Name: 근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 배우세요 근적외선 형광 레이블과 DNA 아크릴아미드 겔 전기영동을 활용한 DNA 중합효소 활성 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 수준에서 정밀한 관찰이 가능하여 DNA 변형이 중합효소 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 과학 발전 (Cottrell 대학 학술 상 #22548)에 대 한 연구 corporation 및 TriLink 바이오 (ResearchReward 그랜트 #G139)에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 M-DNA의 DNA 중 합 효소 중재 합성 특성 분석 결과 설명 했습니다. 근처-적외선 레이블이 DNA 뇌관을 사용 하 여 다르게 크기 oligonucleotides 해결 하려면 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 합성의 정확한 측정을 사용 oligonucleotides, 단일 뉴클레오티드 해상도 얻을 수 있습니다 우리. 이러한 접근 하거나 효소 (섹션 2.1)의 전반적인 활동을 측정 하거나 개별 단계 (다음 단계 2.1 참고)의 Michaelis-Menten 매개 변수를 측정에 사용할 수 있습니다. 연구소는 최근 사용이 둘 다 이전 진화 효소9 특성으로 효소10를 합리적으로 설계.
여기에 설명 된 우리의 분석 비 방사성 DNA 라벨의 그들의 사용에서 이전 방법에서 차이가 있습니다. 역사적으로, 방사능 방사성 인 라벨11...

DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성1,2,3,,45;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA6,,78의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다.
M-DNA 합성 돌연변이 DNA polymerases의 능력을 평가 하기 위해 우리9,10, 등11,,1213 일반적으로 사용 하는 DNA의 생체 외에서 측정 중 합 효소 활동이이 원고에 설명 되어 있습니다. 이 실험에서 DNA polymerases는 공동 incubated 레이블이 뇌관/템플릿을 이중와 nucleoside 3 인산 염 기판; 제품 젤 전기 이동 법에 의해 평가 됩니다. 특정 실험적인 질문, 돌연변이 DNA polymerases, 수정된 뇌관, 수정 된 서식 파일 또는 수정 된 nucleoside 된 사용할 수 있습니다, 활성화 돌연변이 효소 활동의 체계적인 생 화 확 적인 평가.
역사적으로, 이러한 분석 추적 DNA 합성; 5' 방사성 라벨에 의존 가장 일반적으로, P 32 33P 사용 되었습니다; 일반적으로, 라벨 이루어집니다 T4 polynucleotide 키 니 아 제11를 사용 하 여. 그러나, 유한 수명 및 방사성 레이블 및 그들의 안전한 처리의 상대적으로 높은 비용, 우리의 그룹은 합성 5' 근처-적외선 fluorophore DNA를 표시 대신 사용 합니다. 상대적으로 저렴 한 비용 근처-적외선 젤 영상을 사용 하 여, 우리는 비슷한 검출 한계가 방사성 레이블 (게시 되지 않은 결과)를 사용 하 여 이전 연구 관찰. 우리는 성공적으로 관측9, 과거 복제 하 고 우리가 하지 이전 측정된 속도 상수 (게시 되지 않은 결과)와 어떤 큰 양적 차이 관찰 했다.
DNA의 크기 및 따라서, DNA 종합의 정도 분석 하려면 우리는 생어 시퀀싱14 모 세관 전기 이동 법15의 도래 하기 전에 원래 개발 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 방법에 의존. 분리 또는 거리; 분자량의 측정으로 사용할 수 있습니다. 대형, 수직 polyacrylamide 젤 단일 뉴클레오티드 해상도, 다양 한 길이의 DNA oligonucleotides의 양적 관찰 가능 얻을 수 있습니다.
샨 다, 이러한 실험은 중 합 효소 특성에 대 한 강력한 방법입니다. 시간으로 인해 민감한 반응, 준비 및 관리의 재현성 결과 얻을 필요가 있다. 또한, 아크릴 아 미드 젤은 DNA 합성, 수많은 다른 DNA 수정 반응, 단일 뉴클레오티드 해상도 측정 하는 매우 효과적인 방법 그것은 기술적으로 도전 수 것 이다. 잘하면 여기 프로토콜 가장 일반적인 실수를 피하고 있는 동안이 실험을 수행 하려면 사용자가 하면 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>트리스 HCl</td><td>프로메가</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>프로메가</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>아세틸화 BSA</td><td>프로메가</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(즉, DTT)</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(즉, EDTA)(0.5M 용액)</td><td>시그마</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>아크로스</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마 알드리치</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (기타 모든 변형 NTP)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>모듬</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>맞춤형 합성</td><td>우리는 맞춤형 합성으로 구입할 수 있는 IR700 염료를 사용합니다. 우리는 일반적으로 정제된 올리고뉴클레오티드 HPLC를 구매합니다. 서열은 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>템플릿 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>맞춤형 합성</td><td>우리는 일반적으로 정제 된 올리고 뉴클레오티드 HPLC를 구매합니다. 서열은 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>연구 제품 국제</td><td>A11405</td><td>38.67% 아크릴아미드 및 1.33% 비스-아크릴</td></tr><tr><td>아미드 Tris/Borate/EDTA(TBE) 고체</td><td>연구 제품</td><td>국제 T22020</td><td></td></tr><tr><td>요소 초순수</td><td>연구 제품 국제</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>젤 테이프</td><td>CBS 사이언티픽</td>입니다.<td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>대형 백색 스프링 클램프 폴리프로필렌</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0.75mm 스페이서</td><td>CBS 사이언티픽</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 노치 유리판 세트</td><td>CBS 과학적인</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>쐐기형 플레이트 분리기</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동용 빗</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기영동 장비</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td></td><td></td><td>우리는 Millipore DNA 중합효소의 Milli-Q 시스템을 사용합니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td></td><td>우리는 발표된 프로토콜을 사용하여 실험실에서 이를 준비합니다.</td></tr></tbody></table>

