면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

면역형광 현미경 검사의 일반적인 문제는 신호를 방해할 수 있는 내인성 배경 형광의 존재입니다. 대부분의 경우 이 자가형광으로 인해 결과를 해석할 수 없게 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 상업용 LED 데스크 램프를 사용한 광표백을 사용하여 인간 뇌 조직 샘플에서 자가형광을 제거하는 방법을 보여줍니다.

이 방법의 주요 장점은 효과를 희생하지 않고 현재 기술에 비해 상당한 비용 절감 효과와 외인성 화합물이 샘플에 도입되지 않는다는 것입니다. 시작하기 전에 1회 트리스 완충 식염수, TBS 및 10% 아지드화나트륨의 원액을 준비하십시오. 처리하려는 표준 크기 현미경 슬라이드 3개마다 100mm x 100mm 정사각형 페트리 접시 하나가 슬라이드 챔버로 필요합니다.

각 슬라이드 챔버에 대해 TBS의 1회 50밀리리터에 10%아지드나트륨 25밀리리터를 추가하여 TBS에서 05%아지드화 50밀리리터를 준비합니다. 램프 헤드가 아래에 들어갈 수 있도록 슬라이드 챔버를 높이는 비계를 만듭니다. 100mm 정사각형 페트리 접시의 경우 비슷한 크기의 플라스틱 식품 용기를 모양에 맞게 자를 수 있습니다.

빛이 샘플에 도달하는 것을 방해하지 않고 슬라이드 챔버를 안전하게 들어 올릴 수 있는 모든 것을 사용할 수 있습니다. 백색 형광체 LED 데스크 램프를 구입하고 광원을 덮고 있는 디퓨저나 불투명 플라스틱을 제거합니다. LED 어레이를 위쪽으로 향하게 합니다.

이를 위해 유연한 목이 있는 램프를 사용하는 것이 좋습니다. 슬라이드 챔버와 비계를 알루미늄 호일로 덮을 수 있을 만큼 충분히 큰 상자 내부를 조명하여 장치의 반사 돔 덮개를 구성합니다. 단일 챔버의 경우 1mm 피펫 팁 상자를 사용할 수 있습니다.

이 비디오에서는 포르말린이 고정된 인간 FTLD-T 안와 전두회(orbital frontal gyri) 뇌 조직을 광표백 전처리 했습니다. 조직 준비 및 아미노 염색 절차는 조직 절편의 출처, 고정 및 삽입에 따라 달라질 수 있습니다. 섭씨 4도의 냉장실, 냉장 캐비닛 또는 냉장고에서는 램프를 비계 아래에 놓고 샘플 챔버를 비계 위에 놓습니다.

시료 챔버에 50ml의 아지드 TBS를 채웁니다. 깨끗한 집게를 사용하여 표준 유리 현미경 슬라이드에 장착된 10마이크로미터 두께의 조직 절편을 시료 챔버에 담그십시오. 반사 돔으로 장치를 덮고 LED 램프를 켭니다.

샘플을 48시간 동안 광표백제에 담가둡니다. 이 배양 시간은 램프 강도와 조직 내 자가형광 물질의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 광표백 전처리 후, 슬라이드는 관심 있는 특정 조직 및 단백질에 대한 표준 프로토콜로 면역 염색할 수 있습니다.

시연을 위해 FTLD-T 뇌 조직을 Alexa 488 및 Texas Red에 접합된 2차 항체를 사용하여 인산화된 타우로 염색했습니다. DAPI는 핵 대조염색으로 사용되었습니다. 항원 회수 완충액 500ml, TBS의 0.025%Triton X-100 500ml, TBS의 1% 소 혈청 알부민(BSA) 10ml, BSA TBS에 염소 혈청을 첨가한 차단 용액 2ml를 준비합니다.

광표백된 슬라이드를 슬라이드 수집기의 항원 회수 버퍼에 담궈 항원 회수를 수행합니다. 수집기를 섭씨 90도에서 30분 동안 가열합니다. 수집기가 열처리에서 제거되면 챔버를 실온에서 30분 동안 냉각시키는 것이 중요합니다.

슬라이드를 즉시 제거하면 섹션이 건조해집니다. 제조업체 권장 사항에 따라 기본 항체 혼합물을 준비합니다. 이 경우, 항인산 PHF 타우 p-세린 202와 트레오닌 205 AT8 항체를 BSA TBS로 100분의 1 희석하여 얼음 위에 방치했습니다.

