Name: 자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 배우세요 미생물 배양 배지 최적화를 위한 반복적 워크플로우와 크리깅 기반 실험 설계 및 자동화된 마이크로바이오리액터 기술을 활용한 방법입니다. 이 기술은 단백질 생산 효율성을 높이고 개발 시간을 단축합니다.

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Bioeconomy 과학 센터의 과학 활동 NRW Strategieprojekt BioSC (313/323-400-002 13)의 프레임 워크 내에서 사역의 혁신, 과학, 그리고 연구에 의해 재정적으로 지원 했다. 저자는 혁신의 내각, 과학, 및 연구의 노르트라인-베스트팔렌, 하인리히 하이 네 대학 뒤셀도르프 라스 주 클러스터 산업 생명 공학 CLIB 대학원 내에 장학금에 대 한 감사합니다. 추가 자금 활성화 공간 프로그램 "미생물 Bioprocess 연구소-A 헬름홀츠 혁신 연구소"를 지원 하기 위해 독일 헬름홀츠 협회의 "헬름홀츠 혁신 연구소"에서 받았습니다.

저자는 공개 없다.

제시 프로토콜의 일반적인 자연 수 예를 들어, 다른 미생물 식 호스트9,47,,4849,50, 공부에 대 한 다양 한 적응, 51, 또는 glycosylation 패턴 또는 이황화 채권 같은 대상 단백질의 다른 속성을 최적화. 프로토콜 사용 가능한 실험실 장비에 적응도 해야 합니다. MBR 시스템의 통합 시간에 큰 비용 절감을 가능 하 게 실험 처리량을 늘릴 수 있습니다. 그러나, 완벽 하 게 계측 및 제어 bioreactors MBR 시스템 교체, 결과의 확장성8,37,,5253고려 한다. 미상 방법론 및 수학적 모델링을 사용 하 여 효율적인 실험 계획 및 모델 기반 데이터 해석15공부 객관적인54 에 따라 측정 데이터의 정보 내용을 극대화에 도움이 됩니다.
방법에 대 한 수정 다목적 및 확장 로봇 액체 처리 시스템이이 연구에 사용 된 것과 같은, 옆 언급 해야이 작업을 수행할 수 있고 안에 배치 될 수 있습니다 상용 시스템을 처리 하는 여러 작은 액체는 층 류 흐름 작업의 자의 자동된 pipetting 시스템을 사용할 수 있는 다른 미디어 작곡 미상 계획에 따라 단일 또는 다중 채널 펫을 사용 하 여 수동 pipetting으로 실현 또한 수 있다. 수동 준비는 더 오류가 있기 때문에 꽤 오랜 시간에 대 한 높은 집중된 작업을 요구할 것 이다, 다른 미디어 작곡의 낮은 수를 준비 하는 것이 좋습니다.
고용된 MBR 시스템의 기능에 따라 해당 재배 프로토콜은 달라 집니다. 예를 들어, 바이오 매스 형성의 아무 온라인 측정을 사용할 수 있는 경우 성장 실험의 완료 후 바이오 매스 농도 측정 하는 충분 한 수 있습니다. 온라인 모니터링 함께에서 여러 MBR 시스템에서 구현 되는 용 존된 산소와 pH의 성장 채도 안전 하 게 결정 될 수 있다. 원칙적으로, 성장 실험 MTPs 혼자 incubators, MBR 시스템의 사용 없이 동요 내부 배치에서 수행할 수 있습니다. 이 경우에, 적절 한 재배 조건을 보장 해야: (1) 산소 제한 지켜온 적절 한 주파수를 흔들어 및 직경, 예를 들어, 광장 96 또는 24 깊은 동요와 함께 적당 한 형상의 MTPs를 사용 하 여 피할 수 있습니다 잘 판 3mm 던져 또는 25 mm 던져에서 250 rpm에서 1000 rpm에서 각각 운영 한다. 중요 한 것은, 낮은 달성 최대한 산소 전송 속도, 낮은 주요 탄소 소스 해야 집중. 