Name: 실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 학습하세요 실시간 세포 분석기용 금 마이크로전극 재생 방법을 A549 세포를 이용하여. 저독성 시약으로 비용을 절감하고 지속 가능한 실험 환경을 구축할 수 있습니다.

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일 국가 자연 과학 재단의 중국 (U1703118), 프로젝트 우선 순위 학술 프로그램 개발의 장쑤 등 교육 기관 (PAPD), 강 소 Shuangchuang 프로그램, 주 키의 오픈 펀드 자금에 의해 지원 되었다 화학/바이오 센 싱 및 Chemometrics (2016015)와 Biomacromolecules (2017kf05)의 국가 연구소 및 Jiangsu Specially-Appointed 교수 프로젝트, 중국의 실험실

주: 일반적으로, 재생성 프로세스 포함 한다 트립 신 소화와 에탄올과 물으로 헹 구는 단계. 소화 시간이 사용 하는 셀의 수에 따라 변경 하 고 사용 하는 셀의 수는 실험 목적에 따라 다를 수 있습니다. 광학 및 전기 화학적 방법을 사용 하 여 재생 조건 최적화 재생성 된 마이크로 칩을 확인 하는 것이 좋습니다. 실험 기간 동안 가용성과 불용 성 화학 물질 관련 되어있을 수 있습니다, 그리고 여기 재생 절차의 두 가지 일반적인 경우가 자세히 나와 있습니다.
1입니다. 재생 솔루션의 준비
참고: 준비 하 고 무 균 조건 하에서 모든 솔루션을 처리.
<ol><li>신선한 0.25% (g/v) trypsin 솔루션을 준비 합니다. 트립 신 구입 하거나 갓 다음과 같이 준비 될 수 있습니다.<ol>
<li>트립 신 pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 ml의 0.25 g을 분해.</li>
		<li>트립 신 완전히 어떤 거품 형성을 방지 하도록 낮은 속도로 솔루션 4 oC. 볶음에 해산 될 때까지 솔루션을 저 어.</li>
		<li>Biosafety 두건에서 0.22 μ m 필터 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>절대 에타 놀을 사용 하 여 75% 에탄올을 준비 합니다. 절대 에탄올 75 mL 부피 플라스 크에 부 어 하 고 볼륨 100 mL에 도달할 때까지 이온된 수를 추가 합니다. 필요한 경우 더 살 균을 수행 합니다.</li>
</ol>2. 부 화 및 전자 번호판에 A549 세포의 확산
참고: 전자 판 16 형식과 L8는 모두 만든 기준점과 골드 microelectrodes 외피 우물의 바닥에 있고 인쇄의. 전자 판 L8 8 웰 스는 전자 판 16 16 웰 스는. 16 전자 판의 우물이 라운드 동안 전자 판의 L8 우물이 둥근된 사각형. 8 각 전자 판의 볼륨 잘 약 830 µ L 이며 각 전자 판 16 잘 약 270 µ L입니다.
<ol><li>A549 세포 배양<ol>
<li>로스웰 파크 기념 연구소-1640 매체 (RPMI-1640) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보충에 문화 A549 세포 세포 배양에서 페니실린 스 요리.</li>
		<li>셀 밀도 ~ 75%에 도달 하면 세포를 통과 다음 1 × PBS 부착 셀 레이어를 세척 하 고 세포를 트립 신을 제거 하 5 분에 대 한 179 × g에서 0.25 %trypsin 솔루션 37 oC. 원심 분리기에서 1 분 동안 trypsinize. 10 mL 매체 더 문화에 대 한 셀 이나 다른 실험 resuspend. 참고: 셀 중간에 resuspended의 솔루션은 여기 셀 서 스 펜 션 버퍼로 지정 됩니다.</li>
		<li>10 µ L에 밖으로가 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. RPMI-1640 매체를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 버퍼 30000-80000 셀/mL 셀 서 스 펜 션 버퍼는 실험에 대 한 준비를 더 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
확산/세포 독성 실험 및 데이터 수집
	<ol>
<li>전자 판 16 및 두고는 biosafety에 30 분 동안 평형에 대 한 후드의 각 화를 50 µ L (150 µ L 전자 접시 L8) 셀 매체를 추가 합니다. 수동으로 실시간 세포 분석기 37 oc.에 CO2 배양 기에서 16 전자 플레이트를 삽입</li>
		<li>컴퓨터에서 실시간 세포 분석기 프로그램을 시작 합니다. 그것의 기본에 실험 패턴 설정 페이지 "모델 실험" 선택 하 고 이름을 실행 분석 결과.</li>
		<li>레이아웃 페이지에 해당 우물 실험에 포함 된 편집 상자에 셀 유형, 수 및 마약 이름 같은 정보를 입력을 선택 합니다. 일정 페이지에서 실험 단계 추가 다음 각 단계 및 실시간 데이터 수집 간격의 실행 시간 (예를 들어,: 12, 24 또는 48 h)를 선택 합니다. 참고: 여기, 단계 1과 2의 간격은 1 분 및 15 분 후.</li>
