면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 포 르 말린 고정 뇌 조직에 배경 형광의 간단한 제거

면역형광 현미경 검사에서 흔히 발생하는 문제는 신호를 방해할 수 있는 내인성 배경 형광의 존재입니다. 많은 경우, 이러한 자가형광으로 인해 결과 해석이 불가능해질 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 상용 LED 데스크 램프를 이용한 광퇴색법을 통해 인간 뇌 조직 샘플에서 자가형광을 제거하는 방법을 시연하겠습니다.

이 방법의 주요 장점은 효과를 저하시키지 않으면서 현재의 기술보다 비용을 크게 절감할 수 있다는 점과 시료에 외래 화합물을 도입하지 않는다는 점입니다. 시작하기 전에 1배수 tris-buffered saline(TBS) 및 10% sodium azide의 스톡 용액을 준비하십시오. 처리하려는 표준 크기 현미경 슬라이드 3장마다 슬라이드 챔버로 사용할 100 millimeter by 100 millimeter 정사각형 페트리 접시 1개가 필요합니다.

각 슬라이드 챔버당, 1배 TBS 50 milliliters에 10% sodium azide 25 milliliters를 첨가하여 05% azide in TBS 50 milliliters를 준비합니다. 램프 헤드가 아래에 들어갈 수 있도록 슬라이드 챔버를 들어 올릴 지지대를 만듭니다. 100 millimeter 정사각형 페트리 접시의 경우, 비슷한 크기의 플라스틱 식품 용기를 모양에 맞게 잘라 사용할 수 있습니다.

시료에 도달하는 빛을 방해하지 않으면서 슬라이드 챔버를 안정적으로 높일 수 있는 도구라면 무엇이든 사용할 수 있습니다. 백색 인광 LED 데스크 램프를 준비하고, 광원을 덮고 있는 디퓨저나 불투명한 플라스틱을 모두 제거하십시오. LED 어레이가 위를 향하도록 배치합니다.

이를 위해 유연한 넥을 가진 램프를 사용하는 것이 권장됩니다. 슬라이드 챔버와 스캐폴드를 충분히 덮을 수 있는 크기의 상자 내부를 알루미늄 호일로 감싸 장치용 반사 돔 커버를 제작하십시오. 단일 챔버의 경우에는 1 mm 피펫 팁 박스를 사용할 수 있습니다.

본 영상에서는 포르말린 고정된 인간 FTLD-T 안와전두회 뇌 조직을 광탈색 전처리에 사용하였습니다. 조직 준비 및 아미노 염색 과정은 조직 절편의 출처, 고정 및 포매 방식에 따라 달라질 수 있습니다. 4 °C 냉장실, 냉장 캐비닛 또는 냉장고 내에서 램프를 스캐폴드 아래에 배치하고 샘플 챔버를 스캐폴드 위에 놓으십시오.

샘플 챔버에 azide TBS 50 milliliters를 채웁니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 표준 유리 현미경 슬라이드에 부착된 10 micrometer 두께의 조직 절편을 샘플 챔버에 담급니다. 장치를 반사 돔으로 덮고 LED 램프를 켭니다.

시료를 48시간 동안 광퇴색시킵니다. 이 배양 시간은 램프의 강도와 조직 내 자가형광 물질의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 광퇴색 전처리를 마친 후, 해당 조직 및 관심 단백질에 맞는 표준 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 면역염색할 수 있습니다.

시연을 위해, Alexa 488 및 Texas Red가 결합된 2차 항체를 사용하여 FTLD-T 뇌 조직의 인산화된 tau를 염색하였습니다. DAPI를 핵 대조염색제로 사용하였습니다. 항원 회복 완충액 500 milliliters, TBS 내 0.025% Triton X-100 500 milliliters, TBS 내 1% 소혈청 알부민(BSA) 10 milliliters, 그리고 BSA TBS에 염소 혈청을 추가하여 만든 블로킹 용액 2 milliliters를 준비하십시오.

슬라이드 수집기에 광퇴색된 슬라이드를 항원 회수 완충액에 담가 항원 회수를 수행합니다. 수집기를 90 °C에서 30분 동안 가열합니다. 가열 처리 후 수집기를 꺼낸 다음, 챔버를 실온에서 30분 동안 식히는 것이 중요합니다.

슬라이드를 즉시 꺼내면 절편이 건조될 수 있습니다. 제조사의 권장 사항에 따라 1차 항체 혼합물을 준비하십시오. 본 실험에서는 anti-phospho PHF tau p-serine 202 plus threonine 205 AT8 항체를 BSA TBS로 1:100 비율로 희석하여 얼음 위에 보관하였습니다.

