Name: 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: 배우세요 면역형광현미경에서 배경 자가형광을 제거하는 비용 효율적인 방법을 LED 광표백을 사용하여 인간 뇌 조직의 자가형광을 효과적으로 감소시키고 명확한 이미징 결과를 얻는 기술입니다.

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이 연구는 캐나다 컨소시엄 Neurodegeneration 에이징 (CCNA)는, 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR), 캐나다 (ALS 캐나다), ALS 협회와 캐나다 (ASC)의 알 츠 하이 사회에 의해 전체 또는 일부를 지원 했다. 저자 술탄 Darvesh와 해상 뇌 조직 은행에서 FTLD 뇌 조직을 제공 하기 위한 Spatio 시간적 타겟팅 및 증폭 방사선 응답 (STTARR) 프로그램와의 제휴에서 밀라노 Ganguly 앤드류 리드 감사 하 고 싶습니다. 기관 조직 포함 및 서비스, 그리고는 고급 광학 현미경 시설 (AOMF) 현미경 계기를 제공 하기 위한 단면에 대 한 자금. 케빈 해 들 리 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사입니다.

참고: 국제 회의에 조화 (ICH), 위원회에 대 한 국제 단체의 의료 과학 (CIOMS)를 포함 하 여 인식된 국제 표준에 따라 제시 하는 작업 수행 그리고 헬싱키 선언 원칙. 인간의 조직의 사용 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회의 승인을 했다. 인간의 두뇌 샘플 해상 뇌 조직 은행의 일환으로 수집 되었습니다. 수집 시 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
 1. photobleaching 장치 및 솔루션의 건설 <ol><li>준비 재고 솔루션.
	<ol><li>8.77 g NaCl의 그리고 트리 스의 6.06 g을 용 해 하 여 재고 Tris 버퍼 식 염 수 (1 x TBS) 솔루션 (150 m m NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) x 1의 준비 1 L ddH 2 O의 800 mL에서 기지 고 HCl. 1 L와 오토 클레이 브에 볼륨을 가져오기를 사용 하 여 7.4에 pH를 조정. < / 리 > <li>1 g의 나트륨 아 지 드 (10%, 200 x 재고) ddH 2 O 10 mL에 용 해 하 여 10% (200 x 주식) 나트륨 아 지 드를 준비.</li>
	</ol></li> <li>1-3 표준 크기 슬라이드, 슬라이드 챔버로 단일 100 mm x 100 mm 투명 하 고, 광장 페 트리 접시를 사용. 단일 슬라이드 챔버에 대 한 0.05% 아 지 드-TBS 솔루션 1 x TBS의 50 mL를 200 x 나트륨 아 지 드 재고의 0.25 mL를 추가 합니다. 2-3 슬라이드 챔버 추가 슬라이드를 처리 하는 데 세로로 스택. 아 지 드 TBS 솔루션의 추가 50 mL 각 챔버에 대 한 준비.</li>
	<li>그런 램프 머리 아래 들어갈 수 있는 슬라이드 chamber(s) 상승 발판을 만듭니다.
	<ol><li>는 100 x 100 mm 슬라이드 챔버, 하단에는 100 x 100 mm x 30 mm 플라스틱 음식 컨테이너의 측면 구멍 고 컨테이너 반전. 측면 구멍 하는 LED 광원에 맞게 하단 오프닝 충분히 큰 광원에서 빛 장애 없이 샘플 챔버에 도달 되도록 충분히 큰 확인 하십시오.</li>
		<li>비 계 발판 및 샘플 챔버/벤치탑 사이 그립을 증가 전기 테이프를 적용 됩니다. 어떤 대체 물질을 사용 하 여 너무 오랫동안 안전 하 게 샘플을 도달에서 빛을 방해 하지 않고 슬라이드 챔버를 끌어올리고 발판을 생성.</li>
	</ol></li> <li>직접 도달 하는 샘플 (가능한 경우)에서 LED 빛을 방해 수 있는 LED 어레이 위쪽으로 방향을 책상 램프 디퓨저 또는 불투명 플라스틱을 제거. 비 계 및 슬라이드 chamber(s) LED 어레이 위에 놓습니다. 유연한 목 램프를 사용 하 여 쉬운 조작을 위한.</li>
	<li>구문 반사 돔 줄 상자 슬라이드 챔버와 비 계 알루미늄 호 일 수의 내부 장치에 대 한 커버. 사용 하 여 1 mL 피 펫 팁 상자 단일 챔버에는 150 x 150 mm x 150 mm 골 판지 상자, 다중에 대 한 수직으로 쌓아 챔버.</li>
</ol> 2. Photobleaching 조직 단면도의 전처리 참고: 조직 섹션 준비 조직 및 고정 방법을 사용을 포함의 소스에 따라 다를 수 있습니다. 여기, FTLD T의 경우에서 뇌 조직 (orbitofrontal gyri) ~ 2 일 말린, 자당 그라디언트를 통해 실행, 10 월에 고는 cryostat를 사용 하 여 10 µ m 두꺼운 섹션을 잘라 고정.