		<li>파일을 저장 하 고;의 셀 인덱스 페이지에 미디어의 배경 임피던스를 측정 하기 위해 "시작" 버튼을 클릭 결과 데이터는 자동으로 공제 됩니다. 그래프 잘 페이지에 모든 잘 곡선을 방문 수 있습니다. 음모 페이지에 추가 우물과 시간 셀 인덱스의 그래프를 보여주는 것입니다.</li>
		<li>셀 확산 실험을 위해 첫째로 프로그램을 일시 중지 하려면 "일시 정지" 버튼을 클릭 합니다. 그리고 전자 접시 꺼내 실 온에서 잘 당 100 µ L A549 세포 현 탁 액 버퍼를 추가 합니다. 셀 부 화 우물의 바닥에 정착 하도록 biosafety 두건에서 30 분 동안 접시를 남겨 주세요.</li>
		<li>실시간 세포 분석기 역에서 전자 접시를 수동으로 삽입 합니다. 실험을 계속 "시작" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 음모 페이지 분석기 지속적으로 기록 셀 인덱스 값 또는 실험을 통해 곡선.</li>
		<li>실험 완료 되 면 음모 페이지를 입력 하 고 실험 파일을 엽니다. 모든 테스트 인큐베이션 우물과 평균 수 또는 의약품 추가 또는 분석 실험 사이 변이 줄이기 위해 매체를 변경 하기 전에 마지막으로 정규화 결과 셀 인덱스 커브를 선택 합니다. 데이터 분석 페이지에 EC50 또는 IC50는 산출 될 수 있다</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 전자 번호판의 재생
참고: 각 헹 구는 단계에 대 한 전자 판에 솔루션 혼합 철저 하 게 (5-10 배)를 피 펫을 사용 하 여.
<ol><li>
사례 1: 대 한 세포 독성 평가 안티 -암 약물
	<ol>
<li>2 절에서 설명한 대로 전자 판에 씨앗 A549 세포.</li>
		<li>먼저 셀 중간에 항 암 약물 독 소 루비 염 (DOX) 해산. 천천히 (DOX의 최종 농도 30 µ g/mL)는 세포에 DOX를 추가 피 펫을 사용 하 여. 2 절에 설명 된 대로 CI를 기록 합니다. 참고: 사용 하는 전자 판 실험 완료 후 즉시 생성 했다. 이 경우에, DOX는 녹는 화학 프로토콜에 따라 전자 판의 재생은 상대적으로 쉽게 처리 하 고 아무 추가 단계는 필요.</li>
		<li>
재생
		<ol>
<li>실시간 세포 분석기 역에서 세포를 포함 하는 전자 접시를 꺼내. 실내 온도에서 살 균 biosafety 두건에서 사용된 전자 접시를 놓고 문화 매체를 피 펫을 사용 하 여 철저 하 게 혼합 합니다. 모든 매체에 밖으로 플라스틱.</li>
			<li>실 온에서 3 번 전자 번호판 200 µ L 이온된 물으로 린스.</li>
			<li>1-2 h 37 oc.에 인큐베이터에 (200 µ L/물론)에 대 한 신선한 0.25 %trypsin 전자 판에 남아 있는 세포를 소화 소화 완료 되 면 5-10 시간 사용 하 여 피 펫 및 모든 솔루션을 피펫으로 실 온에서 biosafety 두건에서 부 화 솔루션을 혼합.</li>
			<li>각각, 다음과 같이 200 µ L 에탄올 및 200 µ L 물, 전자 플레이트 린스: 이온된 수 2 회, 100% 에탄올 2 회; 75% 에탄올 2 번; 저온 2 번. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.</li>
			<li>자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판. 참고: L8 전자 판의 재생에 대 한 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
사례 2: 마약 배달 mesoporous 소재를 사용 하 여입니다.
	<ol>
<li>5.6의 평균 기 공 크기 막대 같은 mesoporous 실리 카 재료를 사용 하 여 이전에 보고 된20마약 배달 매트릭스로 nm. 참고: 여기, 전자 판 세포에 약물 방출 효과 모니터링 하는 데 고용 되었다.<ol>
<li>전자 판 각의 부 화 솔루션으로 mesoporous 자료를 추가 합니다. 실리 카 재료 가용성과 전자 판에서 촉진 되지 않는, 접시 같이 씻어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>사례 1에 설명 된 대로 단계 3.1.3.1-3.1.3.3를 수행 합니다.</li>
		<li>실 온에서 biosafety 두건에서 200 µ L 이온된 물으로 마이크로 칩을 한 번 린스.</li>
		<li>실 온에서 200 µ L 절대 에탄올과 마이크로 2 번을 씻어.</li>
		<li>실 온에서 200 µ L 75% 에탄올과 마이크로 칩을 한 번 씻어.</li>
		<li>각 잘에서 75% 에탄올의 250 µ L을 추가 하 고 실 온에서 씰링 필름 전자 접시를 봉인.</li>
		<li>2 분 동안 114 x g에서 회전 시키십시오 그리고 전자 판 빈. 멸 균 거 즈 또는 실내 온도에 나머지 물을 가만히 따르다 휴지에 전자 접시 반전.</li>
		<li>한 번 3.2.5-3.2.7 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>자외선 소독 biosafety 후드 실 온에서 1-2 h에 대 한 재생된 전자 판. 참고: L8 전자 번호판을 rinsing 때 모든 솔루션의 볼륨을 두 번.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 재생 효과의 평가
<ol><li>
