실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

본 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 분석기(Real-Time Cell Analyzer, RTCA)용 상용 전자 플레이트를 재생하는 것입니다. 이 방법은 RTCA에 사용되는 전자 플레이트의 재생을 포함하여, 일회용 금 기반 칩 재생 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 독성이 낮고 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 온화한 시약을 사용하여 재생 절차를 수행할 수 있다는 점입니다.

저희는 비용이 많이 드는 금 기반 칩을 사용하는 Real-Time Cell Analyzer를 사용하기 시작하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양 접시에서 A549 세포를 배양 및 증식시키는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 전자 플레이트 L8의 각 배양 웰에 세포 배지 150 µL를 추가하십시오. 평형화를 위해 플레이트를 생물 안전 작업대(bio-safety hood) 내에 30분 동안 두십시오.

30분 후, 37°C CO2 인큐베이터 내의 Real-Time Cell Analyzer에 전자 플레이트 L8을 수동으로 삽입합니다. 다음으로, 컴퓨터에서 Real-Time Cell Analyzer 작동 프로그램을 실행합니다. 기본 실험 패턴 설정 페이지에서 Experiment Model을 선택하고, 실행할 분석의 이름을 지정합니다.

레이아웃 페이지에서 실험에 포함된 해당 웰을 선택하고, 편집 상자에 세포 유형, 수, 약물 이름 등의 정보를 입력하십시오. 스케줄 페이지에서 실험 단계를 추가한 다음, 각 단계의 실행 시간과 실시간 데이터 획득 간격을 선택하십시오. 시작을 클릭하여 배지의 배경 임피던스를 측정하십시오.

실험 파일이 저장됩니다. 결과 데이터는 자동으로 차감됩니다. 플롯 페이지에서 웰을 추가하면, 시간-세포 지수 그래프가 표시됩니다.

세포 증식 실험을 위해, 먼저 일시 정지 버튼을 클릭하여 프로그램을 중단하십시오. 그런 다음 전자 플레이트를 꺼내어 실온에서 웰당 100 microliters의 A549 세포 현탁 완충액을 추가합니다. 세포가 배양 웰 바닥에 가라앉을 수 있도록 플레이트를 생물 안전 작업대 내에 30분 동안 둡니다.

실시간 세포 분석기 스테이션에 전자 플레이트를 수동으로 삽입하십시오. 그런 다음 시작 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다. 플롯 페이지에서 분석기는 실험 전체 과정 동안 세포 지수 값, 즉 곡선을 지속적으로 기록합니다.

실험이 완료되면 플롯 페이지로 들어가 실험 파일을 엽니다. 그런 다음, 분석 간의 편차를 줄이기 위해 약물을 첨가하거나 배지를 교체하기 전 마지막으로 평균화 또는 정규화할 수 있는 모든 테스트 배양 웰과 그에 따른 세포 지수 곡선을 선택합니다. 데이터 분석 페이지에서 EC50 또는 IC50을 계산할 수 있습니다.

본문 프로토콜에 기술된 대로 항암제의 세포독성 평가를 수행한 후, Real-Time Cell Analyzer 스테이션에서 세포가 포함된 전자 플레이트를 꺼냅니다. 사용한 전자 플레이트를 상온의 멸균 바이오 안전 후드 내에 두고, 피펫을 사용하여 배양액을 충분히 혼합합니다. 그 다음, 피펫을 사용하여 배양액 전체를 흡입하여 제거합니다.

전자 플레이트를 실온에서 200 µL의 탈이온수로 3회 헹굽니다. 전자 플레이트에 남아 있는 세포를 37 °C 인큐베이터에서 0.25% 갓 제조한 trypsin으로 1~2시간 동안 소화시킵니다. 소화가 완료되면, 실온의 생물안전작업대(bio-safety hood) 내에서 피펫을 사용하여 배양액을 5~10회 혼합한 후, 해당 용액을 제거합니다.

전자 플레이트를 200 µL의 탈이온수로 2회 헹굽니다. 그다음 200 µL의 100% ethanol로 2회 세척하고, 이어서 동일한 부피의 75% ethanol로 2회 세척합니다. 마지막으로 200 µL의 탈이온수로 다시 2회 헹굽니다.

전자 플레이트를 멸균 거즈나 티슈 페이퍼 위에 뒤집어 실온에서 남은 물을 따라냅니다. 그 다음, 생물안전 작업대(bio-safety hood) 내 실온에서 재생된 전자 플레이트를 1~2시간 동안 자외선 멸균합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메조포러스 재료를 이용한 약물 전달에 플레이트를 사용한 후, 이전과 동일하게 trypsin으로 남은 세포를 분해합니다.