<ol><li>는 4 º C 찬 방, 찬 장, 또는 냉장고, 발판 아래 램프 방향을 지정 하 고 발판에 샘플 챔버를 놓습니다. 시료 챔버에 아 지 드 TBS 솔루션 50 mL를 붓고.</li>
	<li>Submerge 조직 섹션 표준 유리 현미경 슬라이드를 포함 하는 아 지 드-TBS 청소 집게를 사용 하 여 슬라이드 챔버에 장착. 여러 슬라이드, 슬라이드는 단일 레이어에 챔버에 배치 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>반사 돔과 기구를 커버, LED 램프 켜고 4 º C에서 48 h에 대 한 품 어.</li>
</ol> 3. 면역 형광 검사 <ol><li>얼룩 phosphorylated 타우 DAPI counterstain와 알 렉 사 488-및 텍사스 레드 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여에 대 한 조직, 먼저 항 원 검색, permeabilization, 차단, 그리고 기본에 대 한 솔루션을 준비 하 항 체 바인딩입니다.
	<li>항 원 복구의 준비 500 mL <ol>버퍼 (10 m m 구 연산, 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산, 0.05% 트윈 20, pH 6.2) 0.92 g의 연산 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) ddH 2 O. 조정 산도의 500 ml의 0.37 g을 용 해 하 여 NaOH와 6.2를 트윈 20의 0.25 mL을 추가.</li>
		<li>0.025%의 500 mL를 준비 Triton X-100 Triton X-100의 0.125 mL 500 mL 1 추가 하 여 TBS 솔루션 (TBS-트리톤)에 tbs. x</li>
		<li>준비에 TBS (BSA TBS 버퍼) 0.1 g 10 ml tbs. BSA를 용 해 하 여 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션</li>
		<li>차단 솔루션을 준비 하는 1%의 1.8 mL를 정상 염소 혈 청의 0.2 mL를 추가 하 여 BSA/tbs.</li>
		<li>각 슬라이드에 대 한 안티-인-PHF-타우 pSer202 + Thr205의 pipetting 1.5 µ L에 의해 1 차적인 항 체 솔루션 (1: 100 희석)의 150 µ L 준비 1% BSA TBS 버퍼 및 얼음에의 148.5 µ L에 항 체 (AT8)</li>
	</ol></li> <li>항 원 복구를 수행 하려면 antigen 검색 버퍼의 25 mL를 포함 하는 슬라이드 수집기에 세로로 photobleached 슬라이드 잠수함. 컬렉터 물 목욕으로 빠지지 않는 그런 테이프 또는 문자열 수집기를 보호 합니다. 30 분 동안 90 ° C에 물 목욕에서 수집기가 열 하 고 슬라이드를 제거 하기 전에 30 분 동안 실내 온도에 냉각 수집기를 허용. 그것으로 즉시 슬라이드 섹션을 밖으로 건조 하면 제거 하지 마십시오.</li>
	<li>는 TBS 트리톤의 30 mL 가득 얼룩 항아리에 항 원 검색 수집기에서 슬라이드를 전송 하 고 부드러운 떨고와 궤도 통에 5 분에 대 한 섹션을 씻어. 신선한 TBS-트리톤으로 한번 세척을 반복 합니다. 윅 보풀 조직과 개요 소수 성 펜으로 조직으로 멀리 초과 버퍼입니다. 알아서 하지 슬라이드 밖으로 건조 하 게.
	<ol><li>각 슬라이드에 대 한 조직 pipetting 200 µ L 조직에 솔루션을 차단에 의해 차단 및 습도 챔버에 슬라이드를 배치. 젖은 종이 수건을 포함 하는 피 펫 팁 상자 안에 슬라이드 랙 배치 하 여 챔버를 구성 합니다. 2 h 평면에 대 한 실 온에서 품 어. 차단 솔루션 완전히 조직을 포함 하는 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 차단 솔루션을 제거 하 고 조직에 1 차적인 항 체 솔루션의 100-150 µ L 플라스틱. 충분 한 양의 항 체는 1 개의 측에 항 체 솔루션의 풀링 하지 않으려면 레벨 표면에는 구역 확인 합니다. 습도 챔버에 하룻밤 4 º C에서 품 어.</li>
	<li>이차 항 체 혼합물과 DAPI 핵 counterstain 준비.