재생성 된 전자 플레이트 표면의 광학 특성
	<ol>
<li>사용 강철 신선한의 외피의 하단 부분을 신중 하 게 분해 숟가락과 전자 플레이트 포함 된 재생성 짓고 금 microelectrodes. 플라스틱 장갑을 착용, 신중 하 게 강철 스푼을 사용 하 여 전자 판에서 마이크로 칩이 포함 된 부분을 닦으십시오.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드의 가운데에 두 부분을 놓고21CCD 검출기 장착 하는 라만 현미경으로 결과 라만 스펙트럼을 수집 합니다. 참고:는 분석기 633 nm 레이저 장착 했다 고 스펙트럼 파장 500-3500 c m-1의 범위에서 30 s 레이저 노출의 간격에 기록 되었다. 광학 이미지 라만 현미경으로 10 배 눈 렌즈 50 x 목표를 사용 하 여 얻은 했다. 그림 1A 와 그림 1C 또한 설치 된 라만 현미경 장치를 사용 하 여 얻은 했다.</li>
		<li>신선 하 고 재생성에 항 암 약물 이해 후 연결 된 세포의 생존 능력을 평가 하 전자 번호판, 사용 confocal 레이저 스캐닝 현미경 DOX 분자 A549 흡수의 자발적인 형광을 모니터링 하.<ol>
<li>셀 (신선 하 고 재생성 전자 번호판 A549 세포)를 사용 하 여 흡수 DOX의 자발적인 형광을 기록 하는 63 X 객관적이 고 485 nm 여기 파장으로 오일.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재생성 된 전극의 전기 화학 행동 참고: 상업 전자 판의 수동 숨기는 어렵고 확인 표면 전기 상태의 평가 대 한 좋지 않은, 프로토콜의 재생 효율은 평가 테스트로 일반 골드/유리 탄소 전극 (GCE)를 사용 하 여 플랫폼, 전기 화학 임피던스 분광학 (EIS) 수행 되었다. Au 전극 및 GCE의 직경 3 m m. 전기 데이터 3 전극 시스템으로 전기 화학 분석기에 의해 가져온는 임피던스 측정에서 10 mV 진폭의 교류 전류 (AC) 신호를 사용 하 여 실시 했다는 넓은 주파수 0.01 hz에서 100 kHz의 범위.<ol>
<li>측정 전에 모든 입자를 제거 하는 물에서 쥡니다 뒤 닦는 피복에는 알 루미나 슬러리와 거울 같은 표면에 Au 전극과 GCE 폴란드어.</li>
		<li>그래서 0.5 M H2에서 Au 전극 활성화4. 설명된22로 10 m m 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 KCl 전해질 솔루션 맨 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.</li>
		<li>2.1.2 및 2.1.3 재고 A549 세포 솔루션을 준비 합니다. Au 전극과 GCE의 표면에 10 µ L 세포 현 탁 액을 드롭. Au 전극 및 GCE 3 h. Au 전극의 얻을 EIS 데이터에 대 한 37 oC 인큐베이터에서 셀 수정 GCE에 10mm KCl 전해질 솔루션 1 m m K3[Fe(CN)6]를 포함 하는 셀으로 품 어.</li>
		<li>
전극을 측정 EIS 및 프로토콜을 사용 하 여 다시 생성 합니다.
		<ol>
<li>Au 전극 담가 그리고 GCE 셀 수정 0.5-2 0.25 %trypsin h. Au 전극과 GCE 부드럽게 물으로 씻어 4 번. 린스 부드럽게 절대 에탄올과 전극 4 번. Au 전극 immerge와 ~ 5 분에 대 한 75% 에탄올에 GCE 린스 75% 에탄올과 부드럽게 칩 4 번.</li>
			<li>10mm KCl 전해질 솔루션 1 m K m3[Fe(CN)6] 포함 된 재생성 Au 전극과 GCE의 EIS 데이터를 가져옵니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Loo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+regenerate+piezoelectric+microcantilever+sensors+%28PEMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS).</a> Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).</li>
<li>Fischer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931708005972">Gold cleaning methods for electrochemical detection applications.</a> Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 몇 가지 가능한 방법17,23,24,25,26 표 1에 마이크로 칩을 다시 생성에 대 한 요약. 기본적으로, 이러한 방법은 상대적으로 가혹한 실험 조건 면역 단지 SPR 칩에 사용 되는 등 강한 분자-분자 상호 작용의 존재 때문에 칩의 완전 한 재생을 달성에 참여. 그러나, 이러한 가혹한 실험 조건 RTCA에 사용 되는 기준점과 골드 마이크로 칩의 표면 특성에 대 한 매우 해로울 수 있습니다. 따라서, 온화 하 고 효율적인 방법을 제시 재생 전략의 개발에 주요 고려 했다. 동등 하 게 중요 한 다른 요소는 이러한 일회용 마이크로 표적된 암 세포와 함께 자주 사용 되는 때문에 환경 문제입니다.
<p...