실험에서 피펫을 빈번하게 사용하므로, 팁과 마이크로칩 표면에 흠집이 생기지 않도록 주의해야 합니다. 생물안전작업대(bio-safety hood) 내에서 상온의 탈이온수 200 microliters로 마이크로칩을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 상온의 절대 에탄올 200 microliters로 마이크로칩을 두 번 헹굽니다.

다음으로, 상온에서 75% ethanol 200 µL로 마이크로칩을 한 번 헹굽니다. 각 웰에 75% ethanol 250 µL를 넣고, 상온에서 실링 필름으로 전자 플레이트를 밀봉합니다. 전자 플레이트를 114 ×g에서 2분 동안 원심 분리한 후, 플레이트의 용액을 비웁니다.

실온에서 남은 액체를 따라내기 위해 멸균 거즈나 티슈 페이퍼 위에 전자 플레이트를 뒤집어 놓습니다. 75% ethanol 세척과 원심분리 과정을 반복합니다. 그 다음, 생물안전 작업대(bio-safety hood) 내 실온에서 재생된 전자 플레이트를 1~2시간 동안 자외선 멸균합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양 웰의 하단부를 먼저 분해하여 재생된 전자 플레이트 표면의 광학적 특성을 평가합니다. 신규 및 재생 전자 플레이트에서 항암제 흡수 후 부착된 세포의 생존력을 평가하기 위해, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 A549 세포에 흡수된 DOX 분자의 자발적 형광을 모니터링합니다. 세포에 흡수된 DOX의 자발적 형광을 기록하려면 63배 오일 대물렌즈를 사용하고 들뜸 파장을 485 nanometers로 설정하십시오.

다음으로, 먼저 금 전극과 글래시 카본 전극을 연마 천 위에서 illuminoslurry를 사용하여 거울 같은 표면이 되도록 연마함으로써 재생된 전극의 전기화학적 거동을 평가합니다. 그 후 전극을 물에서 초음파 세척하여 모든 입자를 제거합니다. 다음으로, 0.5-molar 황산에서 금 전극을 활성화합니다.

1mM potassium ferricyanide가 포함된 10mM potassium chloride 전해질 용액에서 bare gold 전극과 glassy carbon 전극의 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS) 데이터를 얻습니다. 그 다음, GCE 내 gold 전극 표면에 세포 현탁액 10µL를 떨어뜨립니다. 세포를 첨가한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포로 변형된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전까지 GCE의 gold 전극을 37°C 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다.

전극을 재생하려면, 세포로 수식된 GCE 내의 금 전극을 0.25% trypsin에 0.5~2시간 동안 담그십시오. 두 전극을 물로 4회 부드럽게 헹굽니다. 그 다음, 전극을 절대 에탄올로 4회 부드럽게 헹굽니다.

다음으로, GCE 내의 금 전극을 75% ethanol에 약 5분 동안 담급니다. 5분 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재생된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전, 칩을 75% ethanol로 4회 부드럽게 헹굽니다. 어레이 형태 금 전극 플레이트의 재생 효율을 평가하기 위해, 신규 전극 플레이트와 처리된 전극 플레이트 모두에 대해 현미경 관찰을 수행하였습니다.

마이크로칩 표면의 광학적 특성에서 가상적인 차이는 발견되지 않았습니다. 재생 전후의 금 마이크로칩 상의 세포 상태를 평가하기 위해 doxorubicin 분자의 형광을 이용하였습니다. 유사한 균질성과 명확한 세포 형태는 칩의 재사용 가능성을 입증하였습니다.

재생 프로토콜은 세포 증식의 실제 테스트에 적용됩니다. 테스트된 전자 플레이트의 여러 배양 웰에서 얻은 성장 곡선은 우수한 일관성을 보여주며, 이는 상용 칩의 재생이 성공적이었음을 나타냅니다. 여기서는 재생된 전자 플레이트 L8을 사용하여 메조포러스 실리카 재료의 세포독성 평가를 테스트한 결과를 보여줍니다.

중공성 물질 처리 시료의 세포 지수는 대조군에 비해 감소하였으며, 이는 해당 물질의 약간의 세포 독성을 나타냅니다. 중공성 물질을 통해 항암제 doxorubicin을 추가로 캡슐화하고 방출시키자 A549 세포의 성장 곡선이 급격히 감소하였습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 타입 싱크(type sink) 소화 시간은 칩마다 다를 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 재생 효과 평가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경법, 또는 분광법, 전기화학 임피던스 분광법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.