이 연구를 위해, 위에서 언급 한 대로 10 g/L 포도 당 사용이 했다 고용된 재배 조건;에 대 한 제한 산소를 방지 하기 위해 적당 한 (2) 바이오 매스 및 제품 정량화에 대 한 MTP 문화의 샘플링 최소한으로 감소 되어야 한다. MTP 떨고 인큐베이터에서 제거 됩니다 때마다 산소 전송 됩니다 즉시 고장 형편이 나쁜 경작 조건;에서 발생할 수 있습니다. (3) 저자의 의견에에서 MTP 독자 재배 장치를 사용 하 여가이 목적을 위해이 소자 들은 개발 되지 않은으로 바람직하지 않습니다. 예를 들어 떨고 역학 만들어진 시 약 추가 후 microplates의 가끔 혼합 하 고 따라서, 일에 대 한 지속적인 떨고 지속의 긴 실행에 대 한 견고성 부족. 또한, 미생물 경작에 필요한 충분 한 전원 입력이이 독자에서 실현 될 수 없습니다. 광학 밀도 판독의 통합 짧은 시간 간격 반복된 기간 산소 제한의 결과로 떨고 운동의 중지를 해야 합니다. 또한, 긴 재배 기간 동안 이러한 시스템에서 증발 결과 왜곡할 것 이다. 에 대 한 자세한 내용은 MTPs 미생물 경작에 대 한 사용 하 여 놀라울 정도로 복잡 한 주제, 독자는 인용된 문학22,23,,2425,26 참조 거기에 참조.
추가 고려 사항 죽인다 반복 최적화 단계를 신중 하 게 제품 정량화에 대 한 분석 방법을 선택 하는 것이 좋습니다. 빠르고 간단한 방법 실험 부정확성을 허용 하는 반복 실험 설계 전략으로 정밀도 정확도, 비용 선호 해야 합니다. 그러나, 더 복잡 있을 수 있습니다 충분 하 게 정확 하 고 정확한 제품 정량화 방법에 대 한 최종 결과 확인 해야 합니다. 일반적으로, 주의 깊은 평가 및 연구 절차에 대 한 의사 결정 연구의 시작 부분에서 노력을 필요로 하지만 일상적인 방법 설정 된 후 긴 안목으로 보면, 치를.
최적화 하는 동안 모든 실험 비교 참조 실험을 정의 높은 것이 좋습니다. 즉, 측정 된 출력 뿐 아니라 적용된 중간 구성 요소 농도 기준 값으로 나누는 통해 정규화 됩니다. 이러한 방법으로, 각각 적용 되 고 측정 된 값 참조 값의 x 배로 해석 될 수 있다. 격판덮개 사이 계정 변화를 하기 5 참조 실험 각 접시에 수행 됩니다. 측정된 결과의 의미 값 정규화에 대 한 사용 됩니다.
그것은 수 있다 일반적으로 하지 보장 개발된 매체는 또한 다른 변종에 대 한 최적의. 그러나, 향상 된 매체 대부분 수도 mutagenesis 연구 (에서 얻은 하나의 아미노산 대체와 효소 이체를 생산 하는 때 작은 유전 다름, 예를 들어, 식 종자 재배에 적합 비록도 단일 지점 돌연변이 설명 효과 세포질 물질 대사 및 분리 식 성능55,56). 이 경우에, 제시 프로토콜 프로토콜 높은 처리 식 검 진57다음 첫 번째 단계를 수 있습니다. 복제는 눈금에서 캠페인 심사 확인 다른 가기 최적화 된 매체 해당 bioprocess 조건에 대 한 확인 한다 중간 개발 이후 규모-최대 먹이 배치 경작을 위한 프로토콜을 사용 하는 경우 다른 먹이 전략 및 재배 미디어52,58공연. 또한, 도입된 KriKit36 일반적으로 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여할 수 있다.최근, 도구 능력 또한 모두 업스트림 및 다운스트림 프로세스59,60를 최적화에 대 한 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화40를 지원 하도록 확장 했다.