레이블 없는 셀 기반 기술 proteomics1,2의 측면에서와 같은 분석으로 검사 목적을 위해 지난 10 년간 급속 한 성장을 목격 했다 때문에 그것의 효율적인 갈수록 많은 실험 과정, , 마약 배달3, 등4,5 비교 셀 분석, 프로토 이전 Giaever 및 동료에 의해 개발 된6 라벨 무료 실시간 세포 분석 실험 목적으로 전통적인 생 화 확 적인 방법으로 정량 방식으로 세포 성장 또는 마이그레이션의 연속 측정을 허용 하는 셀에 연결 된 마이크로 칩의 표면에 전기 신호 변화를 기록 하는 원칙에 기반. 이 전략에 따라 실시간 셀 전기 임피던스 기반 탐지 원리를 사용 하 여 (RT-CES) 시스템은 도입된7,8 그리고 더 최근의 상업 실시간 세포 분석기 (RTCA) 감지 전자 출범 실험실 연구9에 대 한.
상업 실시간 세포 분석기 주로 incubated 세포 등 세포 증식, 마이그레이션, 생존, 형태학, 준수에의 생리 적 변화에서 결과 전기 임피던스의 evoked 신호에 세포 읽는다 고 마이크로 칩10,11의 표면. 이러한 전기 신호는 더 셀 상태를 평가 하기 위해 셀 인덱스 (CI) 라는 크기가 없는 매개 변수 변환 분석기. 마이크로 칩의 임피던스의 변화는 주로 전극/솔루션 인터페이스에 대상된 셀의 로컬 이온 환경을 반영합니다. 따라서, 세포 분석기의 분석 성능 핵심 감지 장치, 일회용 마이크로 (즉, 소위 전자 판, 예를 들어, 96/16/8-잘), 기준점과 골드 microelectrodes로 만들어진에 크게 의존 있고 외피 우물의 바닥에 인쇄. 금 microelectrodes 원에 선 형식 (그림 1)에서 조립 및 연결 된 셀3,12,13의 역동적이 고 민감한 탐지를 허용 하는 인큐베이션 우물의 표면적의 대부분을 커버 ,14. CI의 셀 칩, 더 많은 표면 적용의 경우 증가 하 고 세포 apoptosis의 결과로 toxicant에 노출 되 면 감소. 일회용 전자 격판덮개는 물가가 가장 비싼는 비록 실시간 세포 분석기 자주 사용 세포 독성11 neurotoxicity15 결정 클래식 끝점 방법 보다 더 많은 운동 정보를 제공 하 소모품입니다.
지금까지, 아니 사용할 수 있는 메서드는 아마도 사실은 피 솔루션 또는 초 산 등의 가혹한 재생 조건 관련된16,17, 는 전자 판의 재생을 위한 되었습니다. 18, 하 금 마이크로 칩의 전기 상태를 변경할 수 있습니다. 따라서, 골드 칩의 표면에서 부착 세포와 다른 물질을 제거 하는 온화 하 고 효율적인 방법 전자 판 재생 프로세스에 대 한 바람직한 것입니다. 우리는 최근 일회용 전자 번호판 비 부식성 시 약을 사용 하 여 재생 하기 위한 프로토콜을 개발 하 고 재생성된 칩 광학 뿐만 아니라 전기 화학 방법19특징 이었다. 트립 신, 에탄올 등 쉽게 구할 수 있고 온건 실험실 시 약을 사용해 서, 우리는 두 가지 주요 유형 생성에 성공적으로 적용 되는 불리 한 효과 없이 상업적인 전자 접시를 다시 생성 하는 일반적인 방법 설립 전자 판의 RTCA (16, L8) 사용.

