효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 피더가 없는 조건에서 인간 췌장 세포로부터 발자국이 없는 유도 만능 줄기세포 또는 IPSC를 생성한 다음, CRISPR-Cas9 리보핵단백질을 사용하여 세포를 편집하고, 마지막으로 변형된 단일 세포 클론을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 발자국이 없는 IPSC의 생성 및 CRISPR-Cas9 리보핵단백질을 사용한 편집과 같은 인간 줄기 세포 게놈 편집 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편집된 IPSC의 클론 라인이 높은 신뢰성으로 생성될 수 있고 모자이크의 증거가 없다는 것입니다.

6웰 플레이트에 차가운 콜라겐을 코팅한 후, 2일차에 Prigrow III 배지에 있는 인간 1차 췌장 세포를 조기 통과시켜 5개 세포에 대해 약 2.5 x 10 또는 형질전환 당일 또는 0일차에 웰당 최소 60%농도를 달성합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 수확하고 계수한 후 형질도입 당일, Sendai vector tube 한 세트를 얼음에서 해동하고 각 튜브의 계산된 부피를 예열된 Prigrow III 배지 1mL에 조심스럽게 추가합니다. 용액을 혼합하기 위해 부드럽게 피펫팅합니다.

세포에서 Prigrow III를 흡인하고 재프로그래밍 바이러스 혼합물을 웰에 천천히 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 형질도입 24시간 후, 세포의 바이러스 혼합물을 조심스럽게 버리고 새로운 Prigrow III 배지로 교체하십시오.

6일째에 세포 분리 용액 1mL를 세포에 추가하고 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 암석 억제제와 함께 Prigrow III를 사용하여 전날 준비한 MEF의 접시에 모든 세포를 플레이트합니다. 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

조약돌 형태와 큰 핵 및 핵을 가진 클론 응집체를 형성할 재프로그래밍된 세포를 나타내는 세포 덩어리 또는 군집의 출현을 위해 플레이트를 정기적으로 관찰합니다. 가능한 IPSC 군체를 표시하고 정기적으로 성장 여부를 확인하십시오. 24웰 MEF 플레이트를 준비한 후 형질도입 후 거의 4주가 지나면 분석 인증서의 희석 계수를 기준으로 분주하여 매트릭스 멤브레인을 준비합니다.

24-48개의 콜로니를 선택하여 mTeSR1로 코팅된 24웰 플레이트의 매트릭스 멤브레인으로 옮깁니다. 플레이트를 24시간 동안 배양하고 매일 배지를 교체하십시오. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

500mcL의 dispase를 추가하여 매트릭스 멤브레인에 도금된 견고한 콜로니를 분리합니다. 세포를 20분 동안 배양한 후 매트릭스 멤브레인으로 코팅된 12웰 플레이트에 다시 플레이트합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 알칼리성 인산가수분해효소 염색, 면역 염색 및 FACS 분석을 사용하여 클론을 확장하고 특성화합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 SGRNA를 합성한 후 HIPSC를 transfection하려면 22mcL 반응 부피에서 0.5mcg의 Cas9 단백질과 0.5mcg의 각 SGRNA를 결합하여 각 샘플에 대한 nucleofaction 마스터 믹스를 준비합니다. 암석 억제제가 포함된 배지를 흡입한 후 2mL의 RTPBS를 사용하여 ISPC의 각 웰을 세척합니다. 그런 다음 PBS를 흡인하고 1mL의 세포 박리 용액을 추가합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 3mL의 mTeSR1 배지에 세포를 재현탁하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 해리된 세포를 5mL의 mTeSR1 배지가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

뉴클레오펙션 마스터 믹스에 P3 일차 세포 보충제 16.4mcL와 Nucleofector 키트의 보충제 1 3.6mcL를 추가합니다. 세포를 계수하고 회전시킨 후, 0.5 x 10의 각 단위를 이전에 준비된 형질주입 마스터 믹스의 22mcL에 있는 6번째 세포에 재현탁합니다. 세포를 Nucleocuvette 스트립의 한 웰의 중앙 챔버로 빠르게 이동합니다.

그런 다음 스트립을 Nucleofector 장치에 넣고 프로그램 CB150을 사용하여 세포를 핵 펙션합니다. 핵 절제 후 10 마이크로몰 암석 억제제를 함유한 80mcL의 예열된 mTeSR1 배지를 핵 절제된 세포의 각 웰에 빠르게 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.

스트립의 세포를 암석 억제제가 있는 mTeSR1 배지가 포함된 매트릭스 멤브레인이 사전 코팅된 12웰 플레이트의 웰로 부드럽게 옮깁니다. MEF 플레이트를 준비한 후 배양 2일차에 단일 세포 분류 전 최소 2시간 동안 HIPSC의 배지를 mTeSR1에서 mTeSR1로 교체하고 1XSMC4를 보충합니다. HIPSC에서 배지를 흡인하고 PBS를 사용하여 세포를 부드럽게 세척합니다.

그런 다음 각 웰에 500mcL의 세포 분리 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에 1mL의 mTeSR1을 첨가하여 단일 세포 현탁액을 생성하고 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 단일 세포를 이전에 준비된 96웰 플레이트의 개별 웰로 분류합니다.

분류 후 4일이 지나면 군체 형성이 뚜렷해야 합니다. 이 시점에서 배양 배지를 1X SMC4가 보충된 HESC 배지로 교체합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 타겟 DNA를 추출 및 확장한 후 단편 분석기 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 겔 염료 혼합물을 통해 모든 클론의 PCR 증폭 타겟 게놈 영역을 실행합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 만능 IPSC 클론을 확인합니다. 센다이 바이러스 형질도입 전, 췌장 세포는 전형적인 방추체와 같은 형태를 보입니다. 12일째까지 MEF에 작고 단단한 군체가 나타나며, 이는 인간 만능 세포 군집과 유사합니다.

일반적으로 완전히 재프로그래밍된 인간 IPSC 군집은 경계가 매우 명확하며 23일에서 30일까지 선택할 수 있습니다. 23일째에 해리된 군체가 여기에 나와 있습니다. 여기에 제시된 것은 췌장 세포의 센다이 바이러스 재프로그래밍 후 피더가 없는 조건에서 채취 및 배양 후 IPSC 콜로니의 일반적인 위상차 이미지입니다.

알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase)로 염색된 붉은색 IPSC 콜로니는 오른쪽에 있습니다. IPSC는 이들 패널에서 볼 수 있는 바와 같이 다능성 마커 OCT4 및 NANOG에 대한 면역 염색에 의해 확인되었습니다. 이 실험에서는 IPSC를 세포 표면 마커로 염색하고 단일 세포 현탁액에서 FACS 분석을 수행했습니다.

녹색 피크는 췌장 IPSC를 나타내고 보라색 피크는 IPSC 음성 세포를 포함합니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포 분류 및 세포 배양을 위해 무균 또는 멸균 상태를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 IPSC 및 ESC의 유전자 표적화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있으며 정확한 유전자 변형을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 발자국과 피더가 없는 IPSC를 안정적으로 생성하고 이중 대립형질로 게놈 편집을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.