실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

이 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 분석기(RTCA)가 장착된 상용 전자 플레이트를 재생하는 것입니다. 이 방법은 RTCA에 사용되는 전자 계획의 재생을 포함하여 일회용 금 기반 칩 분야의 재생에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 독성이 낮고 순하고 쉽게 구할 수 있는 실험실 시약을 사용하여 재생 절차를 수행할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 금기반 칩인 Real-Time Cell Analyzer를 사용하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양 접시에서 A549 세포의 배양 및 증식으로 이 절차를 시작합니다. 150마이크로리터의 세포 배지를 전자 플레이트 L8의 각 배양 웰에 추가합니다. 평형을 위해 플레이트를 생물 안전 후드에 30분 동안 그대로 두십시오.

30분 후, 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에 있는 Real-Time Cell Analyzer의 전자판 L8을 수동으로 삽입합니다. 그런 다음 컴퓨터에서 Real-Time Cell Analyzer 작동 프로그램을 시작합니다. 기본 실험 패턴 설정 페이지에서 Experiment Model을 선택하고 실행 중인 분석의 이름을 지정합니다.

레이아웃 페이지에서 실험에 포함된 해당 웰을 선택하고 편집 상자에 세포 유형, 번호 및 약물 이름과 같은 정보를 입력합니다. 일정 페이지에서 실험 단계를 추가한 다음 각 단계의 실행 시간과 실시간 데이터 수집 간격을 선택합니다. 시작을 클릭하여 미디어의 배경 임피던스를 측정합니다.

실험 파일이 저장됩니다. 결과 데이터는 자동으로 뺍니다. 플롯 페이지에서 wells를 추가하면 time-cell index의 그래프가 표시됩니다.

세포 증식 실험의 경우 먼저 일시 중지 버튼을 클릭하여 프로그램을 일시 중지합니다. 그런 다음 전자 플레이트를 꺼내고 실온에서 웰당 100마이크로리터의 A549 셀 서스펜션 버퍼를 추가합니다. 플레이트를 생물 안전 후드에 30분 동안 그대로 두어 세포가 배양 웰의 바닥에 정착하도록 합니다.

실시간 세포 분석기 스테이션에 전자 플레이트를 수동으로 삽입합니다. 그런 다음 시작 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다. 플롯 페이지에서 분석기는 실험 전반에 걸쳐 셀 인덱스 값 또는 곡선을 지속적으로 기록합니다.

실험이 완료되면 플롯 페이지로 들어가 실험 파일을 엽니다. 그런 다음 테스트된 모든 배양 웰과 결과 세포 인덱스 곡선을 선택하여 제약 약물을 추가하거나 분석 간의 변동을 줄이기 위해 배지를 변경하기 전에 마지막으로 평균화 또는 정규화할 수 있습니다. 데이터 분석 페이지에서 EC50 또는 IC50을 계산할 수 있습니다.

Text Protocol에 기재된 대로 항암제의 세포독성 평가를 실시한 후, Real-Time Cell Analyzer 스테이션에서 세포가 들어있는 전자판을 꺼냅니다. 사용한 전자 플레이트를 실온의 멸균 생물 안전 후드에 넣고 피펫을 사용하여 배양 배지를 철저히 혼합합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 전체 매체를 흡인합니다.

전자 플레이트를 200마이크로리터의 탈이온수로 실온에서 3회 헹굽니다. 0.25% 갓 준비한 트립신으로 전자 플레이트의 나머지 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 1-2시간 동안 소화합니다. 분해가 완료되면 실온의 생물 안전 후드에서 작업하여 피펫을 사용하여 배양 용액을 5-10회 혼합한 다음 용액을 제거합니다.

전자 플레이트를 200마이크로리터의 탈이온수로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 100 % 에탄올로 두 번 세척 한 다음 동일한 양의 75 % 에탄올을 두 번 세척합니다. 마지막으로 200마이크로리터의 탈이온수로 두 번 더 헹굽니다.

멸균 거즈나 티슈 페이퍼에 전자 플레이트를 뒤집어 실온에서 남은 물을 디캔팅합니다. 그런 다음 재생된 전자 플레이트에서 실온의 생물 안전 후드에서 1-2시간 동안 자외선 살균을 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메조포러스 물질을 사용하여 약물 전달을 위해 플레이트를 사용한 후 이전과 같이 트립신으로 나머지 세포를 분해합니다.