<table><tbody><tr><td>쥐 : Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat # 400</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 쥐 CD11b 단클론 (클론 OX42)</td> <td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>패닝 : 1 : 1,000; 염색: 1:500</td></tr><tr><td>염소 다대장 항-IBA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>토끼 다클론 안티-Ki67&nbsp;</td><td>아브캠&nbsp;</td><td>Cat# AB15580</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 안티 마우스 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 안티 염소 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 안티 토끼 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>염색: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (ICC 염색 시 세제)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>헤파란 설페이트</td><td>갈렌 실험실 용품</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마&nbsp;</td>우유 고형물에서 나온 <td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>쥐 IL-34</td><td>R& D 시스템</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>양모 콜레스테롤</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>코닝&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>올레산</td><td>케이맨 화학&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) 산</td><td>케이맨 화학제품&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM 염료</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/ 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (고포도당)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신&nbsp;</td><td>시그마</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 플레이트&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>재고 시약&nbsp; </td><td>재구성&nbsp; </td><td>농도 사용</td><td>Storage</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>10 mg/mL in PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>5 mg/mL H2O&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>°C; C</td></tr><tr><td>나트륨 셀렌 나이트</td><td>2.5 mg / mL H2O&nbsp;</td><td>1:25,000-20</td><td>°C; C</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>200 &mu; g/mL(PBS&nbsp);</td><td>1:100-80</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td>20 &무; g/mL(PBS&nbsp);</td><td>1:10,000-20</td><td>°C; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>100 &뮤; g/mL(PBS&nbsp);</td><td>1:1,000-80</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>양모 콜레스테롤</td><td>1.5 mg/mL 100% 에탄올&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>°C; C</td></tr><tr><td>헤파란 황산염</td><td>1 mg/mL in H2O</td><td>1:1,000-20</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>올레산 / 곤도 산</td><td>곤도 산 : 0.001 mg / mL; 올레산: 100% 에탄올에서 0.1 mg/mL;</td><td>1:1,000-20</td><td>°C; C</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>50 mg/mL PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>솔루션&nbsp; </td><td>레시피&nbsp; </td><td></td><td>Comments</td></tr><tr><td>관류 버퍼</td><td>50 &mu; g/mL 헤파린(DPBS++(PBS with Ca++ and Mg+ +)</td><td></td>얼음처럼 <td>차가울 때 사용</td></tr><tr><td>Douncing Buffer</td><td>200 &mu; 50 mL의 DPBS++ 때 사용하는 50 mL의 0.4% DNaseI의 L</td><td></td> DPBS++Microglia Growth Medium(MGM)DMEM/F12 100 units/mL 페니실린을 함유하는 DMEM/F12;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> g/mL 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 5 &μ; g/mL N-아세틸 시스테인, 5 &mu; g/mL 인슐린, 100 &mu; g/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 아셀렌산</td><td></td>나트륨 <td>얼음처럼 차가운 MGM을 사용하여 접시에서 미세아교세포를 제거합니다.</td></tr><tr><td>콜라겐 IV 코팅</td><td>MGM 함유 2 &mu; g/mL 콜라겐 IV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미엘린 분리 완충액</td><td>9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2</td><td></td> <td>첨가 후 잘 섞습니다&nbsp; CaCl2 및 MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/콜레스테롤 함유 성장 매체(TIC)&nbsp;</td><td>인간 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 &mu를 함유하는 MGM; g/mL 양모 콜레스테롤, 10 &mu; g/mL 헤파란 황산염, 0.1 &mu; g/ml 올레산, 및 0.001 &mu; g/ml 곤도산</td><td></td><td>37°C로 예열된 매체에 콜레스테롤을 추가하십시오. C를 선택하고 1.5 이상을 추가하지 마십시오 &mu; g/mL 또는 침전됩니다. 콜레스테롤 함유 매체를 여과하지 마십시오. 최적의 pH를 보장하기 위해 세포에 추가하기 전에 30분-1시간 동안 10% CO2로 TIC 배지를 평형화합니다.</td></tr></tbody></table>