현대 재조합 유전자 기술 제약 산업, 동물 먹이, 유기 화학 및 식품 가공1,2,3에서 다양 한 응용 프로그램에 대 한 기술 효소의 광범위 한 사용을 수 있습니다. 대량 수량에서 기술 효소의 생산은 산업 공학에 대 한 최적화 된 재조합 단백질 생산을 위한 주요 주제 둘 다 변형 및 bioprocess 엔지니어링이 필요 하다. 효율적으로 설계 생산 종자의 생성에 대 한 서로 다른 유전자 라이브러리를 사용할 수 있습니다 예를 들어, 균형된 진 식4 또는 증가 된 분 비 효율5.
Corynebacterium glutamicum 산업 규모6,7 에서 아미노산의 중요 한 생산자가 고 재조합 단백질8의 분 비 생산에 대 한 매력적인 비 전통적인 식 호스트 나타냅니다. ,9. 일반적인 분 비 (Sec)와 트윈-아르기닌 전 (문신) 통로 C. glutamicum 에 존재 하 고 재조합 단백질 분 비10성공적으로 적용 했다. Bioprocess 공학 산업 규모 뿐만 아니라 단백질 g/L 양의11 및 대규모 발견 bioprocess 이질성에 관한 좋은 견고성을 분 비 하는 능력에서 아미노산 생산에 관한 광범위 한 경험 지켜온12,13, 산업 규모에 유망한 플랫폼 유기 체 분리 단백질의 분 비 생산에 대 한 C. glutamicum 확인 합니다.
재조합 형 단백질 생산 미생물 시스템14,15,,1617 따라서, 매체의 조정 개선 영양 중간 최적화 알려져 있다 구성은 bioprocess에서 보람 있는 단계 최적의 생산성18,19,,2021기준 개발. 미생물 배양22,,2324 결정 판 (MTPs)의 응용 프로그램에 대 한 강렬한 연구 개발 및 미생물 배양25 MTPs의 디자인에 대 한 방법을 포장 26 및 MTP 기반 microbioreactor (MBR) 시스템 온라인 모니터링 및 환경 개발 제어27,28. 마샬링 사용 실험 재배 처리량에 크게 증가 합니다. 게다가, 원자로, 생물 반응 기, 예를 들면, 거품 열 또는 흔들된 탱크의 형태소를 분석 하는 MBR 시스템 미생물 bioprocess 최적화29,,3031, 사용할 수 있습니다. 32.
일반적으로 최적화 연구 DOE 방법론 등 설계 변수 간의 상호 작용을 평가 하거나 높은 차원 검색 공간을 줄이기 위해 함께에서 더욱 강력한 되 증가 실험 처리량에서 혜택을. 따라서, MBR 시스템, 실험실 자동화, DOE의 사용 생물 공학8,16,33,,3435에서 강력한 방법으로 입증 했다.
미디어 최적화에 대 한 프로토콜 결합-의 상태--예술 실험실 자동화, MBR 기술 온라인 프로세스 모니터링 및 Kriging 기반 데이터 분석/실험 설계와 함께 제공 됩니다. Kriging 방법론 MATLAB 도구 상자 (이 하 "KriKit") 다운로드 하 고 사용할 수 있는 구현 됩니다 무료 충전36입니다. 응용 프로그램 예를 들어, C. glutamicum 와 녹색 ﬂuorescent 분 비 단백질 (GFP) 생산의 극대화는 CgXII 최소 매체의 구성을 최적화 하 여 표시 됩니다. GFP titer 쉽게 측정할 수 있다 그리고 그것은 넓게 MBR 시스템37,,3839에 대 한 연구에 대 한 모델 단백질으로 적용 최적화 목적으로 선택 되었다.
제시 프레임 워크는 그림 1에 나와 있는 4 단계로 나누어져 있습니다. 단계 상자 프레임으로 표시 하 고 프로토콜의 섹션에 해당. (그림 1A)의 첫 번째 단계는 프로젝트 목표를 정의 하 고 필요한 방법을 결정입니다. 미상 방법론, MBR 기술 및 실험실 자동화의 조합은 강력한 데이터 처리를 요구 하는 증가 실험 처리량을 허용 한다. 두 번째 단계 (그림 1B) 중요 한 설계 변수 최적화 목표에 높은 영향 (즉, 중간 구성 요소)를 감지 하는 것을 목표로. 이것은 관심의 설계 변수는. 세 번째 단계 (그림 1C) 나머지 설계 변수 및 관심의 목표 사이의 기능적 관계의 더 상세한 조사를 위해 반복 최적화 구성 되어 있습니다. 연속적으로 확장 된 데이터 집합을 사용 하 여, Kriging 접근은 헤아릴 수 없는 위치에서 실험 결과 예측에 대 한 적용 됩니다. 반복 주기 Kriging 모델의 최적 또는 고원 충분 한 정확도로 예측 대로 중지 합니다. 결과 4 단계 (그림 1D), 확인 된 최적 주위 더 감도 분석 시작에서 확인 됩니다. 처음, 구분 구성 되지 중요 한 또한 최적의 지역에서 발견 되 면이 세 번째 단계에서 반복 최적화 절차 동안 진정한 보유 가정 하는 합리적입니다. 이후에, 최적화 결과 확인 하기 위해 직교 방법, 활동 분석 결과 또는 SDS 페이지 같은 응용 프로그램에 의해 조언 된다.
제시 프로토콜의 일반적인 특성 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 선택, 뿐만 아니라 더 bioprocess 대상 단백질을 쉽게 적응에 대 한 pH 값 또는 재배 온도 같은 변수를 수 있습니다.또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
그림 1 : 최적화 검토의 워크플로. 4 개의 프레임 상자 프로토콜, "마음속에 연구와 정의의 방법" (제 1), "민감도 분석" (제 2), "반복 최적화" (제 3), 및 "유효성 검사" (제 4)의 섹션에 해당합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>BioLector 장치에서 배양하기 위해</td></tr><tr><td>밀봉 호일</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Flowerplate용 멸균 밀봉</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>무료 사용 가능, MATLAB 설치 필요</td></tr><tr><td>Janus 피펫팅 로봇</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>"WinPrep" 소프트웨어 설치</td></tr><tr><td>포함 12열 딥 웰 마이크로플레이트</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>미디엄 스톡 솔루션용 용기</td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트, 투명, F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Bradford 단백질 분석</td></tr><tr><td>&마이크로용; 투명 96웰 마이크로플레이트, 흑체, 투명 F-바닥</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>cell-free 상등액의 형광 측정용</td></tr><tr><td>Pipette Research&nbsp; plus multi-channel pipette</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td> 마이크로플레이트 TruPAG<td>를 이용한 수동 액체 취급 용이 용이</td></tr>합니다<tr><td>. 프리캐스트 겔</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>무세포 슈퍼난탄트의 SDS-Page 분석용</td></tr><tr><td>Bradford 시약 Sigma</td><td></td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>발현 삽입물로 B.subtilis의 GFP 유전자와 PhoD 신호 펩타이드의 융합으로 pEKEx2 플라스미드를 운반합니다. 플라스미드는 카나마이신 저항성을 제공합니다. Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash에 의해 설명 및 발표됨; 42 (2007년)</td></tr></tbody></table>