	<ol><li>각 슬라이드에 대 한 염소 반대로 마우스 알 렉 사 488의 1.5 µ L과 염소 반대로 마우스 BSA TBS의 147 µ L 텍사스 레드의 1.5 µ L을 추가 하 여 이차 항 체 혼합물 (1: 100 희석)의 150 µ L를 준비 하 고 얼음에</li>
		<li>준비 0.1 µ g/mL DAPI 직렬 희석에 의해 counterstain. 재고 솔루션을 철저 하 게 혼합 하 고 재고 5 mg/mL DAPI에서 5 µ g/mL 해결책의 1 mL를 만들려고 TBS의 999의 1 µ L를 희석. 각 슬라이드에 대 한 희석 3 μ0.1 µ g/mL의 최종 농도에 TBS의 147 µ L 5 µ g/mL 해결책의 L. 
		주의: DAPI 알려진된 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 합니다.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 1 차적인 항 체를 제거. TBS-트라이 톤의 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척 30 mL를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리에서 슬라이드 잠수함 신선한 TBS-트리톤와 세척 단계를 반복 합니다. 멀리 초과 TBS 트리톤 심지 하 고 각 슬라이드에 이차 항 체 혼합물의 100 ~ 150 µ L 플라스틱.
	<ol><li>확인 조직 항 체 혼합물에 의해 완전히 덮여 있다. 어둠의 습도 챔버에 실 온에서 2 h에 품 어.</li>
	</ol></li> <li>포부에 의해 이차 항 체 혼합물을 제거 하 고 슬라이드 유리 얼룩 TBS (트리톤) 30 mL를 포함 하는 항아리로 전송. 궤도 셰이 커에 부드러운 혼합으로 5 분 동안 세척. 신선한 tbs.와 세척 단계 각 슬라이드에 0.1 µ g/mL DAPI counterstain의 100 ~ 150 µ L을 적용 하 고 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 품 어 반복.</li>
	<li>는 TBS를 포함 하는 항아리를 얼룩 유리 슬라이드를 전송 하 고 5 분 각, 각 세척에 대 한 신선한 TBS를 사용 하 여 부드러운 혼합과 3 번을 씻어. 멀리 초과 버퍼 윅.</li>
	<li>적용 3 방울 수성 장착 매체 조직에의. 집게를 사용 하 여 부드럽게 한 가장자리부터 시작 하 고 천천히 기포의 트랩을 피하기 위해 다른 가장자리를 낮추는 조직에 깨끗 한 유리 coverslip 낮은. 알아서 하지 즉시 이미징 하는 경우는 coverslip를 꺼내. 그렇지 않으면, 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 하기 전에 건조 장착 매체 허용.</li>
</ol> 4. 형광 현미경 검사 법 <ol>형광 램프, 현미경 및 컴퓨터에 <li>차례 15 분 장소 얼룩진된 조직 형광 현미경 단계에서 슬라이드에 대 한 따뜻한 램프를 허용 하 고. 밝은 필드 이미지를 사용 하 여 10 배 확대에 조직 찾습니다.</li>
	<li>DdH 2 O의 드롭 coverslip 표면에 적용 하 고 20 x 물 침수 대물 렌즈를 사용 하 여 (나 = 1.0). 4 라인 평균 비행기 검사 설정을 선택 합니다. 1 공기 단위 ~ 3 미크론의 광학 분할을 주는 작은 구멍 크기를 설정 합니다. 최상의 신호에 대 한 별도 트랙에 각 fluorophore의 레이저 여기 및 방출 파장을 선택 합니다. 
	참고: 알 렉 사 488: ex λ = 488 nm (아르곤 레이저) λ em = 493-570 nm; 텍사스 레드: λ 전 561 = nm (DPSS 561 nm 레이저), λ em 601-635 nm; = DAPI: λ 전 = 405 nm (레이저 다이오드 405), λ em 410-507 nm =.
