Name: 압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 배우세요 쥐의 두개골 창 수술을 위한 압전 수술 기법으로 뇌 조직 손상 없이 정밀하게 두개골을 얇게 만드는 방법을 익히세요. 이 기술은 신경과학 연구에서 생체 내 영상화를 가능하게 합니다.

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이 문서에 있는 multiphoton 이미지를 얻을 수 있도록에 대 한 타 라 Zeric. 두뇌 및 행동, 파 킨 슨 병 및 JPB 기초, R01 MH108186 R01 DA07418에서 지원. F31 친목 1F31MH109293-01A1 S c

동물 관련 된 기준에 따라 수행 하는 모든 절차는 컬럼비아 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 설정 합니다. 안락사는 마 취 제와 마 취에서 자 궁 경부 전위를 통해 수행한 100 mg/kg 및 xylazine 10 mg/kg intraperitoneally 주입. 모든 외 과적 멸 균 방식으로 수행 되었다 (외과 의사 머리 모자, 얼굴 마스크, 멸 균 장갑, 그리고 깨끗 한 일회용 랩 코트 입고 있던) 수술 도구 각각의 사용 사이 압력가 마로 소독 했다.
1. presurgical 단계
<ol><li>고압 무 균을 보장 하기 위해 모든 수술 기구.</li>
	<li>Isoflurane (유도 대 한 4% 및 수술에 대 한 1.5-2%)와 C57bl6 마우스 anesthetize 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해 뒷 발가락 마다 10 분을 꼬집어. 발성 이나 뒷 다리 철회 볼 경우 마 취를 증가.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 눈에 수의 눈 윤 활 유를 적용 합니다.</li>
	<li>3 분 신청 머리 제거 젤 또는 전기 면도기로 면도 하 여 두 피에 머리카락을 제거 합니다.</li>
	<li>장소는가 열 패드 또는 담요 세트 38 ° c를 재순환 하는 보정된 물에 stereotaxic 프레임에서 마우스</li>
	<li>Presurgical 무 통을 제공 하기 위해 피하 buprenorphine (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
	<li>액체 또는 betadine와 70% 에탄올 솜 밀고 주걱을 사용 하 여 세 가지 대체 응용 프로그램으로 두 피를 치료.</li>
	<li>100ml 희석 bupivacaine 50% 식 염 수 국 소 마 취를 제공 하기 위해 두 피 아래에 주입.</li>
</ol>2. 압 전 두개골 창 수술
<ol><li>압력가 마로 소독 멸 균 수술 도구를 사용 하 여 제거 두 피의 1 cm 원 두개골 이상 절단 하 여 원형 패턴에서 수술가 위. 두개골 뼈를 통해과 조직 노출에서 두 피를 들어올립니다.</li>
	<li>집게의 팁을 사용 하 여 모든 나머지과 조직의 분명 노출 된 뼈를 긁어. 이 치과 시멘트 것 이다 떨어지지 않을 나중을 위해 중요 하다.</li>
	<li>가장 낮은 설정에 진동 압 전 수술 단위를 설정 합니다. Note 높은 설정 강렬한 진동으로 인해 혈관을 깰 수 있습니다.</li>
	<li>핸드 피스를 멸 균 순환 팁을 수정 합니다. 참고: 4 m m 원형 팁은 수술에 대 한 적합 합니다. 큰 팁 크기 전체 윈도우 동시에 thinned 수 있습니다으로 수술의 속도에 기여 한다.</li>
	<li>얼음 차가운 인공 뇌 척추 액체 (실제)와 10 mL 주사기를 압 전 핸드 피스를 들고 손을 있습니다.</li>
	<li>1 mL/분의 속도로 두개골에 주사기에서 실제 또는 떨어지는 하 여 두개골을 관개, 두개골 위에 연동 펌프를 사용 하 여 무료로 다른 한편의 사용. 참고: 차가운 실제와 관개는 고주파 진동에서 마찰로 인해 과열을 방지 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 빛 원형 모션으로 두개골에 진동 외과 팁을 적용 (1 당 3 원 s) 얇은 두개골 준비 (5 ~ 10 분) 수행을 원하는 깊이 뼈 얇은. 참고: 여기, 4 m m 창 했다 20 µ m를 박 형 했다 그. 그러나, 윈도우의 크기는 수술 팁의 크기와 달라 집니다. 뼈의 두께 팁을 적용 하는 두개골에 보낸 시간의 길이에 따라 원하는 깊이를 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 handpiece의 각도 조정 하 고 균일 하 게 두개골을 얇은 두개골에 압력을 적용 하는 동안 팁의 각도 변경 합니다.</li>
