Name: 근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 근적외선 형광 레이블과 DNA 아크릴아미드 겔 전기영동을 활용한 DNA 중합효소 활성 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 수준에서 정밀한 관찰이 가능하여 DNA 변형이 중합효소 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 과학 발전 (Cottrell 대학 학술 상 #22548)에 대 한 연구 corporation 및 TriLink 바이오 (ResearchReward 그랜트 #G139)에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 M-DNA의 DNA 중 합 효소 중재 합성 특성 분석 결과 설명 했습니다. 근처-적외선 레이블이 DNA 뇌관을 사용 하 여 다르게 크기 oligonucleotides 해결 하려면 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 합성의 정확한 측정을 사용 oligonucleotides, 단일 뉴클레오티드 해상도 얻을 수 있습니다 우리. 이러한 접근 하거나 효소 (섹션 2.1)의 전반적인 활동을 측정 하거나 개별 단계 (다음 단계 2.1 참고)의 Michaelis-Menten 매개 변수를 측정에 사용할 수 있습니다. 연구소는 최근 사용이 둘 다 이전 진화 효소9 특성으로 효소10를 합리적으로 설계.
여기에 설명 된 우리의 분석 비 방사성 DNA 라벨의 그들의 사용에서 이전 방법에서 차이가 있습니다. 역사적으로, 방사능 방사성 인 라벨11...

DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성1,2,3,,45;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA6,,78의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다.
M-DNA 합성 돌연변이 DNA polymerases의 능력을 평가 하기 위해 우리9,10, 등11,,1213 일반적으로 사용 하는 DNA의 생체 외에서 측정 중 합 효소 활동이이 원고에 설명 되어 있습니다. 이 실험에서 DNA polymerases는 공동 incubated 레이블이 뇌관/템플릿을 이중와 nucleoside 3 인산 염 기판; 제품 젤 전기 이동 법에 의해 평가 됩니다. 특정 실험적인 질문, 돌연변이 DNA polymerases, 수정된 뇌관, 수정 된 서식 파일 또는 수정 된 nucleoside 된 사용할 수 있습니다, 활성화 돌연변이 효소 활동의 체계적인 생 화 확 적인 평가.
역사적으로, 이러한 분석 추적 DNA 합성; 5' 방사성 라벨에 의존 가장 일반적으로, P 32 33P 사용 되었습니다; 일반적으로, 라벨 이루어집니다 T4 polynucleotide 키 니 아 제11를 사용 하 여. 그러나, 유한 수명 및 방사성 레이블 및 그들의 안전한 처리의 상대적으로 높은 비용, 우리의 그룹은 합성 5' 근처-적외선 fluorophore DNA를 표시 대신 사용 합니다. 상대적으로 저렴 한 비용 근처-적외선 젤 영상을 사용 하 여, 우리는 비슷한 검출 한계가 방사성 레이블 (게시 되지 않은 결과)를 사용 하 여 이전 연구 관찰. 우리는 성공적으로 관측9, 과거 복제 하 고 우리가 하지 이전 측정된 속도 상수 (게시 되지 않은 결과)와 어떤 큰 양적 차이 관찰 했다.
DNA의 크기 및 따라서, DNA 종합의 정도 분석 하려면 우리는 생어 시퀀싱14 모 세관 전기 이동 법15의 도래 하기 전에 원래 개발 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 방법에 의존. 분리 또는 거리; 분자량의 측정으로 사용할 수 있습니다. 대형, 수직 polyacrylamide 젤 단일 뉴클레오티드 해상도, 다양 한 길이의 DNA oligonucleotides의 양적 관찰 가능 얻을 수 있습니다.
샨 다, 이러한 실험은 중 합 효소 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 시간으로 인해 민감한 반응, 준비 및 관리의 재현성 결과 얻을 필요가 있다. 또한, 아크릴 아 미드 젤은 DNA 합성, 수많은 다른 DNA 수정 반응, 단일 뉴클레오티드 해상도 측정 하는 매우 효과적인 방법 그것은 기술적으로 도전 수 것 이다. 잘하면 여기 프로토콜 가장 일반적인 실수를 피하고 있는 동안이 실험을 수행 하려면 사용자가 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>트리스 HCl</td><td>프로메가</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>프로메가</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>아세틸화 BSA</td><td>프로메가</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(즉, DTT)</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(즉, EDTA)(0.5M 용액)</td><td>시그마</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>아크로스</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마 알드리치</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (기타 모든 변형 NTP)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>모듬</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>맞춤형 합성</td><td>우리는 맞춤형 합성으로 구입할 수 있는 IR700 염료를 사용합니다. 우리는 일반적으로 정제된 올리고뉴클레오티드 HPLC를 구매합니다. 서열은 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>템플릿 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>맞춤형 합성</td><td>우리는 일반적으로 정제 된 올리고 뉴클레오티드 HPLC를 구매합니다. 서열은 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>연구 제품 국제</td><td>A11405</td><td>38.67% 아크릴아미드 및 1.33% 비스-아크릴</td></tr><tr><td>아미드 Tris/Borate/EDTA(TBE) 고체</td><td>연구 제품</td><td>국제 T22020</td><td></td></tr><tr><td>요소 초순수</td><td>연구 제품 국제</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>젤 테이프</td><td>CBS 사이언티픽</td>입니다.<td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>대형 백색 스프링 클램프 폴리프로필렌</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75mm 스페이서</td><td>CBS 사이언티픽</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 노치 유리판 세트</td><td>CBS 과학적인</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>쐐기형 플레이트 분리기</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동용 빗</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동 장비</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td>우리는 Millipore DNA 중합효소의 Milli-Q 시스템을 사용합니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>우리는 발표된 프로토콜을 사용하여 실험실에서 이를 준비합니다.</td></tr></tbody></table>