섹션당 150마이크로리터의 항체 혼합물이 필요합니다. 절편을 30분 동안 냉각시킨 후 항원 회수 수집기에서 슬라이드를 TBS Triton으로 채워진 염색 용기로 옮깁니다. 이 용액에 담긴 슬라이드를 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.

TBS Triton을 비우고 교체하여 이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 세척 후 염색 용기에서 슬라이드를 제거하고 여분의 완충액을 흡수하십시오. 소수성 펜을 사용하여 조직 주위에 윤곽을 그립니다.

이렇게 하면 솔루션이 슬라이드에서 벗어나는 것을 방지할 수 있습니다. 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 슬라이드에 200마이크로리터의 차단 용액을 피펫팅하여 조직을 차단하고 가습 챔버 내부에 놓습니다.

이 챔버는 젖은 종이 타월이 들어있는 피펫 팁 상자 내부의 슬라이드 랙과 같은 간단한 것일 수 있습니다. 전체 조직 샘플이 차단 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

흡입기 또는 피펫으로 막힌 용액을 제거합니다. 100 - 150 마이크로리터의 1차 항체 혼합물을 슬라이드에 피펫팅합니다. 전체 샘플이 항체 용액으로 덮여 있고 항체가 고르지 않게 풀링되지 않도록 섹션이 평평한 표면에 유지되는지 확인합니다.

1차 항체와 함께 섭씨 4도의 온도에서 가습된 챔버에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날, 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 이 경우, 염소 안티-마우스 Alexa 488 및 염소 안티-마우스 텍사스 레드를 BSA TBS를 사용하여 1/100로 희석하였다.

조직 절편을 회수하고 흡인기 또는 피펫으로 1차 항체 용액을 제거합니다. 이전과 유사한 방식으로 슬라이드를 두 번 세척하고 TBS Triton으로 채워진 염색 용기를 사용하여 세척할 때마다 5분 동안 세척합니다. 세척 후에는 여분의 버퍼를 흡수하십시오.

100 - 150 마이크로리터의 2차 항체 용액을 피펫으로 분사하여 조직 샘플이 완전히 덮이도록 다시 한 번 보장합니다. 어두운 곳에서 가습된 챔버에서 실온으로 2시간 동안 배양합니다. TBS에서 제조업체 권장 사항 또는 연속 희석에 따라 밀리리터당 0.1마이크로그램의 DAPI 카운터스테인을 준비합니다.

불용성 가능성이 있으므로 DAPI 원액을 완전히 혼합하십시오. 슬라이드를 회수하고 2차 항체 혼합물을 제거합니다. 샘플을 두 번 세척하되 TBS Triton을 사용하는 대신 일반 TBS를 사용합니다.

흡입 또는 피펫으로 남은 세척 용액을 제거하고 100-150마이크로리터의 DAPI 얼룩을 조직 섹션에 피펫팅합니다. 실온에서 10분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 샘플을 회수하고 일반 TBS로 2회가 아닌 3회 세척합니다.

세척 후 남은 세척액을 조심스럽게 제거하십시오. 장착 매체를 적용합니다. 유리 커버 슬립으로 샘플을 덮어 슬라이드 장착을 완료합니다.

덮개의 한쪽 가장자리를 아래로 밀어 넣고 집게를 사용하여 반대쪽 가장자리를 매우 천천히 내려 거품을 피하십시오. 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 보관하기 전에 장착 매체를 건조시키십시오. 이제 슬라이드를 시각화할 준비가 되었습니다.

형광 현미경 검사의 설정은 염색에 사용되는 형광단과 현미경에 따라 다릅니다. 형광 램프, 현미경 및 컴퓨터를 켜고 램프를 15분 동안 예열합니다. 염색된 조직 슬라이드를 형광 현미경에 놓습니다.

명시야를 사용하여 10배 배율로 조직을 찾습니다. 조직의 적절한 부위를 찾으면 샘플의 커버 슬립 위에 물 한 방울을 추가합니다. 20배 침수 렌즈로 전환하십시오.

최상의 신호를 위해 별도의 트랙에서 각 형광단에 적합한 laser excitation 및 emission 파장을 선택합니다. 사용된 설정 및 파장에 대한 자세한 내용은 함께 제공된 원고에서 확인할 수 있습니다. 레이저 출력 및 게인 설정을 조정하여 각 트랙의 신호 강도를 최적화합니다.