실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 microelectrodes의 재생

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

레이블 없는 세포 기반 분석 결과 유리한 그것 때문에 생 화 확 적인 연구 실험 동물의 사용을 요구 하지 않습니다. 고아 한 생 화 확 적인 분석 실험 보다 생리 적 조건 하에서 세포에 대 한 보다 동적인 정보를 제공 하는 기능 때문이 라벨 무료 실시간 셀 분석 결과 전기 임피던스 원리에 따라 과거 동안 더 많은 관심 유치는 10 년입니다. 그러나, 그것의 실용적인 활용 비싼 소모품 일회용 골드 마이크로칩이 세포 분석기에 사용 되는 측정의 상대적으로 비싼 비용으로 인해 제한 된 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 상업 레이블 없는 세포 분석기 장착 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 개발 했습니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다. 제안 된 메서드는 테스트 되었고 세 번 이상 중생 및 상업적인 전자 번호판의 반복된 사용에 대 한 효과적인 것으로 표시 실시간 세포 분석 실험의 높은 운영 비용에 저장 연구를 도움이 될 것입니다.

골드 마이크로 칩의 표면 특성:이 프로토콜에 사용 되는 재생 절차는 그림 1에 설명 했다. 그림 2 는 미세한 표면 신선한의 사진 및 광학 현미경에 의해 전자 번호판을 다시 생성. 같이 그림 2A 에 그림 2C, 현미경 관찰 표시 했음을 사실상 마이크로 칩의 광학 속성에 차이가 신선한 사이 표면 하 고 전자 번호판을 취급. 셀 상태의 평가 대 한 편리한 셀에 포함 된 독 소 루비 분자의 자발적인 형광을 사용 하 여, 우리 (그림 2B 와 그림 2D 재생성 후 골드 마이크로 칩에 배양된 세포의 유사한 동질성을...

이 프로토콜 높은 실행 비용 ofmicrochip 기반 분석에 절약 목적으로 레이블 없는 세포 분석기 장착 상업 기준점과 골드 microelectrodes를 다시 생성 하는 일반적인 전략을 설명 합니다. 재생성 프로세스 트립 신 소화, 에탄올과 물, 그리고 마이크로 칩의 반복된 사용을 가능 하 게 회전 단계와 rinsing 포함 되어 있습니다.