	<li>뒤에 어떤 얇은 뼈를 남기지 않고 완전 한 뼈 제거를 수행, 균열 창 주변 표시 될 때까지 뼈를 얇은. 기본 dura 손상 없이 집게와 얇은 뼈의 남은 부스러기를 제거 합니다.</li>
	<li>차가운 실제 hemostatic 콜라겐 거품의 1 m m 부분을 담근 다. 집게와 젖은 거품을 누른 얇은 두개골에 배치 합니다. 약 30 얇은 두개골에 앉아서 수 중지 어떤 마이크로 s 개발에서 유혈.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 4 m m 유리 coverslip 뼈에 박 형 창 옆으로 놓고.</li>
	<li>작은 플라스틱 또는 나무 주걱을 기울였다 면의 뒷면을 사용 하 여 장소에는 창 잡아 두개골에 치과 아크릴의 약 100 µ L를 적용.</li>
</ol>3. 포스트 수술 케어
<ol><li>수술 기구에서 마우스를 제거 하 고 복구에 대 한가 열에 놓습니다. 그것은 완전 한 의식 (정상적인 이동성, 걸음 걸이, 및 행동 평가) 회복 될 때까지 계속 모니터링 합니다.</li>
	<li>평가 동물 손질, 음식, 그리고 물 소비, 행동 (예: 절 뚝 거리 또는 돌출된 자세)를 지키고 또는 침략을 증가 하는 감소 활동을 포함 하 여 수술 후 통증의 발현에 대 한 일 동안 하루에 두 번. 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사에는 동물을 반환 하지 않습니다.</li>
	<li>Buprenorphine 관리 (0.05-0.1 mg/kg) 3 일 동안 수술 후 진통 8-12 h로 피하. 밀접 하 게 dehiscence, 염증, 그리고 감염의 징후에 대 한 수술을 다음과 같은 윈도우의 영역을 모니터링 합니다. 동물을 반환 하지 않으면 베이스 수 유 및 동작을 손질 가능한 개입 또는 안락사에 관한 수 의사를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li>
<li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li>
<li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210017/meta">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li>
<li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+surgery+in+implantology%3A+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li>
<li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation%3A+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li>
<li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+microsurgery%3A+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li>
<li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4646478/">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li>
<li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contemp+Dent+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li>
<li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0901502711002232">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li>
</ol>

아무 공개 있다.