	<ol><li>레이저 파워를 조정 하 고 각 트랙에 대 한 신호 강도 최적화 하는 설정을 얻을. 합성 이미지를 수집 하 고 저장 합니다. 동일한 레이저 설정을 사용 하 여 다른 슬라이드에 형광 강렬을 비교.</li>
	</ol></li> <li>각 채널에서 형광 강도의 시각화, ImageJ 10 RGB 프로 파일 도구 매크로 설치. 웹 페이지에서 텍스트 파일 (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt)으로 매크로 저장 합니다. ImageJ 메뉴에서 플러그인-선택 &#62; 매크로-&#62; 설치; RGB 프로 파일 도구를 설치 하는 텍스트 파일을 선택 합니다.
	<ol><li>Confocal 이미지 파일 ImageJ 열고 다음을 수행 하 여 rgb 3 스택에서 복합 이미지 변환: 이미지-&#62; 색상-&#62; 채널 도구. 선택 &#34; 복합 &#34; 3 채널 드롭다운 메뉴 및 확인 모든. 그런 다음 이미지-선택 &#62; 타입-&#62; RGB 색상.</li>
		<li>는 RGB 프로 파일 도구 아이콘을 선택 하 고 이미지를 프로 파일링 섹션에서 선을 그립니다. 강도 데이터를 스프레드시트로 저장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

조직의이 원고에 설명 된 photobleaching 전처리 상용 구성 요소를 사용 하 여 autofluorescence의 효과적인 제거 할 수 있습니다. 프로토콜 phosphorylated 타우 포 르 말린 고정 뇌 조직 알 렉 사 488, 핵 counterstain로 DAPI와 텍사스 적색 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 집계의 면역 형광 영상을 설명 합니다. 다른 조직에 메서드를 적용 하려면 시작 지점으로 샘플을 48 h photobleaching 사전 치료를 수행 하는 것이 좋습니다. Photobleaching, 후 표준 면역 형광 항 체 희석 제조업체의 권장 사항에 따라 사용 하 여 관심사의 기능에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지를 수행 합니다. 배경 형광 여전히 있으면 photobleaching 기간 및 단계를 얼룩이 지는 항 체 또는 수정할 필요가 있다. Photobleaching의 기간 램프 기구와 샘플에서 autofluorescence의 수준 선택에 따라 달라 집니다. 각 고유 램프 기구에 대 한 최적의 표백 시간...

형광 현미경 검사 법 특정 단백질을 표적으로 하는 항 체를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양과 조직에 관심사의 단백질을 시각화 하는 데 사용 됩니다. 면역 형광 검사에서 명확 하 고 확실 한 이미지의 인수를 주요 합병증이 발생할 수 있습니다 endogenously 포유류 조직에서 나이 안료 lipofuscin과 단백질 엘라 스 틴과 콜라겐1, autofluorescence 2. Autofluorescence의 다른 소스는 알데하이드 고정3샘플 준비 단계를 통해 소개 될 수 있습니다. Lipofuscin과 립, oxidatively 수정 단백질과 지질 저하 잔류물의 주로 구성 된 긴 살아있는 세포 증가 나이2에 누적 됩니다. 그러면 뇌와 심장이 나 골격 근육, postmitotic 조직 이미징에 어려움 lipofuscin의 형광 방출 스펙트럼은 광범위 하 고 가변, 자주 사용 하는 일반적인 fluorophores의 방출 파장와 동시 4라벨. 이러한 요인 특히 도전 frontotemporal lobar 변성 (FTLD) 늦은 발병 신경 퇴행 성 질병의 경우에서 인간 뇌 조직의 이미지를 확인 합니다.
Autofluorescence를 줄이기 위해, 우리는 우리와 백색 발광 다이오드 (LED) 배열 가구 책상 램프5를 사용 하 여 슬라이드 마운트 조직 단면도 비추는 기법을 고안 했다. 이 간단한 기술은 대안을 암모늄 아세테이트, 또는 냉각 하는 염료 수단 블랙 B 및 Eriochrome 블랙 T6같은 상용 CuSO4 등 화학 quenchers를 사용 하는 기법을 제공 합니다. 그것은 또한 상당한 비용 절약 이상의 multispectral 있다 램프 photobleaching 기술을 주도하 고 합병증과 스펙트럼 취소 혼합7,8같은 디지털 autofluorescence 제거 방법에서 생성 하는 유물을 피 한다. 백색 발광 Led 있다 넓은 방출 스펙트럼, 높은 광도 및 낮은 제조 비용, photobleaching chromophores5,9다양 한에 대 한 상용 부품으로 이상적.