섹션당 150 µL의 항체 혼합액이 필요합니다. 섹션을 30분 동안 냉각시킨 후, 슬라이드를 항원 회수 수집기에서 TBS Triton이 채워진 염색 용기로 옮깁니다. 이 용액에서 슬라이드를 부드럽게 흔들어 5분 동안 세척합니다.

TBS Triton을 비우고 새 용액으로 교체하여 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 세척 후, 염색 용기에서 슬라이드를 꺼내고 여분의 버퍼를 닦아냅니다. 소수성 펜을 사용하여 조직 주변에 테두리를 그립니다.

이렇게 하면 용액이 슬라이드 밖으로 흘러내리는 것을 방지할 수 있습니다. 슬라이드가 마르지 않도록 주의하십시오. 블로킹 용액 200 µL를 슬라이드 위에 피펫팅하여 조직을 블로킹한 후, 습윤 챔버 안에 넣으십시오.

이 챔버는 젖은 종이 타월이 들어 있는 피펫 팁 박스 내부의 슬라이드 랙과 같이 간단한 형태여도 무방합니다. 조직 샘플 전체가 블로킹 용액으로 충분히 덮였는지 확인하십시오. 실온에서 2시간 동안 배양하십시오.

흡입기 또는 피펫을 사용하여 블로킹 용액을 제거합니다. 1차 항체 혼합액 100~150 µL를 슬라이드 위에 피펫팅합니다. 샘플 전체가 항체 용액으로 덮이도록 하고, 항체가 불균일하게 고이는 것을 방지하기 위해 섹션이 수평면을 유지하도록 합니다.

가습 챔버 내에서 4°C로 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 배양합니다. 다음 날, 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 이 경우에는 goat anti-mouse Alexa 488과 goat anti-mouse Texas Red를 BSA TBS를 사용하여 1:100으로 희석하였습니다.

조직 절편을 회수하고 흡입기 또는 피펫을 사용하여 1차 항체 용액을 제거합니다. TBS Triton이 채워진 염색 용기를 사용하여 이전과 동일한 방식으로 슬라이드를 2회 세척하며, 각 세척 시간은 5분으로 합니다. 세척 후, 남은 버퍼를 여과지로 닦아냅니다.

2차 항체 용액 100에서 150 마이크로리터를 피펫팅하여 조직 샘플이 완전히 덮였는지 다시 한번 확인하십시오. 가습 챔버 내 암조건의 실온에서 2시간 동안 배양하십시오. 제조사 권장 사항 또는 연속 희석법에 따라 TBS에 0.1 마이크로그램 퍼 밀리리터 농도의 DAPI 대조 염색액을 준비하십시오.

용해되지 않은 부분이 있을 수 있으므로 DAPI 스톡 솔루션을 충분히 혼합하십시오. 슬라이드를 회수하고 2차 항체 혼합물을 제거합니다. 샘플을 두 번 세척하되, TBS Triton 대신 일반 TBS를 사용하십시오.

남은 세척액을 흡입 또는 피펫으로 제거하고, 조직 절편 위에 100에서 150 µL의 DAPI 염색액을 피펫으로 분주합니다. 암실 상태의 상온에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 회수한 후, 이전의 2회 대신 일반 TBS로 3회 세척합니다.

세척 후, 남은 세척액을 조심스럽게 제거합니다. 봉입제를 도포합니다. 샘플 위에 유리 커버슬립을 덮어 슬라이드 봉입을 완료합니다.

커버슬립의 한쪽 가장자리를 먼저 내려놓고 핀셋을 사용하여 반대쪽 가장자리를 매우 천천히 내림으로써 기포가 생기지 않도록 합니다. 마운팅 용액을 건조시킨 후 4 °C의 암소에 보관하십시오. 이제 슬라이드를 관찰할 준비가 되었습니다.

형광 현미경 설정은 염색에 사용된 형광체와 현미경의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 형광 램프, 현미경, 컴퓨터의 전원을 켜고, 램프가 15분 동안 예열되도록 합니다. 염색된 조직 슬라이드를 형광 현미경에 거치합니다.

명시야를 사용하여 10배 배율에서 조직의 위치를 확인하십시오. 적절한 조직 영역이 확인되면, 샘플의 커버 슬립 위에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 다음 20배 수침 렌즈로 전환하십시오.

최적의 신호를 얻기 위해 각 트랙의 형광체에 적합한 레이저 여기 및 방출 파장을 선택하십시오. 사용된 설정 및 파장에 대한 자세한 내용은 동반된 논문에서 확인할 수 있습니다. 각 트랙의 신호 강도를 최적화하기 위해 레이저 출력과 게인 설정을 조정하십시오.