수술 수술 끝을 변경 하 여 수정할 수 있습니다. 핸드 피스에 적용할 수 있는 팁을의 많은 다른 크기가 있다. 팁의 모양 또는 크기를 변경 하는 것은 다른 크기의 창 귀 착될 것 이다. 4 m m 팁 이외에 우리는 또한 3 m m 팁을 시도 하 고 그것은 또한 잘 작동을 발견. 얼음으로 관개와도 차가운 실제, 우리는 했다 너무 너무 많은 열을 발생 하 고 선도 손상 기본 dura 뼈 굽기 집중된 진동 때문 (약 0.25 m m)를 좁은 팁으로 좋은 결과를 얻을 수 없습니다. 우리는 다양 한 사용할 수 있습니다, 다른 팁을 시도 하지 않은 그리고 우리 기대 하는 다른 연구소가 다른 팁에 대 한 새로운 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다. 수술은 비교적 간단 하 고, 하는 동안 우리는 문제 해결에 필요할 수 있는 몇 가지 단계는 발견. 첫 번째는 진동 팁 가시성을 감소 하 고 뼈 수술의 단계 숱이 동안 뼈 깊이 확인에 어려움을 생산 실제 난 기류를 많이 생산. 우리가 좋습니다 얼마나 얇은 뼈가, 뼈의 측면에 멸 균 면봉을 적용 하 여 두개골과 창 건조 휴식 하기 너무 어렵습니다. 거친 표면 얇은 뼈를 손상 이후 면봉, 창에 직접 적용 되지 않습니다. 깊이 확인 한 후 실제 적용 하 고 수술 계속 합니다. 우리는 또한 그 경질에 손상이 있는 경우에, 그것은 일반적으로 외과 의사는 팁에 너무 많은 압박으로 인해 발견. 핸드 피스를 더 부드럽게 누른 적은 힘이 문제를 해결할 가능성이 것입니다. 외과 의사는 강제로 뼈에 팁을 근 근, 하는 경우 그것은 얇은 뼈에 휴식을 일으킬 하 고 두개골 손상. 마지막으로, 뼈를 숱이 후 기본 dura 나타나면 상처, 진동에서 과도 한 열으로 인해 높습니다. 실제 흐름의 속도 증가이 문제를 해결할 것입니다.
벡터의 주요 제한은입니다 핸드 피스는 뼈를 얇은 수 있습니다 하지만 경질을 통해 모든 뼈를 제거할 수 없습니다. 다이아몬드 코팅된 팁 작은 거친 범프 있다. 두개골 얇은 필요한 마찰 경질을 침식 하 고 모든 뼈를 제거 하는 데 사용 된 경우 출혈이 발생할 것. 따라서, 집게를 사용 하 여 나머지 얇은 레이어를 제거 해야 합니다. 여부 얇은 두개골을 통해 이미징 덜 염증과 microglia 및 반응성 이다 확산을 덜 생산에 지속적인 논쟁이 있지만, 어떤 경우에 남아 있는 아무 뼈와 창 선호, 예를 들어, 제공 하는3 이미징의 더 깊이 .
우리는 쥐에 있는 multiphoton 이미징 두개골 창 준비를 최적화 했습니다. 벡터는, 우리의 지식, 광학 이미징 설치류 두개골 창 수술 압 전 기술의 첫 번째 응용 프로그램. 우리는 쥐에 압 전 수술의 사용 증가 속도의 장점을 공유 하 고 또한 인간7,8,,910에 보고 된 부작용을 감소 발견. 압 전 장치 활용 빠른 수술 (그림 2A) 귀착되 고 고속 회전에 비해 출혈의 적은 부작용 드릴 (그림 2B). 우리 또한 발견, 연구소, 내 위상 쉽게 새로운 외과 두개골 창 수술에 전통적인 접근 보다는 법을 배워야 했다. 속도의 장점과 사용 용이성 외과의 사이 다를 가능성이 있습니다. 얇은 두개골 준비는 일반적으로 페이저 접근 일반적으로 미만 10 분을 요구 하면서 드릴 및 메스2, 뼈를 얇은 30-45 분 필요 합니다.
우리는 위상 준비 windows에 우리가 레이어 4 피라미드 뉴런 adeno 관련 바이러스 칼슘 표시기 JRGECO1a 인코딩 페 했다 모터 피 질에서에서 칼슘 과도 이미지 수 발견 (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). 우리 또한 발견, 메스와 로타리 드릴 준비 얇은 두개골 두개골 창에 비해, 이미징 지역 얇은 두개골 로타리와 함께 준비 하는 동안 더 큰 되었고 메스는 20 µ m 직경2의 영상 창 . 벡터와 함께 우리는 신속 하 게 3-4 m m의 얇은 수 있었다. 포트4보고 이미징 윈도우와 비슷합니다. 이 큰 창 빠른 이미징 얇은 두개골 창 메스와 치과 드릴 준비에 대 한 보고의 혜택을 유지 합니다. 또한, 벡터와 준비 창 즉시 군데 수, 전통 뼈 제거 반대 주 창 최적의 수 전에 치료 해야 windows3군데.
