RGB 및 식물 형질 및 생리 적 연구에 대 한 스펙트럼 루트 이미징: 실험적인 체제 및 프로토콜을 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 이미징 방법을 결합하여 토양으로 채워진 뿌리 줄기 상자에서 자라는 식물 뿌리에 대한 포괄적인 정보를 얻는 것입니다. 이 방법은 더 나은 비생물적 스트레스 저항에 대한 다양한 뿌리 구조의 기여와 같은 식물 표현 및 육종 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 루트 아키텍처를 위한 RGB 이미징과 루트 기능을 위한 초분광 이미징을 결합한다는 것입니다.

뿌리에 대한 초분광 이미징을 사용할 수 있는 잠재력은 스펙트럼 정보가 식물 뿌리에 의해 도입된 소규모 물리화학적 변화를 드러낼 수 있기 때문에 광범위한 근권 매개변수로 확장됩니다. 리조박스 채우기 단계를 신중하게 수행해야 하므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 루트 성장과 루트 가시성에 부정적인 영향을 미칩니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 기질 충전을 위한 rhizobox를 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 3, 705g의 건조한 토양에 400g의 물을 추가하여 건조한 토양을 그램당 0.108g의 중량 측정 수분 함량으로 미리 적십니다. 균일한 물 분포를 얻기 위해 토양과 물을 부드럽게 혼합하십시오.

입자 크기를 2mm 이하로 유지하기 위해 더 큰 응집체를 수동으로 파괴합니다. 가스 관측 창 옆에 균질한 토양 층을 확보하여 에어 갭을 피하는 것이 중요합니다. 식물의 뿌리 끝은 빠르게 탈수되어 에어 갭으로 자랍니다.

또한 물 매핑을 위한 스펙트럼 이미지 품질도 부정적인 영향을 받습니다. 미리 적신 토양을 열린 뿌리 줄기 상자에 채우고 폴리스티렌 시트를 사용하여 부드럽게 압축하여 상자의 내부 부피를 덮음으로써 입방 센티미터당 1.3g의 균일한 부피 밀도를 얻습니다. 스프레이 병으로 표면에 스프레이하여 입방 센티미터당 0.31입방센티미터의 목표 수분 함량을 달성하려면 남은 양의 물을 추가합니다.

표면 구조 저하와 균일한 습윤을 방지하기 위해 작은 입자 크기를 확인하십시오. 분무하는 동안 상자의 균형을 유지하여 실제로 기판에 추가된 물의 양을 모니터링하십시오. 물을 10분 동안 재분배한 다음 유리를 표면에 누르고 측면 금속 레일로 고정합니다.

습식 기질이 있는 뿌리 줄기 상자의 평균 최종 중량은 17, 818 플러스 또는 마이너스 68g이었습니다. 최적의 식물 성장을 위해 440 및 660 나노미터의 스펙트럼 피크와 함께 초당 450마이크로몰의 균일한 조명을 제공하는 8개의 LED 램프를 기후 실내에 설치하십시오. 식물 및 실험 요구 사항에 따라 주변 매개 변수를 설정 한 후 유리창을 나무판으로 덮어 뿌리 영역을 어둡게 유지하고 유리 표면을 통해 투과하는 빛으로 인한 조류 성장을 방지합니다.

그런 다음 적절한 금속 프레임워크를 사용하여 뿌리 줄기를 45도 경사로 놓습니다. 이것은 중력작용으로 인해 유리 표면을 향한 뿌리 성장을 최대화합니다. RGB 루트 이미징의 경우 리조박스에서 80cm 거리에 부착된 4개의 24와트 형광등 튜브를 사용하여 리조박스를 비춥니다.

또한 rhizobox의 대체 조명에서 20cm 떨어진 곳에 4개의 15와트 UV 튜브를 장착하여 뿌리와 밝은 색상의 기판 배경 사이의 대비가 낮은 경우 뿌리 자가형광을 사용합니다. UV 램프를 켠 다음 이미징 상자의 홀더에 이미지화할 리조박스를 장착합니다. 다음으로, 약 3cm의 겹침으로 뿌리 줄기의 위쪽 절반과 아래쪽 절반을 덮는 두 개의 이미지를 촬영합니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 RBG 이미지를 획득하고 처리합니다. 마지막으로, 획득한 RBG 루트 이미지의 분석을 실행하고 이후에 일치하지 않는 영역이 있는지 여부를 제어합니다. 이 경우 제외 영역을 정의하고 해석을 다시 시작합니다.

