RGB 및 식물 형질 및 생리 적 연구에 대 한 스펙트럼 루트 이미징: 실험적인 체제 및 프로토콜을 이미징

본 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 이미징 방법을 결합하여 토양이 채워진 라이조박스(rhizobox)에서 자라는 식물 뿌리에 대한 종합적인 정보를 얻는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 뿌리 구조가 비생물적 스트레스 저항성 향상에 어떻게 기여하는지와 같은 식물 표현형 분석 및 육종 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 뿌리 구조 분석을 위한 RGB 이미징과 뿌리 기능 분석을 위한 하이퍼스펙트럴 이미징을 결합했다는 점입니다.

식물 뿌리에 하이퍼스펙트럴 이미징을 활용하는 잠재력은 광범위한 근권 파라미터로 확장되는데, 이는 스펙트럼 정보가 식물 뿌리에 의해 유도된 소규모의 물리화학적 변화를 드러낼 수 있기 때문입니다. 리조박스(rhizobox) 충전 단계가 매우 신중하게 이루어져야 하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 그렇지 않으면 뿌리의 성장과 가시성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 기질 충진을 위한 리조박스(rhizoboxes) 준비 과정부터 이 절차를 시작하십시오. 건조 토양 3,705 g당 물 400 g을 추가하여 중량 수분 함량이 0.108 g/g이 되도록 토양을 미리 적셔 줍니다. 토양과 물을 부드럽게 섞어 수분이 균일하게 분포되도록 합니다.

입자 크기가 2 mm 이하가 되도록 큰 응집체를 수동으로 분쇄합니다. 공기 틈새가 생기지 않도록 가스 관찰창 옆에 토양 층을 균일하게 형성하는 것이 매우 중요합니다. 식물의 뿌리 끝은 빠르게 탈수되며, 공기 틈새 쪽으로 자라나기 때문입니다.

또한 수분 매핑을 위한 분광 이미지 품질에 부정적인 영향을 미칩니다. 미리 적신 토양을 개방형 라이조박스에 채우고 폴리스티렌 시트를 사용하여 박스의 내부 부피를 덮어 부드럽게 다짐으로써 1.3 grams per cubic centimeter의 균질한 용적밀도를 구현합니다. 분무기로 표면에 살포하여 목표 수분 함량인 0.31 cubic centimeters per cubic centimeter가 되도록 남은 양의 물을 추가합니다.

표면 구조의 손상을 방지하고 균일한 습윤 상태를 유지하기 위해 물방울의 크기를 작게 조절하십시오. 분무하는 동안 기질에 실제로 추가되는 물의 양을 모니터링하기 위해 상자를 저울 위에 두십시오. 10분 동안 물이 재분배되도록 둔 다음, 유리를 표면에 누르고 측면 금속 레일로 고정하십시오.

습윤한 기질이 포함된 rhizobox의 평균 최종 무게는 17,818 ± 68 g이었습니다. 식물의 최적 성장을 위해 440 및 660 nm에서 스펙트럼 피크를 가지며 450 µmol/m²/s의 균일한 조도를 제공하는 LED 램프 8개를 생육실에 설치하십시오. 식물 및 실험 요구 사항에 따라 주변 환경 매개변수를 설정한 후, 뿌리 영역을 어둡게 유지하고 유리 표면을 통해 투과되는 빛으로 인한 조류 성장을 방지하기 위해 유리창을 나무판으로 덮으십시오.

그 다음, 적절한 금속 프레임을 사용하여 라이조박스를 45도 경사로 배치합니다. 이는 굴지성으로 인해 뿌리가 유리 표면 방향으로 최대한 성장하도록 하기 위함입니다. RGB 뿌리 이미징을 위해, 라이조박스로부터 80 centimeter 거리에 설치된 4개의 24-watt 형광등 튜브로 라이조박스를 조명합니다.

뿌리와 밝은 색상의 배지 배경 사이의 대비가 낮은 경우, 뿌리 자가형광을 이용하기 위해 라이조박스의 대체 조명으로부터 20 centimeters 거리에 15-watt UV 튜브 4개를 설치하십시오. UV 램프를 켠 다음, 촬영할 라이조박스를 이미징 박스의 홀더에 장착하십시오. 이어서, 약 3 centimeters 정도 겹치게 하여 라이조박스의 상단과 하단 절반을 덮는 두 장의 이미지를 촬영하십시오.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 RBG 이미지를 획득하고 처리하십시오. 마지막으로 획득한 RBG 뿌리 이미지의 분석을 실행하고, 이후 일치하지 않는 영역이 있는지 확인하십시오. 이러한 경우 제외 영역을 정의하고 분석을 다시 시작하십시오.