이 기술은 공부 경질 아래 혈관에 혈액의 흐름에 변경 적용할 수 있습니다. 중요 한 미래 연구는 두개골 창의 다른 방법으로 벡터의 immunoreactivity를 비교 하는. 이 경우 벡터 기존의 방법에 비해 적은 염증 생성을 결정 하는 중요 한 것입니다. 여기 문서화 압 전 수술 방법 더 많은 연구소 두개골 windows 수행 하 고 성공적으로 다에서 vivoimaging을 사용 하면 노력 하겠습니다.
실제 일정 한 속도로 관개 되는 handpiece 가장 낮은 설정에 진동으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 실제를 지속적으로 적용 한다 얼음 감기 또는 그것 열 것 이다 고 경질 손상. 우리는 적어도 1 mL/분 주사기를 사용 하거나, 손에서 개최 하거나 내장 관개 보다는 연동 펌프를 사용 하 여 핸드 피스에서의 실제를 적용 해야 합니다 발견. 핸드 피스에서 관개 시스템 실제 너무 강제로 배출 하 고 가시성을 크게 저하 됩니다 너무 많은 난 기류 생산.

두개골 창 수술 다 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 설치류를 준비 하는 신경 과학에 있는 중요 한 기술 되었다. 제거 또는 뼈의은 multiphoton 현미경 광학 이미징에 대 한 마우스를 준비 해야 합니다. 이 수술은 완전히 노출 기본 경질1, 뼈의 영역을 제거 하거나 경질2에서 완전 제거 하지 않고 뼈의 영역을 숱이 수행 됩니다. 얇은 두개골 접근 적은 염증과 microglia3 의 활성화를 생산 수 있습니다 하지만 이미지, 작은 이미지 창 크기 (200 µ m)와 제한 된 기간 동안 창 때문에 뼈 자라나2 군데 수의 얕은 깊이 제공 한다 . 광택 및 강화 유리 창 (포트)의 추가 영상 크기 및 영상 기간을 증가 시킬 수 있습니다 하지만4를 수행 하기가 어렵습니다.
모두 현재 수술 얇은 또는 두개골에서 뼈를 제거 하는 고속 회전 드릴을 사용 합니다. 얇은 두개골 기술 또한 더 얇은 뼈2훈련 후 메스를 사용 합니다. 포트 기술은 고속 연마 모래4의 추가 단계를 해야 합니다. 고속 회전 드릴, 공기 구동 터빈 또는 전기 모터는 빠른 속도로 회전 하는 드릴 비트를 발생 합니다. 로타리 드릴 섹션 뼈와 연 조직, 경질을 손상 하 고 혈관을 기본의 위험이 있다. 수술의 성공 여부는 의사의 기술에 따라 달라 집니다. 이 창은 기계 수술 방법으로 준비, 뿐만 아니라 광학 지우고 다른 솔루션으로 두개골의 화학 방법은 개발된5,6되었습니다. 그러나, 압 전 수술 수술의 기계적 방법 이기 때문에, 여기에 우리의 비교 다른 기계적인 방법으로 제한 될 것입니다.