실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

본 절차의 전반적인 목표는 실시간 세포 분석기(Real-Time Cell Analyzer, RTCA)용 상용 전자 플레이트를 재생하는 것입니다. 이 방법은 RTCA에 사용되는 전자 플레이트의 재생을 포함하여, 일회용 금 기반 칩 재생 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 독성이 낮고 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 온화한 시약을 사용하여 재생 절차를 수행할 수 있다는 점입니다.저희는 비용이 많이 드는 금 기반 칩을 사용하는 Real-Time Cell Analyzer를 사용하기 시작하면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양 접시에서 A549 세포를 배양 및 증식시키는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 전자 플레이트 L8의 각 배양 웰에 세포 배지 150 µL를 추가하십시오. 평형화를 위해 플레이트를 생물 안전 작업대(bio-safety hood) 내에 30분 동안 두십시오.30분 후, 37°C CO2 인큐베이터 내의 Real-Time Cell Analyzer에 전자 플레이트 L8을 수동으로 삽입합니다. 다음으로, 컴퓨터에서 Real-Time Cell Analyzer 작동 프로그램을 실행합니다. 기본 실험 패턴 설정 페이지에서 Experiment Model을 선택하고, 실행할 분석의 이름을 지정합니다.레이아웃 페이지에서 실험에 포함된 해당 웰을 선택하고, 편집 상자에 세포 유형, 수, 약물 이름 등의 정보를 입력하십시오. 스케줄 페이지에서 실험 단계를 추가한 다음, 각 단계의 실행 시간과 실시간 데이터 획득 간격을 선택하십시오. 시작을 클릭하여 배지의 배경 임피던스를 측정하십시오.실험 파일이 저장됩니다. 결과 데이터는 자동으로 차감됩니다. 플롯 페이지에서 웰을 추가하면, 시간-세포 지수 그래프가 표시됩니다.세포 증식 실험을 위해, 먼저 일시 정지 버튼을 클릭하여 프로그램을 중단하십시오. 그런 다음 전자 플레이트를 꺼내어 실온에서 웰당 100 microliters의 A549 세포 현탁 완충액을 추가합니다. 세포가 배양 웰 바닥에 가라앉을 수 있도록 플레이트를 생물 안전 작업대 내에 30분 동안 둡니다.실시간 세포 분석기 스테이션에 전자 플레이트를 수동으로 삽입하십시오. 그런 다음 시작 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다. 플롯 페이지에서 분석기는 실험 전체 과정 동안 세포 지수 값, 즉 곡선을 지속적으로 기록합니다.실험이 완료되면 플롯 페이지로 들어가 실험 파일을 엽니다. 그런 다음, 분석 간의 편차를 줄이기 위해 약물을 첨가하거나 배지를 교체하기 전 마지막으로 평균화 또는 정규화할 수 있는 모든 테스트 배양 웰과 그에 따른 세포 지수 곡선을 선택합니다. 데이터 분석 페이지에서 EC50 또는 IC50을 계산할 수 있습니다.본문 프로토콜에 기술된 대로 항암제의 세포독성 평가를 수행한 후, Real-Time Cell Analyzer 스테이션에서 세포가 포함된 전자 플레이트를 꺼냅니다. 사용한 전자 플레이트를 상온의 멸균 바이오 안전 후드 내에 두고, 피펫을 사용하여 배양액을 충분히 혼합합니다. 그 다음, 피펫을 사용하여 배양액 전체를 흡입하여 제거합니다.전자 플레이트를 실온에서 200 µL의 탈이온수로 3회 헹굽니다. 전자 플레이트에 남아 있는 세포를 37 °C 인큐베이터에서 0.25% 갓 제조한 trypsin으로 1~2시간 동안 소화시킵니다. 소화가 완료되면, 실온의 생물안전작업대(bio-safety hood) 내에서 피펫을 사용하여 배양액을 5~10회 혼합한 후, 해당 용액을 제거합니다.전자 플레이트를 200 µL의 탈이온수로 2회 헹굽니다. 그다음 200 µL의 100% ethanol로 2회 세척하고, 이어서 동일한 부피의 75% ethanol로 2회 세척합니다. 마지막으로 200 µL의 탈이온수로 다시 2회 헹굽니다.전자 플레이트를 멸균 거즈나 티슈 페이퍼 위에 뒤집어 실온에서 남은 물을 따라냅니다. 그 다음, 생물안전 작업대(bio-safety hood) 내 실온에서 재생된 전자 플레이트를 1~2시간 동안 자외선 멸균합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 메조포러스 재료를 이용한 약물 전달에 플레이트를 사용한 후, 이전과 동일하게 trypsin으로 남은 세포를 분해합니다.실험에서 피펫을 빈번하게 사용하므로, 팁과 마이크로칩 표면에 흠집이 생기지 않도록 주의해야 합니다. 생물안전작업대(bio-safety hood) 내에서 상온의 탈이온수 200 microliters로 마이크로칩을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 상온의 절대 에탄올 200 microliters로 마이크로칩을 두 번 헹굽니다.다음으로, 상온에서 75% ethanol 200 µL로 마이크로칩을 한 번 헹굽니다. 각 웰에 75% ethanol 250 µL를 넣고, 상온에서 실링 필름으로 전자 플레이트를 밀봉합니다. 전자 플레이트를 114 ×g에서 2분 동안 원심 분리한 후, 플레이트의 용액을 비웁니다.실온에서 남은 액체를 따라내기 위해 멸균 거즈나 티슈 페이퍼 위에 전자 플레이트를 뒤집어 놓습니다. 75% ethanol 세척과 원심분리 과정을 반복합니다. 그 다음, 생물안전 작업대(bio-safety hood) 내 실온에서 재생된 전자 플레이트를 1~2시간 동안 자외선 멸균합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양 웰의 하단부를 먼저 분해하여 재생된 전자 플레이트 표면의 광학적 특성을 평가합니다. 신규 및 재생 전자 플레이트에서 항암제 흡수 후 부착된 세포의 생존력을 평가하기 위해, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 A549 세포에 흡수된 DOX 분자의 자발적 형광을 모니터링합니다. 세포에 흡수된 DOX의 자발적 형광을 기록하려면 63배 오일 대물렌즈를 사용하고 들뜸 파장을 485 nanometers로 설정하십시오.다음으로, 먼저 금 전극과 글래시 카본 전극을 연마 천 위에서 illuminoslurry를 사용하여 거울 같은 표면이 되도록 연마함으로써 재생된 전극의 전기화학적 거동을 평가합니다. 그 후 전극을 물에서 초음파 세척하여 모든 입자를 제거합니다. 다음으로, 0.5-molar 황산에서 금 전극을 활성화합니다.1mM potassium ferricyanide가 포함된 10mM potassium chloride 전해질 용액에서 bare gold 전극과 glassy carbon 전극의 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS) 데이터를 얻습니다. 그 다음, GCE 내 gold 전극 표면에 세포 현탁액 10µL를 떨어뜨립니다. 세포를 첨가한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포로 변형된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전까지 GCE의 gold 전극을 37°C 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다.전극을 재생하려면, 세포로 수식된 GCE 내의 금 전극을 0.25% trypsin에 0.5~2시간 동안 담그십시오. 두 전극을 물로 4회 부드럽게 헹굽니다. 그 다음, 전극을 절대 에탄올로 4회 부드럽게 헹굽니다.다음으로, GCE 내의 금 전극을 75% ethanol에 약 5분 동안 담급니다. 5분 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재생된 전극의 EIS 데이터를 얻기 전, 칩을 75% ethanol로 4회 부드럽게 헹굽니다. 어레이 형태 금 전극 플레이트의 재생 효율을 평가하기 위해, 신규 전극 플레이트와 처리된 전극 플레이트 모두에 대해 현미경 관찰을 수행하였습니다.마이크로칩 표면의 광학적 특성에서 가상적인 차이는 발견되지 않았습니다. 재생 전후의 금 마이크로칩 상의 세포 상태를 평가하기 위해 doxorubicin 분자의 형광을 이용하였습니다. 유사한 균질성과 명확한 세포 형태는 칩의 재사용 가능성을 입증하였습니다.재생 프로토콜은 세포 증식의 실제 테스트에 적용됩니다. 테스트된 전자 플레이트의 여러 배양 웰에서 얻은 성장 곡선은 우수한 일관성을 보여주며, 이는 상용 칩의 재생이 성공적이었음을 나타냅니다. 여기서는 재생된 전자 플레이트 L8을 사용하여 메조포러스 실리카 재료의 세포독성 평가를 테스트한 결과를 보여줍니다.중공성 물질 처리 시료의 세포 지수는 대조군에 비해 감소하였으며, 이는 해당 물질의 약간의 세포 독성을 나타냅니다. 중공성 물질을 통해 항암제 doxorubicin을 추가로 캡슐화하고 방출시키자 A549 세포의 성장 곡선이 급격히 감소하였습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때 타입 싱크(type sink) 소화 시간은 칩마다 다를 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 재생 효과 평가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경법, 또는 분광법, 전기화학 임피던스 분광법과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