이 프로토콜에 액세스할 수 있는 구성 요소를 사용 하 여 photobleaching 기구 건설을 설명 하 고 FTLD 조직의 phosphorylated 타우에 대 한 항 체 관련을 사용 하 여 타우-긍정적인 포함 (FTLD-T)를 포함 하는 경우에 photobleaching를 적용. 우리 붙일 표시 된 항 체 두 통용 chromophores 채용 이미징에 photobleaching의 효과 보여줍니다: 알 렉 사 488와 텍사스 레드. 치료 섹션 대 photobleaching의 효과 또는 상업적인 화학 끄는 치료는 계량 하 고 비교. 이 photobleaching 전처리 생물학 견본에서 autofluorescence를 제거 하려면 모든 표준 면역 형광 얼룩 프로토콜에 포함 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>콜로라이드 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Caledon 실험실 화학 물질</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>BioShop Canada</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>photobleacher의 모든 구성 요소는 가용성에 따라 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>6 W LED 조광 가능 책상 램프</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>photobleacher의 모든 구성 요소는 가용성에 따라 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2404</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&nbsp;( EDTA)</td><td>BioShop Canada</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>BioShop Canada</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 수집기</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>염색 용기</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td>Bellco Glass</td><td>&nbsp; 7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal 항체 (AT8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse 2차 항체, Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>Glass soverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어 ZEN 2012 Black Edition 11.0</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>소프트웨어는 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB 프로파일 도구 매크로</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>상업용 화학 담금질제</td>와 함께 제공됩니다.<td>비오텀</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

면역 형광 검사 subcellular 구획을 시각화 하 고 조직 샘플 내 특정 단백질의 지 방화를 결정 하는 데 사용 하는 일반적인 방법입니다. 면역 형광 이미지를 높은 품질의 인수에 큰 방해 lipofuscin 같은 노화 안료 또는 알데하이드 고정 등 일반적인 샘플 준비 과정에 의해 발생 하는 조직의 내 생 autofluorescence입니다. 이 프로토콜 배경 형광을 흰색 형광체 발광 다이오드 (LED) 배열 처리 이전 형광 프로브를 사용 하 여 photobleaching를 통해 크게 줄어들 수 있습니다 방법에 대해 설명 합니다. 흰색 형광체의 넓 스펙트럼 방출 Led 방출 봉우리의 범위에 걸쳐 fluorophores의 표백에 대 한 수 있습니다. Photobleaching 장치 매우 낮은 비용에 상용 구성 요소에서 생성 될 수 있습니다 고 상용 화학 quenchers에 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 뒤에 기존의 면역 형광 염색 직물의 photobleaching 전처리 배경 autofluorescence의 이미지를 생성 합니다. 비교 조사 배경 감소는 화학 quenchers 설립을 신호, photobleaching 처리 했다 프로브 형광 강도에 영향을 주지 않습니다 그것은 배경과 lipofuscin 형광을 효과적으로 감소 하는 동안. Photobleaching 전처리에 대 한 더 많은 시간을 필요로, 하지만 높은 휘도 LED 배열 photobleaching 시간을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 이 간단한 방법은 잠재적으로 다양 한 조직, 두뇌 등 lipofuscin 축적 특히 postmitotic 조직 및 심장 또는 골격 근육에 적용할 수 있습니다.

Photobleaching 전처리 단계 직전 항 원 검색 및 immunostaining (그림 1A) 표준 면역 형광 검사 프로토콜을 추가할 수 있습니다. Photobleaching 장치에의 조립 또한 수행할 수 있습니다, 다양 한을 사용 하 여 저렴 한, 상용 구성 요소 (그림 1B). 흰색 형광체의 발광 스펙트럼 Led 이전 보고서 (그림 1C)5,11동의 그들 광범위 한 범위 photobleaching를 위해 적당 한 시키는 파장의 광범위 커버. 48 h photobleaching, 후 유사한 lipofuscin 뿐만 아니라 일반적인 배경 형광 autofluorescent speckles의 강도 FTLD...

생물 학적 샘플의 배경 autofluorescence는 종종 형광 기반 이미징 기술을, 특히 세 인간의 postmitotic 조직에에서 복잡. 이 프로토콜에 설명 합니다이 예제에서 autofluorescence를 효과적으로 제거 될 수 있다 어떻게 photobleach immunostaining 이전 샘플 소스를 상업적으로 사용할 수 있는 발광 다이오드 빛을 사용 하 여.