압 전 수술 장치 없이 손상 기본 부드러운 조직, 광물 화 된 뼈를 뜨 초음파 진동을 이용 하 고 따라서 빠르게 얇은 뼈의 큰 지역에 대 한 접근을 제공. 압 전 외과 핸드 피스에서 터빈은 세라믹 디스크의 더미로 대체 하 고 전류를 적용 하는 경우 디스크 초음파 주파수에서 진동. 진동은 뼈 손상 부드러운 조직 없이 조직 형식 간의 차별 하지 않는 회전 훈련 이점을 통해 잘라 코팅된 팁 다이아몬드를 핸드 피스를 통해 전송 됩니다. 압 전 수술 토마 소 Vercellotti에 의해 인간의 사용을 위해 원래 개발 되었다 고 치과에 개선과 cranio-maxilofacial 수술7,,89,10,11 주도하 고 있다 .
압 전 수술 Wistar 쥐에는 뼈를 만드는 데 사용 되었습니다 그리고 자기 공명 영상 (MRI)와 전통적인 치과 드릴12보다 훨씬 적은 피해를 생산 하는 조직학 발견 됐다. 저자 압 전 수술 소프트 뇌 조직 근처 뼈를 제거 하기 위한 안전 했다 결론을 내렸다. 그러나 쥐,, 더 쉽게 손상 된 얇은 경질 있고 그 연구는 만성 광 이미징에 대 한 windows를 준비 하지 않았다. 만성 이미징 혈관이 손상 되지 및 창 아래 혈전 형성 하지 않습니다 필요 합니다. 경질에 손상을 염증으로 인해 창에서 클라우드, 리드 microglia 및 반응성 이다의 확산을 활성화 하 고. 여기 우리가 만들 얇은 두개골과 전체 뼈 제거 두개골 windows 만성 이미징에 대 한 적합 한 마우스에 대 한 압 전 수술을 최적화 했습니다. 우리는 두개골 창 수술 고속 회전 드릴 준비를이 수술 기법을 비교.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP 모델은 동일한 설정을 가지고 있습니다</td></tr><tr><td>: 원형 4mm 평면 압전 수술 팁 (# OT11)</td> <td>Mectron</td><td>3370019</td><td>이 팁은 우리 창문에 이상적이었지만 다양한 크기의 다른 많은 팁을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>스테레오택스 프레임</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>마우스 어댑터</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>관개용 연동 펌프.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>관개를 더 쉽게 하고 다른 손을 자유롭게 하여 안정성을 제공합니다. 필요한 경우 주사기로 손으로 관개를 수행 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>경미한 출혈을 즉시 멈추는 것이 중요합니다.</td></tr><tr><td>씨& B 메타본드</td><td>파켈</td><td>S380</td><td>일반 치과용 아크릴보다 훨씬 강합니다.</td></tr><tr><td>인공 뇌척수액 (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube 안과 연고</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima 다광자 현미경</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN 벡터 코어</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

압 전 높은 정확도 osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton 현미경 널리 뉴런에 vivo에서화상 진 찰에 대 한 적응 되었습니다. 반복 된 이미징 두개골 창의 주입 또는 반복 되는 두개골의 숱이 필요 합니다. 두개골 창 수술은 일반적으로 고속 회전 드릴으로 수행 하 고 많은 조사자 섬세 한 경질 및 혈관 손상에서 훈련을 방지 하기 위해 도전 찾으십시오. 광범위 한 훈련 및 연습의 기본 조직에 손상 없이 뼈를 제거 하는 데 필요한 이며 따라서 두개골 창 수술 수 어려운, 많은 시간이 소요 되며 생산 조직 손상. 압 전 수술, 악 안 면 및 치과 수술을 위해 광범위 하 게 사용 되는 부드러운 조직 손상 없이 뼈를 제거 하는 초음파 진동을 활용 합니다. Multiphoton 이미징에 대 한 준비에 쥐에 있는 두개골 창 수술을 개선 하기 위해 압 전 수술을 적용 하는 방법을 개발 했습니다. 우리의 실험실 내 비교 방법을 적은 수술 시간이 필요 회전 드릴으로 두개골 창 수술 보다 경 막 출혈 때문에 합병증의 낮은 평균 속도가지고 찾을.