자동화 된 microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

산업 바이오 생산 미생물 세포 공장을 사용 하 여 핵심 사업 스트레인 엔지니어링의 반복적인 프로세스 이며 bioprocess 조건의 최적화. 1 개의 중요 한 양상은 관심 제품의 미생물 형성을 위한 최적의 환경을 제공 하기 위해 재배 매체의 개선 이다. 그것은 잘 미디어 구성 전체 bioprocess 성능을 좌우할 극적으로 허용 합니다. 영양 중간 최적화 재조합 단백질을 향상 알려져 있다 미생물 시스템 및 따라서이 생산 bioprocess 개발에서 보람 있는 단계입니다. 그러나, 수시로 표준 미디어 조리법에서에서 가져온 문학, 재배 매체의 맞춤형 디자인 microbioreactor 기술 지원 뿐만 아니라 충분 한 재배 처리량, 빠른 제품 분석을 요구 하는 지루한 작업 이므로 액체에 신뢰성 있게 로봇 공학 실험실에 의하여 처리 하는 단계. 또한, 고급 수학 메서드는 합리적으로 측정 데이터를 분석 하 고 효율적으로 최적의 정보 콘텐츠를 달성 하기와 같은 병렬 실험을 설계 하는 데 필요한.
제시 프로토콜의 일반 자연 다른 실험실 장비, 다른 식 호스트 및 관심, 뿐만 아니라 추가 bioprocess 매개 변수 대상 단백질에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 또한, 다른 최적화 목표 단백질 생산 속도, 특정 수익률, 또는 제품 품질 같은 다른 최적화 연구의 범위에 맞게 선택할 수 있습니다. 적용된 Kriging 도구 상자 (KriKit) 일반 도구에 대 한 디자인의 실험 (DOE) 향상 된 전체적인 bioprocess 최적화에 기여 하는. 그것은 또한 업스트림 및 다운스트림 프로세스 최적화에 중요 한 될 수 있는 다 객관적인 최적화를 지원 합니다.