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

면역형광 현미경 검사에서 흔히 발생하는 문제는 신호를 방해할 수 있는 내인성 배경 형광의 존재입니다. 많은 경우, 이러한 자가형광으로 인해 결과 해석이 불가능해질 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 상용 LED 데스크 램프를 이용한 광퇴색법을 통해 인간 뇌 조직 샘플에서 자가형광을 제거하는 방법을 시연하겠습니다.이 방법의 주요 장점은 효과를 저하시키지 않으면서 현재의 기술보다 비용을 크게 절감할 수 있다는 점과 시료에 외래 화합물을 도입하지 않는다는 점입니다. 시작하기 전에 1배수 tris-buffered saline(TBS) 및 10% sodium azide의 스톡 용액을 준비하십시오. 처리하려는 표준 크기 현미경 슬라이드 3장마다 슬라이드 챔버로 사용할 100 millimeter by 100 millimeter 정사각형 페트리 접시 1개가 필요합니다.각 슬라이드 챔버당, 1배 TBS 50 milliliters에 10% sodium azide 25 milliliters를 첨가하여 05% azide in TBS 50 milliliters를 준비합니다. 램프 헤드가 아래에 들어갈 수 있도록 슬라이드 챔버를 들어 올릴 지지대를 만듭니다. 100 millimeter 정사각형 페트리 접시의 경우, 비슷한 크기의 플라스틱 식품 용기를 모양에 맞게 잘라 사용할 수 있습니다.시료에 도달하는 빛을 방해하지 않으면서 슬라이드 챔버를 안정적으로 높일 수 있는 도구라면 무엇이든 사용할 수 있습니다. 백색 인광 LED 데스크 램프를 준비하고, 광원을 덮고 있는 디퓨저나 불투명한 플라스틱을 모두 제거하십시오. LED 어레이가 위를 향하도록 배치합니다.이를 위해 유연한 넥을 가진 램프를 사용하는 것이 권장됩니다. 슬라이드 챔버와 스캐폴드를 충분히 덮을 수 있는 크기의 상자 내부를 알루미늄 호일로 감싸 장치용 반사 돔 커버를 제작하십시오. 단일 챔버의 경우에는 1 mm 피펫 팁 박스를 사용할 수 있습니다.본 영상에서는 포르말린 고정된 인간 FTLD-T 안와전두회 뇌 조직을 광탈색 전처리에 사용하였습니다. 조직 준비 및 아미노 염색 과정은 조직 절편의 출처, 고정 및 포매 방식에 따라 달라질 수 있습니다. 4 °C 냉장실, 냉장 캐비닛 또는 냉장고 내에서 램프를 스캐폴드 아래에 배치하고 샘플 챔버를 스캐폴드 위에 놓으십시오.샘플 챔버에 azide TBS 50 milliliters를 채웁니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 표준 유리 현미경 슬라이드에 부착된 10 micrometer 두께의 조직 절편을 샘플 챔버에 담급니다. 장치를 반사 돔으로 덮고 LED 램프를 켭니다.시료를 48시간 동안 광퇴색시킵니다. 이 배양 시간은 램프의 강도와 조직 내 자가형광 물질의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 광퇴색 전처리를 마친 후, 해당 조직 및 관심 단백질에 맞는 표준 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 면역염색할 수 있습니다.시연을 위해, Alexa 488 및 Texas Red가 결합된 2차 항체를 사용하여 FTLD-T 뇌 조직의 인산화된 tau를 염색하였습니다. DAPI를 핵 대조염색제로 사용하였습니다. 항원 회복 완충액 500 milliliters, TBS 내 0.025% Triton X-100 500 milliliters, TBS 내 1% 소혈청 알부민(BSA) 10 milliliters, 그리고 BSA TBS에 염소 혈청을 추가하여 만든 블로킹 용액 2 milliliters를 준비하십시오.슬라이드 수집기에 광퇴색된 슬라이드를 항원 회수 완충액에 담가 항원 회수를 수행합니다. 수집기를 90 °C에서 30분 동안 가열합니다. 가열 처리 후 수집기를 꺼낸 다음, 챔버를 실온에서 30분 동안 식히는 것이 중요합니다.슬라이드를 즉시 꺼내면 절편이 건조될 수 있습니다. 제조사의 권장 사항에 따라 1차 항체 혼합물을 준비하십시오. 본 실험에서는 anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 항체를 BSA TBS로 1:100 비율로 희석하여 얼음 위에 보관하였습니다.