2017년 12월 15일
이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.
충분한 배양 처리량을 위해 크링잉(Kringing) 기반 실험 설계와 미생물반응기 기술을 결합한 이 반복적인 워크플로우의 전반적인 목표는 미생물 배양 배지의 맞춤형 설계를 위한 일반적인 접근법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 배양 배지의 최적화, 바이오프로세스 조건 및 균주 표현형과 같은 미생물 바이오프로세스 개발 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 작은 대사 산물 생산에 최적화된 배양 배지가 이종 단백질 생산에도 가장 적합한지 자문했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.
이 기술의 가장 큰 장점은 실험과 모델링의 스마트한 조합을 통해 전체 개발 시간을 단축한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Roman Jansen입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 방법의 개념 및 정의에 대한 연구로 이 절차를 시작합니다.
70% 에탄올로 플레이트를 닦은 다음 층류 후드에서 건조시켜 작업 테이블에 저장할 수 있는 딥 웰 플레이트를 멸균합니다. 작업 세포 은행에서 1개의 분취액과 함께 리터당 25mg의 카나마이신을 포함하는 50ml의 BHI 배지를 접종하여 종자 배양을 시작합니다. 필요한 모든 실험기구를 로봇 작업 테이블에 놓고 해당 실험기구에 스톡 용액을 붓습니다.
그런 다음 배지 준비를 위한 로봇 작업 흐름을 시작하여 마지막 단계인 접종이 종자 배양 시작에 맞춰 도달하도록 합니다. 약 2시간 후에 종자 배양을 샘플링하여 600나노미터 또는 O-D-600에서 광학 밀도를 측정하여 성장을 모니터링합니다. 매 시간마다 성장을 계속 모니터링하십시오.
약 5시간 후, 배양액은 3-4 사이의 O-D-600에 도달하고 주요 배양물을 접종하는 데 사용됩니다. 종자 배양액을 액자 처리기 작업 테이블에 놓고 배지 준비 프로토콜을 계속합니다. 접종 후 배양 마이크로타이터 플레이트를 밀봉하십시오.
다음으로 밀봉된 배양 M-T-P를 바이오렉터 장치에 넣습니다. 그런 다음 미리 정의된 재배 프로토콜을 시작합니다. 필요한 경우 생물 안전 규정에 따라 나머지 원액을 폐기하십시오.
그런 다음 로봇 작업 테이블에서 배양을 시드합니다. Liquid Handler 오염 제거 프로토콜을 시작하기 전에 재사용 가능한 실험기구를 세척하십시오. 17시간의 실행 시간 후에 기본 culture를 중지하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 처리합니다.
G-F-P 역가를 정량화하려면 먼저 모든 배양 웰의 세포 현탁액을 사전 라벨이 있는 반응 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 벤치탑 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 10분 동안 세포 현탁액을 원심분리하여 cell이 없는 상층액을 얻습니다. 다음으로, 각 무 세포 상등액 200 마이크로 리터를 바닥이 투명한 검은 색 96 웰 M-T-P로 옮깁니다.
적절한 마이크로플레이트 리더를 사용하여 여기(excitation)의 경우 488나노미터, 방출 파장의 경우 520나노미터에서 G-F-P 특정 형광을 판독합니다. G-F-P 형광을 측정한 후, 마이크로플레이트는 Bradford 또는 B-C-A 분석과 같은 표준 프로토콜로 무세포 상등액의 단백질 함량을 측정하는 데 직접 사용할 수 있습니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 분석을 진행합니다.
시연된 절차는 한 차례의 실험으로 구성되며, 그 결과는 G-F-P 신호의 최대 예상 개선으로 추가 라운드를 설계하는 데 사용됩니다. 참조 실험은 데이터 변동성을 분석하고 실험적 이상값을 감지하기 위해 각 라운드에 배치됩니다. 이 등고선도는 최적화 절차의 개요를 제공합니다.
3차 반복을 통해 수집된 데이터 세트를 분석한 결과, 마그네슘의 긍정적 효과에 한계가 있음이 밝혀져 최적의 농도 범위를 확인할 수 있었습니다. 따라서 4차 반복에서 칼슘에 대해서만 농도 범위를 더 확장하기로 결정했습니다. 이 절차는 G-F-P 신호의 포화가 발견될 때까지 5와 6번 반복되었습니다.
이 포화는 세포에서 사용할 수 없는 칼슘의 적용된 농도에 대한 칼슘 염의 침전으로 설명됩니다. 일곱 번째 반복은 경계를 더 자세히 탐색하는 데 사용되었습니다. 포화된 G-F-P 신호에 대한 매체 성분의 최적 농도 범위는 통계적 Z-테스트를 통해 안정적으로 식별할 수 있습니다.
Kringing 키트 도구 상자를 사용하여 결정되고 시각화된 식별된 고원을 보여줍니다. Kringing 키트 도구 상자는 무료로 사용할 수 있으며 기능 사용 방법을 설명하는 자세한 자습서와 함께 제공됩니다. 제시된 프로토콜의 일반적인 특성으로 인해 다른 미생물 발현 숙주를 연구하거나 당화(glycosylation) 패턴 또는 이황화 결합(disulfide bond)과 같은 표적 단백질의 다른 특성을 최적화하는 것과 같은 다양한 적응이 가능합니다.
배액 시스템의 통합으로 실험 처리량이 증가하여 시간을 크게 절약할 수 있습니다.완전히 제어 가능하고 유입 가능한 생물 반응기를 양막 시스템으로 교체할 때 결과의 확장성을 고려해야 합니다. 수학적 모델링 및 실험계획법은 연구 목표와 관련하여 측정 데이터의 정보 내용을 최대화하는 데 도움이 됩니다.
본 원고에서는 반복적 워크플로우를 이용한 맞춤형 미생물 배양 배지 설계의 일반적인 접근 방식을 설명합니다. 이 방법은 크리깅(Kriging) 기반의 실험 설계와 마이크로바이오리액터 기술을 결합하여 배양 처리량과 신뢰성을 높이는 것입니다.
본 프로토콜은 균주 개발 및 바이오 공정 효율의 핵심 단계인 이종 단백질 생산을 위한 미생물 배양 배지 최적화라는 바이오 제약 분야의 과제를 다룹니다. Kriging 기반의 실험 설계와 마이크로 바이오리액터 기술 및 로봇 액체 핸들링을 통합함으로써, 이 방법은 배지 최적화 주기를 단축하고 배지 조성의 예측 신뢰도를 향상시킵니다. 범용적이고 적응 가능한 이 워크플로우는 재조합 단백질 수율과 공정 강건성을 높이는 최적의 영양 조건을 데이터 기반으로 신속하게 식별함으로써 초기 발견 단계의 의사 결정을 지원합니다.
이 방법은 균주 공학부터 리드 물질 식별까지의 발견 연속성 단계에 부합하며, 여기서 배지 최적화는 단백질 발현 수준과 하위 공정의 실현 가능성에 직접적인 영향을 미칩니다.