은닉 GFP의 titer를 극대화 하기 위한 도입된 프로토콜 적용 되었습니다. 특히,는 GFP titer 후 재배의 17 h 최적화 목적으로 선정 되었다. GFP의 온라인 형광 탐지 간단한 제품 정량화를 허용. 그러나, GFP 신호 참조 재배에서 데이터의 정규화 재현성 및 결과의 comparability 불가결 하지 않습니다. 미디어 구성 요소의 사전 선택 섹션 1에서 설명한 대로 합리적으로 수행 되었다. 실험 제 1의 지침에 따라 수행 했다: 젖은 실험실 절차의 매개 변수가 일관성과 결과의 재현성을 보장 하는 모든 연구에 대 한 정의 했다.
제 2에 설명 된 대로 추가, 더 자세한 연구를 위한 최적화 목표에 중요 한 영향을 보여주는 관련 구성 요소를 식별 하는 데 초기 심사 수행 되었다. MTP 기반 MBR 시스템 48 실험을을 동시에 수행할 수 있습니다. 11-6 소수 적절 한 선택을 디자인 한 MTP (48)에 병렬 실험의 최대 가능한 번호 및 미디어 구성 요소 (11)은 24의 총 수 있습니다. 이 실험 설계 32 실험 구성 하 각 조사 미디어 구성 요소에 대 한 주요 효과의 추정 하며 나머지 재배 웰 스 (16) 여러 복제 참조 매체와 실험의 재현성 및 위치 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 즉, 각 실험 한 번 실시 (복제), 참조 실험 (5 복제)를 제외 하 고.
표 1 의 심사 분석 결과 요약합니다. 고려 농도 범위에서 대부분의 미디어 컴포넌트를 다양 한 목적에 눈에 띄는 효과 표시 하지 않았습니다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 강한 긍정적인 추세를 표시 하는 동안 구성 요소 NH4+ 강한 부정적인 효과 보여줍니다. Mg2 + 의 효과 현재 농도 범위에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 더 넓은 농도 범위에 대 한 수 있습니다. 따라서, NH4+ 매체에서 생략 하 고 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 추가 실험의 효과 조사 하기 위하여 결정 되었다.
제 3 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +의 농도 변화 하는 동안 GFP 형광 신호를 극대화 하는 데 사용 되는 반복 최적화 절차를 설명 합니다. 반복 1, NH4+ 생략 될 수 있다 가설 테스트를 했다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 의 농도 범위는 심사 분석에서 채택 되었다. NH4+ 의 최소 농도 0으로 설정 하 고 최대 농도 검사 실험에서 채택 되었다. 다음 실험에서 구성 요소 농도 27 실험의 결과로 정의 된 농도 범위 내 3 그리드 x 3 x 3는 배 부 되었다. 모든 경작 하는 동안 참조 매체의 5 복제 포함 했다 아무 위치 효과 MTP 통해 발생 하 고 내부 표준으로 봉사. 나머지 16 우물의 NH4+, 캘리포니아2 +, Mg2 + 농도 무작위로 주어진된 범위 안에 배포 했다.
그림 5 A 첫 번째 반복의 결과 시각화. 축 레이블을 원래 참조 매체에 사용 되는 구성 요소 농도를 참조 Ref x로 표시 된. 푸른 표면 KriKit 소프트웨어를 사용 하 여 계산 된 Kriging 보간을 나타냅니다. 각 표면 NH4+ 에 대 한 상대적인 농도와 연결 됩니다 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 이 시각적 유리한 NH4+를 생략 하는 것을 보여준다. 보간 표면 농도 증가 함께 모든 비행기 상승으로 또한 마그네슘2 + 그리고 캘리포니아2 +의 긍정적인 효과 보여줍니다.
반복 1의 결과 바탕으로, 그것은 결정 되었다 두 배로 최대 농도 농도 범위의 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 를 확장 하 고 실험 설계 창 우측 상단에 이동의 그림 5 참조 B.이 범위 내의 농도 6 × 6 격자에 배 부 되었다. 이 전체 농도 범위, 최적의 Kriging 보간 결과 동등한 배급을 보장 합니다. 그림 5 B 쇼 Kriging 보간 음모 결합 된 데이터에 따라 두 반복 (붉은 점 들과 노란색 사각형) 측정. 모두, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 그들의 농도 증가의 긍정적인 효과 계속 됩니다. 따라서, 절차는 최대 농도 두 배로 반복 했다 하 고 따라서, 실험적인 디자인 창 오른쪽 상단 모서리의 경계를 탐구에 이동 되었다.