적절한 설정과 시야를 찾으면, 각 트랙의 형광 데이터가 포함된 합성 이미지를 저장하십시오. 각 채널의 형광 강도를 시각화하려면 ImageJ용 RGB Profile Tools 매크로를 설치하십시오. ImageJ에서 lsm 공초점 이미지 파일을 열고 Image, Color, Channel Tool 메뉴로 이동하여 세 개의 스택으로 구성된 합성 이미지를 RGB로 변환하십시오.

Composite를 선택하고 세 가지 채널을 모두 체크하십시오. 그다음 Image, Type, RGB Color로 이동하십시오. RGB Profile Tools 아이콘을 선택하고 프로파일링할 이미지 영역을 가로질러 선을 그리십시오.

본 영상에서는 배경 형광을 억제하기 위해 조직 샘플에 광퇴색 전처리를 수행하는 단계들을 설명하였습니다. 이 절차는 항원 회복 및 면역 염색 전, 모든 표준 면역 형광 프로토콜에 추가하여 적용할 수 있습니다. 광퇴색에 사용되는 장치는 시중에서 쉽게 구할 수 있는 부품들로 구성되어 있어 비용이 저렴하고 획득이 용이합니다.

백색 인광 LED는 광범위한 파장 영역에서 빛을 방출하므로 광범위한 광퇴색(photobleaching)에 매우 적합합니다. 쉽게 구할 수 있는 LED 탁상용 램프를 사용하여, 염색되지 않은 인간 FTLD-T 뇌 조직 샘플을 Texas Red 및 Alexa 488로 염색했을 때 적절한 파장을 이용하여 광퇴색시킨 후 이미징하였습니다. 처리되지 않은 샘플에서는 다량의 자가형광이 나타났습니다.

이와 대조적으로, 광퇴색(photobleaching)을 통해 리포푸신(lipofuscin)과 유사한 자가형광 반점뿐만 아니라 전반적인 배경 형광의 강도가 유의미하게 감소하였습니다. 본 기술을 추가로 검증하기 위해, FTLD-T 뇌 조직 샘플을 대상으로 이 질병에서 뚜렷한 봉입체 형태로 미스폴딩 및 축적되는 단백질인 과인산화 tau를 염색하였습니다. tau 표지와 비특이적 형광을 더 명확하게 구분하기 위해 두 종류의 서로 다른 2차 항체를 적용하였습니다.

이 합성 이미지에서 Alexa 488과 Texas Red의 공국소화(colocalization)는 노란색으로 표시되며, 이는 tau 단백질이 정확하게 염색되었음을 나타냅니다. 빨간색 또는 초록색 영역이 나타나는 것은 비특이적 형광 또는 발색단 중 하나의 소광(quenching)을 의미합니다. 처리하지 않은 대조군 샘플에서는 특히 Texas Red 채널에서 상당한 배경 신호와 비특이적 신호가 관찰될 수 있습니다.

광퇴색 전처리와 화학적 소광제 적용 모두 배경 신호를 크게 감소시키는 결과를 가져옵니다. 형광 채널을 분리하여 더 높은 배율로 이미지를 관찰하면 더욱 상세한 관찰이 가능합니다. 처리하지 않은 대조군은 모든 채널에서 배경 형광을 나타내며, 특히 Texas Red 채널에서는 tau 특이적 표지와 유사한 강도를 가진 비특이적 특징들이 관찰됩니다.

tau 봉입체가 뚜렷하고 예측 가능한 형태를 갖지 않았다면, 이러한 자가형광 특성들로 인해 Texas Red 결과가 잘못 해석되었을 수 있습니다. 광퇴색(photobleaching) 전처리를 수행하면 tau 특이적 Texas Red 및 Alexa 488 신호의 대부분은 유지하면서, 이러한 Texas Red의 비특이적 특성들은 완전히 제거됩니다. 그러나 광퇴색은 DAPI 배경 형광에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.

화학적 소광제(chemical quencher)는 광퇴색(photobleaching)만큼 효과적으로 Alexa 488 채널의 배경 형광을 감소시켰습니다. 그러나 DAPI와 Texas Red의 형광 강도 또한 감소시켜, 일부 역효과를 내는 소광이 일어났음을 시사했습니다. 이러한 효과의 정량적 결과는 신호 프로파일에서 확인할 수 있습니다.

보시는 바와 같이, 이 방법은 혼란을 주는 특징이 없는 깨끗한 이미지를 생성합니다. 이러한 광퇴색 전처리는 모든 표준 아미노 형광 프로토콜에 통합하여 자가형광을 제거하고 고품질의 명확한 결과를 얻는 데 활용될 수 있습니다.