분류되지 않은 루트의 경우 색상 클래스를 더 추가하고 분석을 다시 시작합니다. 루트로 잘못 분류된 요소의 경우 파편 및 거친 가장자리 필터링 옵션을 활성화하거나 늘립니다. 먼저 카메라 소프트웨어에서 rhizobox 스캔과 백색 표준에 대한 카메라 통합 시간을 결정하여 이미지 획득을 수행합니다.

이렇게 하려면 이미징 GUI를 열고 뿌리가 있는 rhizobox의 위치로 카메라를 이동합니다. 소프트웨어에 의해 표시되는 히스토그램에서 카메라의 전체 다이나믹 레인지 중 약 85%가 사용되는 방식으로 가벼운 물체를 대상으로 하는 카메라의 통합 시간을 조정합니다. 서로 다른 기질과 뿌리 조직에 대해 통합 시간을 올바르게 설정하는 것은 범위를 초과하여 정보 손실을 방지하여 적외선 카메라의 동적 범위를 최대한 활용하는 데 중요합니다.

카메라 소프트웨어를 닫기 전에 카메라 포지셔닝 시스템을 흰색 표준을 대상으로 이동하여 흰색 표준에 대한 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 Matlab 이미징 GUI를 열고 현재 rhizobox 스캔의 모든 설정을 입력합니다. 각 이미징이 하루에 한 번 실행되기 전에 어두운 표준과 흰색 표준을 획득합니다.

어두운 표준은 카메라 노이즈를 나타내고 흰색 표준은 최대 반사율을 나타냅니다. 이러한 데이터는 전처리 중 이미지 정규화에 필요합니다. 리조박스(rhizobox) 전체를 스캔할지 아니면 일부만 스캔할지 정의합니다.

본 사례의 경우, 전체 리조박스가 이미지화됩니다. 그런 다음 스캔을 시작합니다. 수분 함량의 스펙트럼 기반 측정을 위해서는 교정 rhizobox가 필요합니다.

뿌리 줄기 상자를 폴리스티렌 시트를 사용하여 5cm 구획으로 세분화하여 물 함량이 다른 흙으로 채웁니다. 심어진 rhizobox에 사용된 것과 동일한 설정으로 보정 rhizobox를 스캔합니다. 예를 들어, 뿌리 형질과 지상 형질을 결합하려면 기공 전도도를 측정하기 위한 잎 포로미터를 구하십시오.

기후 챔버에서 최소 1시간 동안 장치를 주변 조건과 평형을 이룹니다. 식물당 최소 3개의 잎에서 치수를 측정합니다. RGB 이미징을 기반으로 한 사탕무 품종 Ferrara의 대표적인 뿌리 성장 이미지가 여기에 나와 있습니다.

파종 후 35일이 지나면 식물 뿌리가 늘어나 뿌리 상자의 바닥에 도달합니다. 리조박스의 맨 위에 있는 일부 루트 축은 RGB 이미지에서 분할할 수 없습니다. 오래된 기저근의 노화는 색을 갈색으로 바꿉니다.

따라서 색상 임계값을 기반으로 이러한 뿌리와 토양 배경 사이의 분리는 실패합니다. 초분광 이미징을 사용하여 분할은 뿌리 전경과 토양 배경의 다양한 스펙트럼 특징을 기반으로 합니다. 이렇게 하면 세분화 결과가 향상됩니다.

측정된 뿌리 길이와 수동으로 추적된 참조 이미지의 차이는 1.5%에 불과합니다.또한 스펙트럼 이미징을 통해 뿌리 주변의 수분 함량을 미세하게 매핑하여 수분 흡수를 추론할 수 있습니다. 다음은 루트 스켈레톤이 검은색으로 표시된 것입니다. 밝은 영역은 근 축 근처에서 더 높은 수분 고갈 영역을 보여줍니다.

짙은 파란색 영역은 뿌리의 손이 닿지 않는 토양 수분 함량이 높은 지역을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 만족스러운 뿌리 성장과 가시성을 보장하기 위해 뿌리 상자를 적절하게 채우는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이것은 나중에 이미징 및 대표적인 뿌리 표현형 분석 결과의 기초가 됩니다.

이 절차에 따라 K-means 클러스터링 또는 서포트 벡터 머신과 같은 다른 스펙트럼 분류 방법을 수행하여 루트 노화 및 분해와 같은 루트 및 리조스피어 속성에 대한 심층 정보를 얻을 수 있습니다. 일단 확립되면 이 기술을 통해 뿌리 시스템과 비생물적 스트레스 반응을 포괄적으로 표현형화할 수 있습니다. 10가지 품종 세트를 특성화할 수 있으며 총 실험 기간은 3개월 미만입니다.