근 적외선 형광 레이블이 dna 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 dna 중 합 효소 활동 분석 결과

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.

안정-상태 활동 (섹션 2.1, 그림 2의 결론에서 참고에서 설명)와 (섹션 2.1, 그림 1에 설명 된) 전체 활동의 질적 특성의 성공적인 polyacrylamide 젤 분석 표시 됩니다. 실패 polyacrylamide 젤 분석 (그림 3) 표시 됩니다.
참고 아무 상업적으로 사용할 수 있는 사다리 또는 분자 마커 사용 됩니다. 때때로,를 사용 하 여 알려진된 중 합 효소-기질 조합을 만드는 분자 마커; 그러나, 다른 수정된 뉴클레오티드 매우 다른 전기 이동 mobilities, 부적절 한 길이가 동일 하지만 서로 다른 염기 구조 oligonucleotides의 비교를 만들기가 중요 하다.
<p...

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오타이드 수준에서 DNA 중합효소 활성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 DNA 합성의 어떤 특정 단계가 DNA 변형에 의해 제한되는지와 같은 DNA 중합효소 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 뉴클레오타이드 변화를 관찰할 수 있어 중합효소 활성을 정밀하게 관찰할 수 있다는 점입니다.이 절차를 수행할 때는 사전에 계획을 세우는 것이 중요합니다. 많은 단계가 시간에 민감하기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 완충액, DNA 이중나선 혼합물 및 단백질 희석액을 준비하십시오.다음으로, 드라이 배스(dry bath)의 온도를 50 °C로 설정하십시오. 25 µL의 2X dNTPs가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 어닐링된 이중 가닥 혼합물 24 µL를 추가합니다. 그 후, 효소 무첨가 대조군(no enzyme control)을 준비하기 위해 이 혼합물 9.8 µL를 20 µL의 퀜칭 버퍼 오렌지(quenching buffer orange)가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그런 다음 0.8 µL의 50X 효소를 이중 가닥 dNTP 혼합물에 첨가합니다. 대용량 피펫을 사용하여 용액을 충분히 혼합합니다. 드라이 배스(dry bath)에서 배양합니다.각 반응 혼합물에서 10 µL를 취해 20 µL의 quenching buffer orange가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 넣음으로써 반응을 정지시킵니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 젤 전기영동을 위한 아크릴아마이드 혼합물을 준비합니다. 다음으로, 33 cm x 42 cm 젤 플레이트 두 개를 비누와 물로 깨끗이 세척합니다.각 플레이트의 표면을 종이 타월로 닦아 건조시킨 후, 정밀 작업용 와이퍼를 사용하여 나머지 부분을 건조시킵니다. 건조된 플레이트를 70% ethanol로 헹구고 작업용 와이퍼로 다시 한 번 닦아냅니다. 그 후, 장갑을 낀 손을 탈이온수로 헹구고, 젖은 손가락을 사용하여 0.75 millimeter 스페이서를 조심스럽게 적십니다.노치 플레이트(notched plate)의 가장자리를 따라 스페이서를 배치하십시오. 태스크 와이퍼(task wiper)를 사용하여 플레이트에 튄 물기를 닦아내십시오. 플레이트를 합친 후, 윗부분은 제외하고 바닥과 측면을 젤 테이프로 덮어 밀봉하십시오.테이프가 고르게 정렬되고 단단히 밀봉되었는지 확인하십시오. 면도날을 사용하여 테이프의 끝부분을 자릅니다. 그런 다음 겔 하단에 테이프를 한 층 더 추가하십시오.시약을 준비한 후, 세척병을 준비하고 뾰족한 깔때기를 제거합니다. 메스실린더를 사용하여 물 125 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 유성 마커를 사용하여 병 외부에 수위를 표시합니다.물을 버립니다. 그다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 싱크대 옆에 코르크 링과 플레이트 샌드위치를 준비합니다. 빈 분무병과 미리 준비한 APS 및 TEMED 용액을 싱크대 반대편에 놓습니다.원하는 웰 수의 웰 콤과 클램프 4개를 근처에 준비합니다. 