압 전 수술을 계속 하기 전에 두개골에서 잔여 어떤과 제거 합니다. 일단 두개골은 불투명 하 고 부드러운 (그림 1a), 외과 의사는 압 전 수술을 시작할 수 있습니다. 진동 피 팁과 뼈를 제거, 그것은 얼음으로 두개골을 관개 하는 중요 한 찬 실제. 적절 한 관개 하단 1 m m 팁의 실제 (그림 1b)에 빠져들 때 이루어집니다. 적절 한 관개 없이 뼈가 과열 하 고 두뇌를 손상 것입니다. 두개골은 외과 의사에 의해 선택 원하는 깊이에 박 형 되었습니다, 후 거기 일부 잔여 뼈에 있는 혈관에서 출혈이 있을 수 있습니다. 빠르게 모든 출혈 중단, 콜라겐 거품의 작은 1 m m 조각 적용 하려면 윈도우의 영역을 실제에 배어. 콜라겐 약 30 두개골에 게 s (그림 1c). 콜라겐 거품 제거 후 창이 반투명, 경질에서 혈관의 명확한 시각화 수 있도록 표시 됩니다. 경질 상당한 멍이 없이 그대로 될 것입니다. (그림 1의 d)입니다. 경질 나타나면 빨간색과 염증, 수술 하는 동안 팁에 적용 하는 너무 많은 압력에서 깨진된 혈관으로 인해 높습니다. 새 창을 보호 하 고 만성 이미징에 대 한 준비, 유리 coverslip 지역에 배치 되어야 합니다. 제대로 적용 된 유리 coverslip 됩니다 부드럽게 창 위에 앉아서 영역에 손해를 발생 하지 않습니다. 유리 coverslip 창의 전체를 커버 해야 합니다. 유리 coverslip 두개골에 제대로 적용 되, 창 유리에서 반투명 상태로 유지 됩니다. 경질 모든 혈관 여전히 표시 (그림 1e) 됩니다. 치과 아크릴 영구적으로 두개골의 표면에 고착 하 유리 coverslip 주위 적용 되어야 합니다. 유리 coverslip 가장자리 치과 아크릴 (그림 1 층)에 적용 해야 합니다.
우리 압 전 수술은 일반적으로 전통적인 두개골 창 보다 훨씬 빠르게 수술 (그림 2A) 당 약 10-12 분을 복용 발견. 우리는 또한 발견 했다 경질 멍이 출혈 (그림 2B) 눈으로 관찰로 인해 적은 합병증. 적절히 창 대뇌 피 질의 뉴런 vivo에서 형광 표시기의 multiphoton 이미징을 허용할 것 이다. 우리는 계층 4 대뇌 피 질의 뉴런의 셀 시체에 빨간 칼슘 표시기 JRGECO1a 이미지를 선택 (그림 3A-3B). 우리는 벡터를 사용 하 여 준비 하는 창을 통해 이러한 셀 시체에서 칼슘 과도 관찰 수 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> 그림 1: 압 전 수술. (한) 후 두개골 제대로 준비가 되었습니다 위상에 대 한. 모든 periosteal 조직, 부드럽고 깨끗 한 표면을 떠나는 제거 되었습니다. (b) 진행 중인 위상의 대표 이미지. 하단의 외과 팁 얼음에 빠져들은 진동의 1 m m 감기 실제. 액체는 1 mL/min의 속도로 두개골에 적용 됩니다. 빛 원형 모션 두개골에 적용 되 고 뼈는 초음파 진동을 통해 박 형. (c) 후 두개골 박 형, 콜라겐 거품 1 m m 원형 조각의 실제 뼈에서 어떤 마이크로 물림을 막으려고 창에 허용 하는 감기에 배어. 반투명 경질 (d) A 성공적인 창 그대로 혈관의 모든 표시 됩니다. 저기 보이는 손상 또는 두뇌의 표면에 멍이. (e) 유리 coverslip 뇌의 표면을 보호 하기 위해 창 위에 배치 됩니다. (f) 치과 아크릴 창 유리 coverslip를 영구적으로 해결 하려면 두개골에 적용 됩니다. 규모는 모든 이미지에 1mm를 바.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> 그림 2입니다. 벡터 또는 치과 훈련 성공률의 비교 드릴 수술. 