20분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 매번 5분씩 증류수로 세 번 씻습니다.

칼슘 침착을 정량화하려면 생화학적 칼슘 분석 키트를 사용하십시오. 0.6몰 염산을 사용하여 칼슘 이온을 섭씨 4도에서 24시간 동안 부드럽게 교반하여 흡수합니다. 상층액을 수확하고 제조업체의 지침에 따라 칼슘 분석 키트를 사용하여 칼슘 농도를 측정합니다.

마지막으로, 칼슘 농도를 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전체 세포 단백질의 분율로 계산합니다. 분리된 세포의 VIC 표현형은 면역형광을 통해 확인되었으며, VIC 마커, vimentin 및 alpha smooth muscle actin을 조사했습니다. 또한, VIC 성장 조절자인 조직 성장 인자 beta-1 및 2의 발현은 PCR 분석을 사용하여 확인하였다.

또한 웨스턴 블롯 분석(western blot analysis)을 수행하여 개 승모판 VECs를 양성 대조군으로 사용하여 내피 세포 마커 CD 31에 대해 랫트 VIC가 음성임을 확인했습니다. 쥐 VIC는 칼슘과 인산염 수치가 높아진 것에 노출되었는데, 이는 병리학적 고칼슘혈증과 고인산혈증 상태를 모방했다. 칼슘 침착을 위한 Alizarin Red 염색에 의해 결정된 칼슘 및 인산염 유도 석회화를 사용한 VIC의 처리 및 염산 침출 후 칼슘 수준의 비색 측정.

VIC를 칼슘과 인산염으로 처리하면 골형성 마커 MSX2, ALPL 및 PHOSPHO1의 mRNA 발현이 크게 증가했습니다. 이 기술을 완전히 익히면 18개의 판막 첨판에 대한 분해를 제외하고 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 해부 및 소화 중에 무균 상태를 확인하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 1차 쥐 VIC를 분리하는 방법과 이를 사용하여 VIC 석회화의 메커니즘을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 VIC 생리학 및 거동을 연구하기 위해 유세포 분석 및 현미경 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 심혈관 연구 분야의 연구자들이 쥐 모델을 사용하여 인간의 대동맥 판막 분류 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다.