분류되지 않은 뿌리의 경우, 색상 클래스를 추가하고 분석을 다시 시작하십시오. 뿌리로 잘못 분류된 요소가 있다면, 잔해 및 거친 가장자리 필터링 옵션을 활성화하거나 강도를 높이십시오. 카메라 소프트웨어에서 라이조박스 스캔과 화이트 스탠다드에 대한 카메라 적분 시간을 먼저 결정하여 이미지 획득을 수행하십시오.

이를 위해 이미징 GUI를 열고 카메라를 뿌리가 있는 라이조박스(rhizobox) 위치로 이동시키십시오. 소프트웨어에 표시되는 히스토그램에서 카메라 전체 동적 범위의 약 85%가 사용되도록 밝은 대상물을 겨냥하여 카메라의 적분 시간을 조정하십시오. 다양한 배지와 뿌리 조직에 대해 적분 시간을 정확하게 설정하는 것은 적외선 카메라의 범위를 초과하여 정보가 손실되는 것을 방지함으로써 카메라의 동적 범위를 최대한 활용하는 데 매우 중요합니다.

카메라 소프트웨어를 닫기 전에 카메라 포지셔닝 시스템을 화이트 표준물질 쪽으로 이동시켜 화이트 표준물질에 대한 프로세스를 반복합니다. 다음으로 Matlab 이미징 GUI를 열고 현재 라이조박스(rhizobox) 스캔의 모든 설정을 입력합니다. 하루에 한 번, 매 이미징 실행 전에 다크 및 화이트 표준물질을 획득하십시오.

다크 표준(dark standard)은 카메라 노이즈를 나타내며, 화이트 표준(white standard)은 최대 반사율을 제공합니다. 이러한 데이터는 전처리 과정 중 이미지 정규화를 위해 필요합니다. 라이조박스(rhizobox) 전체를 스캔할지 아니면 일부만 스캔할지를 정의하십시오.

본 사례에서는 라이조박스 전체를 촬영합니다. 그런 다음 스캔을 시작하십시오. 수분 함량의 분광 기반 측정을 위해서는 캘리브레이션 라이조박스가 필요합니다.

폴리스티렌 시트를 사용하여 라이조박스를 5cm 간격의 구획으로 나누고, 각 구획에 서로 다른 함수율의 토양을 채웁니다. 식물이 심어진 라이조박스에 사용한 것과 동일한 설정으로 보정용 라이조박스를 스캔합니다. 예를 들어, 뿌리와 지상부 특성을 결합하여 분석하려면 기공 전도도 측정을 위한 잎 포로미터를 준비합니다.

장치를 기후 챔버 내에서 최소 한 시간 동안 주변 조건에 맞춰 평형화하십시오. 식물당 최소 세 장의 잎에서 측정값을 얻으십시오. RGB 이미징을 기반으로 한 사탕무 품종 Ferrara의 대표적인 뿌리 성장 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.

파종 후 35일이 되면 식물 뿌리가 신장하여 라이조박스(rhizobox) 바닥에 도달합니다. 라이조박스 상단의 일부 뿌리 축은 RGB 이미지에서 분할(segmentation)이 불가능할 수 있습니다. 오래된 기저 뿌리의 노화로 인해 색상이 갈색으로 변합니다.

따라서 색상 임계값을 기반으로 이러한 뿌리와 토양 배경을 분리하는 방법은 실패합니다. 하이퍼스펙트럴 이미징을 사용하면 뿌리 전경과 토양 배경의 서로 다른 분광 특성을 기반으로 세그멘테이션을 수행할 수 있습니다. 이는 세그멘테이션 결과의 정확도를 향상시킵니다.

수동으로 추적한 참조 이미지와 비교했을 때 측정된 뿌리 길이의 차이는 단 1.5%에 불과합니다. 또한, 분광 이미징을 통해 뿌리 주변의 수분 함량을 정밀하게 매핑함으로써 수분 흡수량을 추론할 수 있습니다. 여기에서 뿌리 골격은 검은색으로 표시됩니다. 더 밝은 영역은 뿌리 축 근처에서 수분 고갈이 더 심하게 일어난 영역을 나타냅니다.

진한 파란색 영역은 뿌리가 닿지 않는 곳의 토양 수분 함량이 더 높은 지역을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면, 만족스러운 뿌리 성장과 가시성을 확보하기 위해 라이조박스(rhizobox)를 적절하게 채우는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 추후 이미징 및 대표성 있는 뿌리 표현형 분석 결과를 얻기 위한 기초가 됩니다.

이 절차 이후, K-평균 군집화(K-means clustering) 또는 서포트 벡터 머신(support vector machines)과 같은 다른 분광 분류 방법을 수행하여 뿌리의 노화 및 분해와 같은 뿌리와 근권 특성에 대한 심층적인 정보를 얻을 수 있습니다. 이 기술이 확립되면 뿌리 체계와 비생물적 스트레스 반응을 종합적으로 표현형 분석할 수 있습니다. 총 실험 기간 3개월 미만으로 10종의 품종 세트를 특성화할 수 있습니다.