수술 당 (A) 평균 시간 위상에 대 한 치과 드릴 수술 보다 더 낮 았다 (p < 0.05, 두 꼬리 t 테스트) n = 그룹 당 30 수술 및 외과 의사 당 10 수술 평균. (B) 성공적인 수술 (350 X 확대/축소를 설정 하는 목표를 통해 외과 의사의 눈으로 관찰 경질 출혈 또는 보이는 손상으로 정의)의 비율 보다 더 높았다 위상에 대 한 치과 드릴 수술 (n = 30 수술 각 그룹에 대 한 하나 꼬리 z 테스트)입니다. 오차 막대 표시 sd.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> 그림 3입니다. Vivo에서 두개골 창을 통해 이미징 다 PHASOR thinned. 과도 빨간 칼슘 표시기 JRGECO1a 관찰 했다 murine 모터 피 질 vivo에서 계층 4 피라미드 뉴런에서 몇 군데는 (A) 칼슘 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 같은 창 하지만 레이어 4 모터 코르 텍 스의 다른 지역. Headfixed 마우스 3 m m 창 위상으로 준비 합니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 군데 multiphoton 현미경, 40 X 목표, 1040 nm 여기 파장.

압 전 수술 개선 인간의 악 안 면 및 치과 수술을 주도하 고 있다. 우리는 쥐에 두개골 창 수술에 대 한 압 전 수술을 최적화 하기 위해 프로토콜을 개발 했습니다.

압 전 높은 정확도 Osteal 제거 수술 (위상): 쥐에 향상 된 두개골 창 수술 기법

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

이 수술 절차의 전반적인 목표는 하부 조직을 손상시키지 않고 두개골을 얇게 만들어 영상 촬영에 적합한 크레이니얼 윈도우(cranial window)를 이식하는 것입니다. 이 방법은 기존의 크레이니얼 윈도우 수술법을 개선한 것이며, 더 많은 외과의가 이 기술을 수행할 수 있게 해줍니다. 이 기술의 주요 장점은 수술 시간을 단축하고 평균 합병증 발생률을 낮출 수 있다는 점입니다.수술을 시작하기 전, 멸균 상태를 보장하기 위해 사용할 모든 기구가 오토클레이브(autoclave) 처리되었는지 확인하십시오. 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 마취합니다. 안구 건조를 방지하기 위해 눈에 동물용 안구 윤활제를 도포하십시오.그다음, 뒷발가락을 집어 마취 깊이가 적절한지 확인합니다. 이어서 제모 젤을 3분간 도포하여 두피의 털을 제거합니다. 그 후 마취된 마우스를 38 °C로 설정된 가열 패드 또는 보정된 온수 순환 담요 위의 정위 고정 장치에 배치합니다.마취제를 투여하는 마스크가 적절하게 배치되었는지 확인합니다. 수술 전 진통을 위해 부프레노르핀(buprenorphine)을 피하 주사합니다. 그런 다음, 면봉을 사용하여 클로르헥시딘 또는 베타딘과 70% ethanol을 번갈아 가며 세 번 도포하여 두피를 소독합니다.마지막으로, 국소 마취를 위해 생리식염수로 50% 희석한 bupivacaine 100 µL를 두피 아래에 주입합니다. Piezoelectric 수술 장치의 핸드피스에 4 mm 멸균 원형 팁을 장착합니다. 팁의 크기가 크면 전체 윈도우를 동시에 얇게 만들 수 있어 수술 속도를 높이는 데 도움이 됩니다.피에조 전기 수술 장치의 진동 설정을 가장 낮게 설정하십시오. 설정값이 높을 경우 강한 진동으로 인해 혈관이 파열될 수 있습니다. 10-milliliter 주사기에 얼음처럼 차가운 ACSF를 채우고 피에조 핸드피스를 잡지 않은 손으로 잡으십시오. 