섹션당 150 µL의 항체 혼합액이 필요합니다. 섹션을 30분 동안 냉각시킨 후, 슬라이드를 항원 회수 수집기에서 TBS Triton이 채워진 염색 용기로 옮깁니다. 이 용액에서 슬라이드를 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.TBS Triton을 비우고 새 용액으로 교체하여 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 세척 후, 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내고 여분의 버퍼를 닦아냅니다. 소수성 펜을 사용하여 조직 주변에 테두리를 그립니다.이렇게 하면 용액이 슬라이드 밖으로 흘러내리는 것을 방지할 수 있습니다. 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 블로킹 용액 200 µL를 슬라이드 위에 피펫팅하여 조직을 블로킹한 후, 습윤 챔버 안에 넣으십시오.이 챔버는 젖은 종이 타월이 들어 있는 피펫 팁 박스 내부의 슬라이드 랙과 같이 간단한 형태여도 무방합니다. 조직 샘플 전체가 블로킹 용액으로 충분히 덮였는지 확인하십시오. 실온에서 2시간 동안 배양하십시오.흡입기 또는 피펫을 사용하여 블로킹 용액을 제거합니다. 1차 항체 혼합액 100~150 µL를 슬라이드 위에 피펫팅합니다. 샘플 전체가 항체 용액으로 덮이도록 하고, 항체가 불균일하게 고이는 것을 방지하기 위해 섹션이 수평면을 유지하도록 합니다.가습 챔버 내에서 4°C로 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음 날, 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 이 경우에는 goat anti-mouse Alexa 488과 goat anti-mouse Texas Red를 BSA TBS를 사용하여 1:100으로 희석하였습니다.조직 절편을 회수하고 흡입기 또는 피펫을 사용하여 1차 항체 용액을 제거합니다. TBS Triton이 채워진 염색 용기를 사용하여 이전과 동일한 방식으로 슬라이드를 2회 세척하며, 각 세척 시간은 5분으로 합니다. 세척 후, 남은 버퍼를 여과지로 닦아냅니다.2차 항체 용액 100에서 150 마이크로리터를 피펫팅하여 조직 샘플이 완전히 덮였는지 다시 한번 확인하십시오. 가습 챔버 내 암조건의 실온에서 2시간 동안 배양하십시오. 제조사 권장 사항 또는 연속 희석법에 따라 TBS에 0.1 마이크로그램 퍼 밀리리터 농도의 DAPI 대조 염색액을 준비하십시오.용해되지 않은 부분이 있을 수 있으므로 DAPI 스톡 솔루션을 충분히 혼합하십시오. 슬라이드를 회수하고 2차 항체 혼합물을 제거합니다. 샘플을 두 번 세척하되, TBS Triton 대신 일반 TBS를 사용하십시오.남은 세척액을 흡입 또는 피펫으로 제거하고, 조직 절편 위에 100에서 150 µL의 DAPI 염색액을 피펫으로 분주합니다. 암실 상태의 상온에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 회수한 후, 이전의 2회 대신 일반 TBS로 3회 세척합니다.세척 후, 남은 세척액을 조심스럽게 제거합니다. 봉입제를 도포합니다. 샘플 위에 유리 커버슬립을 덮어 슬라이드 봉입을 완료합니다.커버슬립의 한쪽 가장자리를 먼저 내려놓고 핀셋을 사용하여 반대쪽 가장자리를 매우 천천히 내림으로써 기포가 생기지 않도록 합니다. 마운팅 용액을 건조시킨 후 4 °C의 암소에 보관하십시오. 이제 슬라이드를 관찰할 준비가 되었습니다.형광 현미경 설정은 염색에 사용된 형광체와 현미경의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 형광 램프, 현미경, 컴퓨터의 전원을 켜고, 램프가 15분 동안 예열되도록 합니다. 염색된 조직 슬라이드를 형광 현미경에 거치합니다.명시야를 사용하여 10배 배율에서 조직의 위치를 확인하십시오. 적절한 조직 영역이 확인되면, 샘플의 커버 슬립 위에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 다음 20배 수침 렌즈로 전환하십시오.최적의 신호를 얻기 위해 각 트랙의 형광체에 적합한 레이저 여기 및 방출 파장을 선택하십시오. 