피펫은 실험에 자주 사용되므로 팁과 마이크로칩 표면이 긁히지 않도록 사람이 주의를 기울여야 합니다. 실온의 생물 안전 후드에 200마이크로리터의 탈이온수로 마이크로칩을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 200마이크로리터의 절대 에탄올로 마이크로칩을 두 번 상승시킵니다.

다음으로, 실온에서 한 번 200마이크로리터의 75% 에탄올로 마이크로칩을 헹굽니다. 각 웰에 250마이크로리터의 75% 에탄올을 추가하고 실온에서 밀봉 필름으로 전자 플레이트를 밀봉합니다. 전자 플레이트를 114회 G로 2분 동안 돌린 후 플레이트를 비웁니다.

멸균 거즈 또는 티슈 페이퍼에 전자 플레이트를 뒤집어 실온에서 남은 액체를 디캔팅합니다. 75% 에탄올 헹굼 후 탈수를 반복합니다. 그런 다음 재생된 전자 플레이트에서 실온의 생물 안전 후드에서 1-2시간 동안 자외선 살균을 수행합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 먼저 인큐베이션의 바닥 부분을 분해하여 재생된 전자판 표면의 광학적 특성을 평가합니다. 신선하고 재생된 전자 플레이트에서 항암제 흡수 후 부착된 세포의 생존력을 평가하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 A549 세포에 흡수된 DOX 분자의 자연 형광을 모니터링합니다. 세포에 의해 흡수된 DOX의 자발적 형광을 기록하려면 63배 오일 대물렌즈와 485나노미터를 여기 파장으로 사용합니다.

다음으로, 먼저 금 전극과 유리질 탄소 전극을 연마 천에 일루미노슬러리를 사용하여 거울과 같은 표면으로 연마하여 재생 전극의 전기화학적 거동을 평가합니다. 그런 다음 전극을 물에 초음파로 처리하여 입자를 제거합니다. 다음으로, 0.5 몰 황산에서 금 전극을 활성화하십시오.

1밀리몰 페라시아나이드 칼륨을 함유한 10밀리몰 칼륨-염화칼륨-전해질 용액에서 베어 골드 전극과 유리 탄소 전극의 전기화학 임피던스 분광법 또는 EIS 데이터를 얻습니다. 이제 GCE의 금 전극 표면에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨립니다. 세포를 추가한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포로 변형된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전에 섭씨 37도의 인큐베이터에서 GCE의 금 전극을 3시간 동안 배양합니다.

전극을 재생하려면 0.25% 트립신의 세포로 변형된 GCE에 금 전극을 0.5-2시간 동안 담그십시오. 두 전극을 물로 네 번 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 전극을 절대 에탄올로 부드럽게 네 번 헹굽니다.

다음으로, 금 전극을 75% 에탄올에 약 5분 동안 GCE에 담그십시오. 5분 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재생된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전에 칩을 75% 에탄올로 부드럽게 4번 헹굽니다. 배열된 금 전자 플레이트의 재생 효율을 평가하기 위해 신선 전자 플레이트와 처리된 전자 플레이트 모두에 대한 현미경 관찰이 이루어졌습니다.

마이크로칩 표면의 광학적 특성에서 가상의 차이는 발견되지 않았습니다. 독소루비신 분자의 Throescence는 재생 전후에 금 마이크로칩의 세포 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 유사한 균질성과 잘 정의된 세포 형태는 칩의 재사용성을 입증했습니다.

재생 프로토콜은 세포 증식의 실제 테스트에 적용됩니다. 테스트된 전자 플레이트의 여러 인큐베이션 웰에서 얻은 성장 곡선은 우수한 일관성을 보여 상업용 칩의 성공적인 재생을 나타냅니다. 여기에 표시된 바와 같이, 재생된 전자판 L8은 메조다공성 실리카 재료를 사용하여 세포 독성 평가를 위해 테스트되었습니다.

메조다공성 물질로 처리된 시료의 세포 지수는 대조군에 비해 감소하여 물질의 약간의 세포 독성을 나타냅니다. 메조다공성 물질에 의한 항암제 독소루비신의 추가 캡슐화 및 방출은 A549 세포의 성장 곡선을 급격히 감소시켰습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 유형 싱크 소화 시간이 칩마다 다를 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 또는 분광학, 전기 화학 임피던스 분광법과 같은 다른 방법을 수행하여 재생 효과 평가와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.