그림 6 A 나머지 최적화 절차의 개요를 제공. 반복 3까지 수집 된 데이터 세트의 분석 Mg2 +, 즉, 한 최적 농도 범위의 Mg2 + 의 긍정적인 효과의 한계 발견 했다 밝혔다. 따라서에 캘리포니아2 + (반복 4) 농도 범위 확대 결정 되었다. 이 절차를 두 번 반복 (반복 5, 6) GFP 신호의 채도 찾을 때까지. 이 채도 셀에 사용할 수 없습니다의 캘리포니아2 +, 적용된 농도 대 한 Ca-소금의 강 수에 의해 설명 된다.
실험 결과 항상 소음에 의해 교란 된다, 결과 Kriging 보간 나타납니다 불규칙 한 고 검사 틀린 결론으로 이어질 수도 있습니다. 그러나, 최적 농도 범위의 포화 GFP 신호에 대 한 미디어 구성 요소 통계 z-검정, 또한 KriKit에서 구현 되는 안정적으로 식별할 수 있습니다. Z-검정 Kriging 메서드, 즉, 예측 값 및 제공 예측 불확실성 본질적인 통계 정보 직접 사용 합니다. 그림 6 B 확인 된 고원, KriKit 도구 상자를 사용 하 여 결정 하 고 시각화 된 보여줍니다.KriKit 도구 상자 자유롭게 사용할 수36 와 그것의 기능을 사용 하는 방법을 설명 하는 자세한 자습서와 함께 제공 됩니다.
두 개 이상의 관련 구성 요소가 발견 되 면, 3D 시각화의 한계에 도달 합니다. KriKit 영화 또는 "상영 작" 등 다른 여러 가지 가능한 시각적 방법을 제공합니다. 최적의 잠재력 정의 된 농도 범위 안의 경우, 새로운 실험 예상된 향상 률40,46을 사용 하 여 자동으로 설계 됩니다. 예상된 향상 률에 따라 실험 설계 KriKit 도구에 통합 된다. 더 자세한 정보는 소프트웨어 설명서에서 찾을 수 있습니다.
반복 절차 후 결과 확인 실시, 부분 d.에 설명 된 대로 초기가 정의 타당성 최적의 매체 구성을 사용 하 여 추가 민감도 분석을 수행 하 여 확인 했다. 즉, 관심의 모든 초기 미디어 구성 요소 변화 했다, 그러나 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 그들의 최적 농도 수준으로 설정 했다. 이 연구에서 최적의 농도 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 Ref x와 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref 선정 됐다. 표 2 는 유효성 검사의 결과 보여 줍니다. NH (cf. 표 1), 심사 초기 감도 비슷한4+ 아직도 상당한 부정적인 영향 있으며 나머지 효과 여전히 무시할 수 있습니다.
때문에 쉬운 접근, 재배 정지에서 GFP 형광 신호 모든 실험 동안 extracellular GFP titer를 계량 하 사용 되었다. 확인을 위해 GFP 형광은 다른 측정에 대 한 유효성이 검사 됩니다. GFP는 문신-통로 통해 분 비, 때문에 형광 신호 사이 내-extracellular GFP 차별 수 없습니다. 따라서, 경작 기준 매체와 최적화 된 매체를 사용 하 여 재현 했다. 셀 무료 재배 supernatants에서 형광 측정 외 단백질 콘텐츠 Bradford 분석 실험과 (반) 정량은-SDS 페이지15시각 질적 GFP 개선. 모든 결과 측정 신호 했다 약 두 배가 경작에 대 한 검증 기준 매체에 비해 최적화 된 매체는 분 비 성능 최적화 된 매체의 약 100% 향상. 따라서, 재배 서 스 펜 션의 GFP 특정 형광 여겨질 수 있다 최적화 목적, 즉, extracellular GFP titer에 대 한 적합 한 통계.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
그림 2 : 민감도 분석에 대 한 볼륨 pipetting 목록에서 스크린샷. 첫 번째 열에 있는 항목 행;의 모든 볼륨에 고유한 식별자 할당 이 식별자는 MTP 잘 그림 4C cf. 액체 처리기 작업 테이블에 대상 재배 MTP의 번호입니다. 나머지 열 pipetted 수를 다른 솔루션 ("Sln-01" "Sln-15")에 대 한 볼륨을 인코딩합니다. 한 행의 누적 볼륨 잘 해당 최종 재배 볼륨에 해당 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