regeneration-arrayed-gold-microelectrodes-equipped-for-real-time-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 MEA(Multi-Electrode Array) 기반 분석을 사용하여 고유 척수 연결의 기능적 재생을 보여줍니다. 척수 절편은 MEA에 배치되고 융합될 수 있습니다. 융합된 절편은 병변을 만들어 기계적으로 분리되며, 고유 척수 뉴런이 병변 위로 성장하고 절편을 연결하도록 유도합니다. 기능적 연결의 재생을 식별하기 위해 슬라이스의 전기적 활성을 평가합니다.

다중 전극 어레이를 사용한 척수 절편 사이의 기능적 연결 재생 연구

다른 전극 코팅은 전기 화학적, 화학적, 기계적 특성 변화를 신경 기록 성능에 영향을 미친다. 체외에서 전극의 비교 그러나 생체 반응의 비교는 일반적으로 전극 / 신경 세포의 거리에서 동물 사이의 변화에 의해 복잡하고, 비교적 간단하다. 이 문서에서는 신경 기록 전극을 비교하는 강력한 방법을 제공한다.

신경 기록 전극의 체계적인 전기 및 전기 생리 평가를위한 방법

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 연구에서는, 우리는 신경 전달 물질 검출의 감도를 향상시키기 위하여 금 나노 입자를 가진 탄소 섬유 마이크로 전극을 수정합니다.

향상된 신경 화학적 검출을 위한 금 나노입자 수정 탄소 섬유 마이크로 전극

아래에 기재된 것은 자유롭게 움직이는 쥐에서 만성 전기생리학적 기록을 위해 해부학적으로 먼 뇌 영역에 걸쳐 다중 폴리머 전극 어레이를 이식하는 방법이다. 준비 및 외과 이식은 다른 종에서 사용하기 위해 이러한 방법의 적응을 안내하는 디자인 원칙에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

다중 유연한 폴리머 전극 어레이의 만성 이식

이 프로토콜은 여러 뇌 영역에서마우스(Mus musculus)및 페렛(무스텔라퍼토리우스 후로)의 만성 및 급성 생체 내 전기 생리학적 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전기 전극 어레이를 구성하는 절차를 설명합니다. 미전지어 어레이 이식에 대한 원시 탄소 섬유를 구입한 후 각 단계는 미세 전기 전하 배열 구조에 중점을 두고 자세히 설명됩니다.

만성 및 급성 생체 내 기록을 위한 탄소 섬유 미세 전하 배열의 구성 및 구현

여기서는 신경과 뇌 에서 생체 내에서 기록하기 위한 맞춤형 탄소 섬유 전극 어레이를 위한 제조 방법론을 설명합니다.

오픈 소스 툴킷: 신경 기록을 위한 벤치탑 탄소 섬유 마이크로전디 어레이

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.

Mechano-Node-Pore 감지: 다중 파라미터 단일 셀 점탄성 측정을 위한 신속한 무표지 플랫폼

학습하세요 실시간 세포 분석기용 금 마이크로전극 재생 방법을 A549 세포를 이용하여. 저독성 시약으로 비용을 절감하고 지속 가능한 실험 환경을 구축할 수 있습니다.

실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

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