사용된 설정 및 파장에 대한 자세한 내용은 동반된 논문에서 확인할 수 있습니다. 각 트랙의 신호 강도를 최적화하기 위해 레이저 출력과 게인 설정을 조정하십시오.적절한 설정과 시야를 찾으면, 각 트랙의 형광 데이터가 포함된 합성 이미지를 저장하십시오. 각 채널의 형광 강도를 시각화하려면 ImageJ용 RGB Profile Tools 매크로를 설치하십시오. ImageJ에서 lsm 공초점 이미지 파일을 열고 Image, Color, Channel Tool 메뉴로 이동하여 세 개의 스택으로 구성된 합성 이미지를 RGB로 변환하십시오.Composite를 선택하고 세 가지 채널을 모두 체크하십시오. 그다음 Image, Type, RGB Color로 이동하십시오. RGB Profile Tools 아이콘을 선택하고 프로파일링할 이미지 영역을 가로질러 선을 그리십시오.본 영상에서는 배경 형광을 억제하기 위해 조직 샘플에 광퇴색 전처리를 수행하는 단계들을 설명하였습니다. 이 절차는 항원 회복 및 면역 염색 전, 모든 표준 면역 형광 프로토콜에 추가하여 적용할 수 있습니다. 광퇴색에 사용되는 장치는 시중에서 쉽게 구할 수 있는 부품들로 구성되어 있어 비용이 저렴하고 획득이 용이합니다.백색 인광 LED는 광범위한 파장 영역에서 빛을 방출하므로 광범위한 광퇴색(photobleaching)에 매우 적합합니다. 쉽게 구할 수 있는 LED 탁상용 램프를 사용하여, 염색되지 않은 인간 FTLD-T 뇌 조직 샘플을 Texas Red 및 Alexa 488로 염색했을 때 적절한 파장을 이용하여 광퇴색시킨 후 이미징하였습니다. 처리되지 않은 샘플에서는 다량의 자가형광이 나타났습니다.이와 대조적으로, 광퇴색(photobleaching)을 통해 리포푸신(lipofuscin)과 유사한 자가형광 반점뿐만 아니라 전반적인 배경 형광의 강도가 유의미하게 감소하였습니다. 본 기술을 추가로 검증하기 위해, FTLD-T 뇌 조직 샘플을 대상으로 이 질병에서 뚜렷한 봉입체 형태로 미스폴딩 및 축적되는 단백질인 과인산화 tau를 염색하였습니다. tau 표지와 비특이적 형광을 더 명확하게 구분하기 위해 두 종류의 서로 다른 2차 항체를 적용하였습니다.이 합성 이미지에서 Alexa 488과 Texas Red의 공국소화(colocalization)는 노란색으로 표시되며, 이는 tau 단백질이 정확하게 염색되었음을 나타냅니다. 빨간색 또는 초록색 영역이 나타나는 것은 비특이적 형광 또는 발색단 중 하나의 소광(quenching)을 의미합니다. 처리하지 않은 대조군 샘플에서는 특히 Texas Red 채널에서 상당한 배경 신호와 비특이적 신호가 관찰될 수 있습니다.광퇴색 전처리와 화학적 소광제 적용 모두 배경 신호를 크게 감소시키는 결과를 가져옵니다. 형광 채널을 분리하여 더 높은 배율로 이미지를 관찰하면 더욱 상세한 관찰이 가능합니다. 처리하지 않은 대조군은 모든 채널에서 배경 형광을 나타내며, 특히 Texas Red 채널에서는 tau 특이적 표지와 유사한 강도를 가진 비특이적 특징들이 관찰됩니다.tau 봉입체가 뚜렷하고 예측 가능한 형태를 갖지 않았다면, 이러한 자가형광 특성들로 인해 Texas Red 결과가 잘못 해석되었을 수 있습니다. 광퇴색(photobleaching) 전처리를 수행하면 tau 특이적 Texas Red 및 Alexa 488 신호의 대부분은 유지하면서, 이러한 Texas Red의 비특이적 특성들은 완전히 제거됩니다. 그러나 광퇴색은 DAPI 배경 형광에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.화학적 소광제(chemical quencher)는 광퇴색(photobleaching)만큼 효과적으로 Alexa 488 채널의 배경 형광을 감소시켰습니다. 그러나 DAPI와 Texas Red의 형광 강도 또한 감소시켜, 일부 역효과를 내는 소광이 일어났음을 시사했습니다. 이러한 효과의 정량적 결과는 신호 프로파일에서 확인할 수 있습니다.보시는 바와 같이, 이 방법은 혼란을 주는 특징이 없는 깨끗한 이미지를 생성합니다. 이러한 광퇴색 전처리는 모든 표준 아미노 형광 프로토콜에 통합하여 자가형광을 제거하고 고품질의 명확한 결과를 얻는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

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