근 적외선 형광 레이블이 dna 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 dna 중 합 효소 활동 분석 결과

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.

안정-상태 활동 (섹션 2.1, 그림 2의 결론에서 참고에서 설명)와 (섹션 2.1, 그림 1에 설명 된) 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석 표시 됩니다. 실패 polyacrylamide 젤 분석 (그림 3) 표시 됩니다.
참고 아무 상업적으로 사용할 수 있는 사다리 또는 분자 마커 사용 됩니다. 때때로,를 사용 하 여 알려진된 중 합 효소-기질 조합을 만드는 분자 마커; 그러나, 다른 수정된 뉴클레오티드 매우 다른 전기 이동 mobilities, 부적절 한 길이가 동일 하지만 서로 다른 염기 구조 oligonucleotides의 비교를 만들기가 중요 하다.
<p...

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오타이드 수준에서 DNA 중합효소 활성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 DNA 합성의 어떤 특정 단계가 DNA 변형에 의해 제한되는지와 같은 DNA 중합효소 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 뉴클레오타이드 변화를 관찰할 수 있어 중합효소 활성을 정밀하게 관찰할 수 있다는 점입니다.이 절차를 수행할 때는 사전에 계획을 세우는 것이 중요합니다. 많은 단계가 시간에 민감하기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 완충액, DNA 이중나선 혼합물 및 단백질 희석액을 준비하십시오.다음으로, 드라이 배스(dry bath)의 온도를 50 °C로 설정하십시오. 25 µL의 2X dNTPs가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 어닐링된 이중 가닥 혼합물 24 µL를 추가합니다. 그 후, 효소 무첨가 대조군(no enzyme control)을 준비하기 위해 이 혼합물 9.8 µL를 20 µL의 퀜칭 버퍼 오렌지(quenching buffer orange)가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 0.8 µL의 50X 효소를 이중 가닥 dNTP 혼합물에 첨가합니다. 대용량 피펫을 사용하여 용액을 충분히 혼합합니다. 드라이 배스(dry bath)에서 배양합니다.각 반응 혼합물에서 10 µL를 취해 20 µL의 quenching buffer orange가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 넣음으로써 반응을 정지시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 젤 전기영동을 위한 아크릴아마이드 혼합물을 준비합니다. 다음으로, 33 cm x 42 cm 젤 플레이트 두 개를 비누와 물로 깨끗이 세척합니다.각 플레이트의 표면을 종이 타월로 닦아 건조시킨 후, 정밀 작업용 와이퍼를 사용하여 나머지 부분을 건조시킵니다. 건조된 플레이트를 70% ethanol로 헹구고 작업용 와이퍼로 다시 한 번 닦아냅니다. 그 후, 장갑을 낀 손을 탈이온수로 헹구고, 젖은 손가락을 사용하여 0.75 millimeter 스페이서를 조심스럽게 적십니다.노치 플레이트(notched plate)의 가장자리를 따라 스페이서를 배치하십시오. 태스크 와이퍼(task wiper)를 사용하여 플레이트에 튄 물기를 닦아내십시오. 플레이트를 합친 후, 윗부분은 제외하고 바닥과 측면을 젤 테이프로 덮어 밀봉하십시오.테이프가 고르게 정렬되고 단단

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

엑소뉴클레아제는 게놈 안정성을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. WRN 엑소뉴클레아제 기능의 손실은 조기 노화를 초래합니다. in vitro에서 뉴클레아제의 기질 및 기타 요구 사항을 연구하면 in vivo에서 뉴클레아제의 역할을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 뉴클레아제 활성을 측정하기 위한 빠르고 재현 가능한 형광 기반 분석을 시연합니다.

DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

이 연구는 DNase 활성의 검출 및 정량적 평가를 위한 간단하고 사용자 친화적인 비율계량 FRET 분석을 제시하고 약한 뉴클레아제 분석에 적용하는 것을 보여줍니다.

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

배우세요 근적외선 형광 레이블과 DNA 아크릴아미드 겔 전기영동을 활용한 DNA 중합효소 활성 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 수준에서 정밀한 관찰이 가능하여 DNA 변형이 중합효소 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

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