적절한 설정과 시야각을 찾으면 각 트랙의 형광 데이터가 포함된 복합 이미지를 저장합니다. 각 채널의 형광 강도를 시각화하려면 ImageJ용 RGB 프로파일 도구 매크로를 설치하십시오. ImageJ에서 lsm 컨포칼 이미지 파일을 열고 Image, Color, Channel Tool로 이동하여 세 스택의 합성 이미지를 RGB로 변환합니다.

컴포지트를 선택하고 세 채널을 모두 확인합니다. 그런 다음 이미지, 유형 및 RGB 색상으로 이동합니다. RGB 프로파일 도구 아이콘을 선택하고 프로파일링할 이미지의 섹션을 가로질러 선을 그립니다.

이 비디오에서는 배경 형광을 생성하기 위해 조직 샘플의 광표백 전처리를 수행하는 단계에 대해 설명했습니다. 이 절차는 항원 검색 및 아미노 염색 전에 모든 표준 아미노 형광 프로토콜에 추가할 수 있습니다. 광표백에 사용되는 장치는 저렴하고 쉽게 구할 수 있으며 기성품으로 구성되어 있습니다.

백색 형광체 LED는 광범위한 파장에 걸쳐 빛을 방출하므로 광범위한 광표백에 매우 적합합니다. 쉽게 구할 수 있는 LED 데스크 램프를 사용하여 염색되지 않은 인간 FTLD-T 뇌 조직 샘플을 광표백하고 이러한 샘플이 Texas Red 및 Alexa 488로 염색된 경우 적절한 파장을 사용하여 이미지화했습니다. 처리되지 않은 샘플은 많은 양의 자가형광을 나타냈습니다.

대조적으로, 광표백은 리포푸신(lipofuscin)과 유사한 자가형광 반점의 강도를 크게 감소시켰을 뿐만 아니라 일반적인 배경 형광을 제공했습니다. 이 기술의 추가 검증을 위해 FTLD-T 뇌 조직 샘플을 염색하여 이 질병에서 별개의 봉입체로 잘못 접히고 축적되는 단백질인 과인산화된 타우(hyperphosphorylated tau)를 찾았습니다. 타우 라벨링과 비특이적 형광을 더 잘 구별하기 위해 두 가지 다른 2차 항체를 적용했습니다.

이 복합 이미지에서 Alexa 488과 Texas Red의 공동 국소화는 노란색으로 표시되며, 이는 올바르게 염색된 타우 단백질을 나타냅니다. 빨간색 또는 녹색 영역의 출현은 비특이적 형광 또는 발색단 중 하나의 담금질을 나타냅니다. 처리되지 않은 대조군 샘플에서는 특히 Texas Red 채널에서 유의미한 배경 및 비특이적 신호를 볼 수 있습니다.

광표백 전처리와 화학적 소광제의 적용은 모두 배경 신호를 크게 감소시킵니다. 형광 채널을 분할하고 더 높은 배율로 이미지를 보면 더 자세한 관찰을 할 수 있습니다. 처리되지 않은 대조군은 모든 채널에 걸쳐 배경 형광을 가지고 있을 뿐만 아니라 주로 Texas Red 채널에서 타우 특이적 라벨링과 유사한 강도를 갖는 비특이적 특징을 가지고 있습니다.

타우 봉입체가 뚜렷하고 예측 가능한 형태를 가지고 있지 않다면, 이러한 자가형광 특징의 존재로 인해 이러한 텍사스 레드 결과가 잘못 해석되었을 수 있습니다. 광표백 전처리는 이러한 텍사스 레드의 비특이적 특징을 완전히 제거하면서 대부분의 타우 특이적 텍사스 레드 및 알렉사 488 신호를 보존합니다. 그러나 광표백은 DAPI 배경 형광에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.

화학적 소광제는 광표백만큼이나 효과적으로 Alexa 488 채널의 배경 형광을 감소시켰습니다. 그러나 그것은 또한 DAPI와 Texas Red의 형광 강도를 감소시켜 일부 비생산적인 담금질의 존재를 시사합니다. 이러한 효과의 정량화는 신호 프로필에서 확인할 수 있습니다.

보시다시피 이 방법은 혼동되는 기능이 없는 깨끗한 이미지를 생성합니다. 이 광표백 전처리는 모든 표준 아미노 형광 프로토콜에 통합되어 자가형광을 제거하고 고품질의 명확한 결과를 생성할 수 있습니다.