그런 다음 분무병에 20% acrylamide 겔 용액을 표시된 수위까지 채웁니다. 동시에 polyacrylamide 겔 용액에 TEMED 120 µL와 APS 600 µL를 첨가합니다.APS 600 µL를 빠르게 추가합니다. 분무병의 캡을 신속히 닫고 회전시켜 섞어줍니다. 다음으로 플레이트 샌드위치를 싱크대에 넣습니다.병에 천천히 그리고 일정하게 압력을 가하여 겔 용액이 꾸준히 흐르도록 붓기 시작합니다. 겔이 홈이 있는 구역까지 차오르고 홈 끝부분에서 약간 넘칠 때까지 붓습니다. 플레이트를 기울여 기포를 제거합니다.그런 다음 플레이트 샌드위치에 웰 콤을 추가합니다. 웰이 고르게 분포될 수 있도록 콤 위에 클램프를 놓고 눌러 고정합니다. 분무병에 남은 겔 용액은 즉시 적절한 폐기물 용기에 버립니다.탈이온수로 분무 노즐을 통해 세 번 헹구어 병을 세척합니다. 시작하려면 플레이트 샌드위치에서 모든 바인더 클립을 제거하십시오. 면도날을 사용하여 가장자리의 젤 테이프를 자르고 제거합니다.유리 표면을 종이 타월과 물로 닦아 중합된 젤 잔해를 최대한 제거합니다. 면도날을 사용하여 가장자리에 남아 있는 젤을 긁어냅니다. 그다음, 웰 콤(well comb)의 양쪽을 균일하게 밀어 제거합니다.면도날을 사용하여 플레이트 샌드위치 상단의 불필요한 겔을 잘라냅니다. 그런 다음 플레이트의 홈이 파인 가장자리를 따라 자릅니다. 주사기와 탈이온수를 사용하여 웰을 헹궈 이물질을 제거합니다.각 웰에 물을 채울 수 있는지 확인하고, 과도하게 중합된 젤로 인해 막히지 않았는지 확인하십시오. 다음으로, 긴 플레이트가 바깥쪽을 향하고 홈이 파인 공간이 안쪽을 향하도록 플레이트 샌드위치를 장치에 배치하십시오. 플레이트 샌드위치와 알루미늄 플레이트를 장치에 부착하여 함께 고정하십시오.균일한 전기영동을 위해 플레이트 외부에 클립을 추가로 장착합니다. 하단 노치와 상단 웰이 충분히 잠길 정도로 TBE buffer를 가합니다. 플레이트를 예열하기 위해 50 watts에서 20분 동안 겔 전기영동을 수행합니다.그 후 시린지와 TBE 버퍼를 사용하여 웰을 세척하십시오. 웰에서 남아 있는 모든 버퍼 염이 제거되었는지 확인하기 위해 시린지 세척을 여러 번 반복하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 측면의 가장 바깥쪽 레인을 설정하십시오.브로모페놀 블루가 포함된 95% formamide 3 µL를 겔의 해당 웰에 추가합니다. 모든 시료를 로딩하고 1분 동안 안정화시킵니다. 장치와 전원을 연결한 후, 전력을 50~55 W 사이로 설정합니다.겔을 약 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 염료 전선이 겔의 최소 3분의 2 지점까지 내려갈 때까지 전기영동합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 겔 이미지를 획득합니다. 본 연구에서는 변형된 DNA의 DNA 중합효소 매개 합성을 특성화하기 위한 분석법이 개발되었습니다.전체 활성에 대한 정성적 특성 분석이 성공적으로 이루어지면 개별 밴드가 뚜렷하고 일정하게 나타납니다. 활성은 생성물의 길이와 표지된 프라이머가 더 큰 생성물로 전환된 비율 모두를 통해 판단합니다. 보시는 바와 같이 E6와 E5가 가장 활성이 높은 효소이며, E4와 E1의 활성이 가장 낮습니다.정상 상태 역학(steady-state kinetics)을 이용한 정량 분석 또한 이러한 방법들로 수행될 수 있습니다. N 및 N+1 생성물만 합성되기 때문에, 단일 사건을 성공적으로 정량화할 수 있습니다. 여기서 사용된 기본적인 방법론은 중합효소 이외의 다른 여러 DNA 또는 RNA 변형 효소들을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용

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적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

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배우세요 근적외선 형광 레이블과 DNA 아크릴아미드 겔 전기영동을 활용한 DNA 중합효소 활성 분석 방법입니다. 단일 뉴클레오티드 수준에서 정밀한 관찰이 가능하여 DNA 변형이 중합효소 기능에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다.

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