진동하는 수술 팁을 가벼운 원형 동작으로 두개골에 부드럽게 대고, 뼈를 원하는 깊이까지 얇게 깎아 박벽 두개골 준비(thin-skull preparation)를 수행하십시오.고주파 진동으로 인한 과열을 방지하기 위해 주사기로 ACSF를 분당 1mL의 속도로 두개골에 떨어뜨려 세척합니다. 두개골에 압력을 가하면서 핸드피스의 각도를 부드럽게 조절하고 팁의 각도를 변경하여 두개골을 균일하게 얇게 만듭니다. 창의 특정 섹션이 과도하게 얇아지지 않도록 주의하십시오.두개골을 균일하게 얇게 만들기 위해 핸드피스의 각도를 조심스럽게 조절하십시오. 뼈를 과도하게 제거하여 하부 조직이 손상되는 것을 방지하기 위해 두개골 상태를 정기적으로 확인하십시오. 차가운 ACSF에 적신 1mm 두께의 지혈용 콜라겐 폼 조각을 노출된 경막 위에 배치하십시오.미세 출혈이 발생하는 것을 방지하기 위해 경막 위에 약 30초 동안 그대로 둡니다. 얇아진 창 위에 4mm 유리 커버슬립을 측면으로 배치한 후, 작은 플라스틱 또는 나무 면봉의 뒷부분을 사용하여 창의 모서리에 시아노아크릴레이트 접착제를 약 한 방울 도포합니다. 그다음 핀셋 끝을 사용하여 커버슬립이 두개골과 밀봉되었는지 확인합니다.마지막으로, 윈도우를 고정하기 위해 두개골에 치과용 아크릴 100 µL를 추가합니다. 치과용 아크릴이 아직 말랑말랑할 때, 부러진 나무 어플리케이터의 끝을 사용하여 이미징 윈도우를 가리는 치과용 아크릴을 밀어냅니다. 완료되면 마우스를 수술 장치에서 분리하여 회복을 위해 가온 케이지에 넣습니다.정상적인 가동성, 보행 및 행동으로 평가하여 마우스가 완전히 의식을 회복할 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 활동량 감소, 그루밍, 음식 및 물 섭취 감소, 보호 행동 또는 공격성 증가를 포함한 수술 후 통증 징후가 있는지 3일 동안 하루에 두 번 동물을 평가하십시오. IACUC 프로토콜에서 승인된 바에 따라 수술 후 8~12시간부터 3일 동안 진통제인 buprenorphine을 피하 투여하십시오.창 영역에 이개, 염증 및 감염 징후가 있는지 모니터링하십시오. 적색 칼슘 지표인 jRGECO1a로 관찰된 칼슘 일시 변화는 PHASOR로 제작된 3mm 창이 설치된 두부 고정 마우스의 운동 피질 4층 순수 중간 뉴런에서 촬영되었습니다. 이 이미지는 동일한 창을 통해 촬영되었으나, 운동 피질 4층의 다른 영역을 보여줍니다.여기서 보는 바와 같이, 수술당 소요 시간은 PHASOR가 치과용 드릴 수술보다 짧았으며, 양측 T-검정(two-tailed T-test) 결과 P < 0.05로 통계적 유의성이 나타났습니다. 출혈이 없거나 경막에 가시적인 손상이 없는 것으로 정의된 수술 성공률은 단측 Z-검정(one-tailed Z-test)으로 평가했을 때 PHASOR가 치과용 드릴 수술보다 높았습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 10분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 따라 다광자 이미징을 포함한 다양한 생체 내(in vivo) 이미징 방법을 수행하여 뉴런을 생체 내에서 시각화할 수 있습니다. 시청해주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

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우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

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