그림 3 : 제어 소프트웨어 "WinPREP"를 처리 하는 액체에서 스크린샷. 왼쪽: 행 정렬 명령을, pipetted 수를 재고 각 솔루션에 대 한 전송 명령을 포함 합니다. Inoculum 추가 대 한 마지막 명령 하기 전에 사용자 프롬프트 씨 문화 시간에 테이블에 배치 됩니다 보장 하기 위해 삽입 됩니다. 나머지 재고, 물 및 미디어 준비 대상 재배 MTP inoculum, 변형 주식 (12 열 같은 웰 스와 2 개의 깊은 잘 격판덮개), 시 약 물에 대 한 소스 기구를 포함 하 여 작업 테이블의 오른쪽: 회로도 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
그림 4 : 재고 솔루션의 pipetting의 설치에 대 한 상세한 스크린샷 편집. (A) 철 재고 pipetting 명령을 풀어. 소스 기구 및 소스 잘 내는 작업 테이블에 의해 표시 읽기 프레임 및 해당 깊은 잘 격판덮개의 붉은 열. 대상 기구와 내 대상 우물 주위 블루 프레임 대상 재배 MTP의 블루 웰 스에 의해 표시 됩니다. 이 단계 (철 재고 솔루션) pipetting 볼륨의 할당에 (B) 상세한 예제 보기. 취항지 수는 48 행 pipetting 목록에서 읽습니다. Fe 재고 솔루션에 대 한 모든 대상 웰 스에 대 한 디스 펜스 볼륨 열 4 pipetting 목록에서에서 발견 된다. Note pipetting 목록에서 첫 번째 열 식별자 및 전송, 그림 2참조 하지 볼륨 포함. (C) 세부 사항 잘 번호 대상에. 해당 pipetting 목록의 행 # 1에에서 작성 된 볼륨 잘 # 1으로 표시로 pipetted 될 것입니다. 웰 스 #01, #08, # 41와 #48 또한 재배 MTP 자체에 인쇄 된 웰 스 A01, A08, F01 및 F08 알파-숫자 코딩에 대 한에 해당 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
그림 5 : 첫 번째 반복에서 결과 상세한. (A) 반복 1의 실험 데이터를 기반으로 하는 Kriging 보간. 빨간 점 데이터 집합을 나타냅니다. 비교를 위해, 모든 3 보간 서피스는 하나의 음모에 오버레이 (진한 파란색: 0 Ref, 체크 무늬 x: 1 Ref, 밝은 파란색 x: 2 Ref x). 결과 대 한 대체 표현은 다른15를찾을 수 있습니다. (B) 실험에 따라 Kriging 보간 반복 1 (빨간 점) 및 반복 2 (노란색 사각형)에 수행.이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
그림 6 : 반복적으로 수집된 최적화 결과의 묘사. (A) 최종 Kriging 예측 모델. Z통계 기반으로 하는 최적의 지역 (빨간색)의 (B) 통계 확인-테스트는 KriKit에 의해 제공 됩니다. 상자는 반복적인 디자인의 연속 단계와 실험의 실행을 나타냅니다. 이 그림에 표시 하는 데이터의 부분15이전에 게시 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>정규화 계수 값을 의미</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>미네소타2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>무42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>캘리포니아2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계로 표준 문학에 발견 하 고 여기에 사용, 표준 편차 대표 직접 참조 실험의 복제로 인해 실험 변형. 계수 값은 maxium 값 (구성 Ca2 +0.0422)으로 정규화 됩니다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 0.54와 0.0226, 이다.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>정규화 계수 값을 의미</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>미네소타2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>무42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 최종 민감도 분석의 결과. 계수 값의 최대 값을 그것의 중심 값에서 해당 미디어 구성 요소 농도 증가 하는 때 평균 효과 나타내는. 최적의 실험 설계를 사용로 표준 편차만 최적화 된 중간 구성을 사용 하 여 실험 변형에 따라 다릅니다. 실험적인 변형 참조 매체를 사용 하 여 변형에 비해 약간 증가 했다. 계수 값은 maxium 값 (구성 요소 미네소타2 +0.0106)으로 정규화 되었다. 정규화 된 절대 계수 표준 편차 각각 3.63와 0.0385, 이다.

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

충분한 배양 처리량을 위해 크링잉(Kringing) 기반 실험 설계와 미생물반응기 기술을 결합한 이 반복적인 워크플로우의 전반적인 목표는 미생물 배양 배지의 맞춤형 설계를 위한 일반적인 접근법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 배양 배지의 최적화, 바이오프로세스 조건 및 균주 표현형과 같은 미생물 바이오프로세스 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 작은 대사 산물 생산에 최적화된 배양 배지가 이종 단백질 생산에도 가장 적합한지 자문했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.이 기술의 가장 큰 장점은 실험과 모델링의 스마트한 조합을 통해 전체 개발 시간을 단축한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Roman Jansen입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 방법의 개념 및 정의에 대한 연구로 이 절차를 시작합니다.70% 에탄올로 플레이트를 닦은 다음 층류 후드에서 건조시켜 작업 테이블에 저장할 수 있는 딥 웰 플레이트를 멸균합니다. 작업 세포 은행에서 1개의 분취액과 함께 리터당 25mg의 카나마이신을 포함하는 50ml의 BHI 배지를 접종하여 종자 배양을 시작합니다. 필요한 모든 실험기구를 로봇 작업 테이블에 놓고 해당 실험기구에 스톡 용액을 붓습니다.그런 다음 배지 준비를 위한 로봇 작업 흐름을 시작하여 마지막 단계인 접종이 종자 배양 시작에 맞춰 도달하도록 합니다. 약 2시간 후에 종자 배양을 샘플링하여 600나노미터 또는 O-D-600에서 광학 밀도를 측정하여 성장을 모니터링합니다. 매 시간마다 성장을 계속 모니터링하십시오.약 5시간 후, 배양액은 3-4 사이의 O-D-600에 도달하고 주요 배양물을 접종하는 데 사용됩니다. 종자 배양액을 액자 처리기 작업 테이블에 놓고 배지 준비 프로토콜을 계속합니다. 접종 후 배양 마이크로타이터 플레이트를 밀봉하십시오.다음으로 밀봉된 배양 M-T-P를 바이오렉터 장치에 넣습니다. 그런 다음 미리 정의된 재배 프로토콜을 시작합니다. 필요한 경우 생물 안전 규정에 따라 나머지 원액을 폐기하십시오.그런 다음 로봇 작업 테이블에서 배양을 시드합니다. Liquid Handler 오염 제거 프로토콜을 시작하기 전에 재사용 가능한 실험기구를 세척하십시오. 17시간의 실행 시간 후에 기본 culture를 중지하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 처리합니다.G-F-P 역가를 정량화하려면 먼저 모든 배양 웰의 세포 현탁액을 사전 라벨이 있는 반응 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 벤치탑 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리하여 cell이 없는 상층액을 얻습니다. 다음으로, 각 무 세포 상등액 200 마이크로 리터를 바닥이 투명한 검은 색 96 웰 M-T-P로 옮깁니다.적절한 마이크로플레이트 리더를 사용하여 여기(excitation)의 경우 488나노미터, 방출 파장의 경우 520나노미터에서 G-F-P 특정 형광을 판독합니다. G-F-P 형광을 측정한 후, 마이크로플레이트는 Bradford 또는 B-C-A 분석과 같은 표준 프로토콜로 무세포 상등액의 단백질 함량을 측정하는 데 직접 사용할 수 있습니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다.시연된 절차는 한 차례의 실험으로 구성되며, 그 결과는 G-F-P 신호의 최대 예상 개선으로 추가 라운드를 설계하는 데 사용됩니다. 참조 실험은 데이터 변동성을 분석하고 실험적 이상값을 감지하기 위해 각 라운드에 배치됩니다. 이 등고선도는 최적화 절차의 개요를 제공합니다.3차 반복을 통해 수집된 데이터 세트를 분석한 결과, 마그네슘의 긍정적 효과에 한계가 있음이 밝혀져 최적의 농도 범위를 확인할 수 있었습니다. 따라서 4차 반복에서 칼슘에 대해서만 농도 범위를 더 확장하기로 결정했습니다. 이 절차는 G-F-P 신호의 포화가 발견될 때까지 5와 6번 반복되었습니다.이 포화는 세포에서 사용할 수 없는 칼슘의 적용된 농도에 대한 칼슘 염의 침전으로 설명됩니다. 일곱 번째 반복은 경계를 더 자세히 탐색하는 데 사용되었습니다. 포화된 G-F-P 신호에 대한 매체 성분의 최적 농도 범위는 통계적 Z-테스트를 통해 안정적으로 식별할 수 있습니다.Kringing 키트 도구 상자를 사용하여 결정되고 시각화된 식별된 고원을 보여줍니다. Kringing 키트 도구 상자는 무료로 사용할 수 있으며 기능 사용 방법을 설명하는 자세한 자습서와 함께 제공됩니다. 제시된 프로토콜의 일반적인 특성으로 인해 다른 미생물 발현 숙주를 연구하거나 당화(glycosylation) 패턴 또는 이황화 결합(disulfide bond)과 같은 표적 단백질의 다른 특성을 최적화하는 것과 같은 다양한 적응이 가능합니다.배액 시스템의 통합으로 실험 처리량이 증가하여 시간을 크게 절약할 수 있습니다.완전히 제어 가능하고 유입 가능한 생물 반응기를 양막 시스템으로 교체할 때 결과의 확장성을 고려해야 합니다. 수학적 모델링 및 실험계획법은 연구 목표와 관련하여 측정 데이터의 정보 내용을 최대화하는 데 도움이 됩니다.

generic-protocol-for-optimization-heterologous-protein-production

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

출처: 헤머리히 J. 외 자동화된 미생물반응기 기술을 이용한 이종 단백질 생산 최적화 프로토콜. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 다양한 배지 제형에 반응하여 박테리아 성장과 형광 단백질 분비를 모니터링하기 위해 자동화된 미생물 반응기를 사용하는 방법을 시연합니다. 분비성 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아는 항생제 선별 하에 배양되어 영양분이 다양한 웰에 접종됩니다. 세포 밀도와 형광의 실시간 광학 측정은 다양한 성장 조건에서 단백질 생산을 비교 분석할 수 있게 합니다.

자동화된 미생물반응기를 이용한 다양한 배지 제형에서 박테리아 성장 모니터링

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

여기에서, 우리는 단백질 A 열을 사용하여 세포 수확 및 단백질 정량화에 선행된 자동화된 마이크로 bioreactor에 있는 실험의 디자인을 실행하는 상세한 절차를 제시합니다.

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 미생물 배양 배지 최적화를 위한 반복적 워크플로우와 크리깅 기반 실험 설계 및 자동화된 마이크로바이오리액터 기술을 활용한 방법입니다. 이 기술은 단백질 생산 효율성을 높이고 개발 시간을 단축합니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

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