Name: 효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 인간 췌장 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로틴을 이용한 발자국 없는 iPSC 생성 및 유전자 편집 방법을. 이 기술은 높은 신뢰성으로 편집된 클론 계통을 생성하고 모자이크 현상이 없어 정밀한 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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실험실에서 박사 Anjali Nandal에 박사 후 펠로 십 그랜트와 탐험 그랜트에 의해 지원 되었다 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 BT (TEDCO)에서.

1. 프로그래밍 프로토콜 <ol><li>기본 인간의 췌 장 세포에서 인간 iPSC의 세대 <ol><li>6-잘 1.5 mg/mL 차가운 콜라겐 접시 하 고 1 h. 위해 37 ° C에서 젤 코트</li>
		<li>접시 인간의 기본 췌 장 세포는 콜라겐에 Prigrow III 매체 (~ 1-1.5 × 10 5 셀)에 코팅 6 잘 플레이트에 하루 약 2.5 × 10 5 셀 또는 적어도 60%를 달성 하기 위해-2 초기 통로의 날에 잘 당 confluency 변환 (0 일)입니다. 첫 번째 연구를 위해 0에 원하는 confluency 하나 잘 얻을 적어도 2-3 웰 스 접시. 셀 하나 이상 잘 컨트롤 사용.</li>
		<li>변환 (0 일)의 날, 따뜻한 불리고 수를 각 잘 물 욕조에 Prigrow III 매체의 1 mL. 수확 10 %FBS 매체 1 mL의 트립 신/EDTA를 사용 하 여 5 분의 1 mL에 한 컨트롤에서 셀 또는 셀 셀 수 수행을 분리 하는. 10 %FBS 매체, 추가 DMEM, 10 %FBS, 1 %L-글루타민, 1% 나트륨 Pyruvate와 1% 비 본질적인 아미노산.</li>
		<li>수 셀 카운터를 사용 하 여 세포의 생존 능력을 확인 하 고 계산 셀 번호 및 바이러스 titer에 따라 목표에 도달 하는 데 필요한 각 바이러스의 볼륨. KOS의 감염 (MOI)의 다양성을 사용 하 여 = 5, hc-Myc = 5, hKlf4 = 췌 장 세포에 대 한 3.</li>
		<li>센다이의 해 동 한 세트 얼음-80 ° C 저장에서 튜브를 벡터와 신중 하 게 Prigrow III 매체의 1 mL를 각각 3 센다이 벡터 튜브의 계산 된 볼륨을 추가 37 미리 예 열 ° C. 피 펫 혼합 솔루션을 부드럽게. 6 잘 플레이트 한 잘 재설정된 세포 생성에 센다이 바이러스 성 벡터와 시험에 대 한 충분 하다.</li>
		<li>셀에서 Prigrow III 중간 발음 하 고 천천히 셀을 포함 하는 우물을 재활 바이러스 혼합물을 추가 합니다. 5% CO 2의 습도 분위기 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 세포에 바이러스 혼합물을 삭제 하 고 날, 변환 후 24 시간 신선한 Prigrow III 매체를 바꿉니다. 셀 d 5에 대 한 문화와 매체 대체 매일 변경.</li>
		<li>5 일에 0.1% 젤라틴 미리 코팅 10 cm 문화 요리 (1.3 x 10 6 셀/접시)에 MEFs을 준비. 하루 4까지 플라스 크 T175에서에서 MEFs를 성장 하 고 다음 날 5, 셀 13 또는 사용 상업 MEF 소스 뿌리기 전에 γ 방사선 소스에서 6000 래 드 셀 노출.</li>
		<li>6 일에를 사용 하 여 세포 분리 솔루션의 1 mL 10 분 transduced 세포를 분리, Prigrow III 매체에서 MEF 요리에 그들의 모든 바위 억제제 (5 m m 재고, 최종 10 µ M) 접시 습도 atmosphe와 37 ° C 배양 기에서 밤새 품 어 다시 5% CO 2.</li>
		<li>는 HESC 매체 다음날 Prigrow III 매체를 변경합니다. HESC 매체의 500 mL를 만들기 위한 추가 DMEM/F-12, 20% (v/v) 녹아웃 혈 청 교체 (KOSR), 5 ng/mL bFGF; 1 m m l-글루타민; 100 µ M 불필요 한 아미노산 그리고 100 µ M 2-mercaptoethanol. 지금 매일 부드럽게 매체 변경.</li>
		<li>재설정된 셀을 나타내는 세포 덩어리 또는 식민지의 출현에 대 한 정기적으로 번호판을 관찰합니다. 변환 된 셀 조약돌 형태학 및 큰 핵 nucleoli 클론 집계를 형성합니다. 표시는 가능한 &#39; iPSC &#39; 식민지 성장을 위해 그들을 정기적으로 확인 하 고.</li>
		<li>변환 후에 거의 4 주 식민지 따기 또는 전송에 대 한 준비가 단일 식민지의 전송에 대 한 이전과 1.3 x 10 6 셀/젤라틴 미리 코팅된 접시를 도금 하 여 24-잘 MEF 접시 준비.
		<li>분석 증명서에 희석 비율에 따라 aliquoting에 의해 (예를 들어, Matrigel) 준비 매트릭스 막 <ol>. 4 6 잘 플레이트 (1 mL/음) 하 고 사용 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온 (RT)에서 품 어 코트 DMEM/F-12의 25 mL에 한 약 수를 추가 합니다. 수동으로 그들을 발음 하는 hESC 매체의 500 µ L에서 MEF 접시에 전송 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 12-24 식민지를 선택 하십시오.</li>
			<li>발음에 부드럽게 방해 또는 식민지를 분리 잘 미디어. 또한 매트릭스 코팅 막 24-잘 접시에 24-48 식민지를 선택 하십시오. 막 코팅 판에 대 한 24 시간에 대 한 mTeSR1 (10 µ M 바위 억제제 보충)를 사용 하 고 매일 변경. 식민지를 따기의 6-10 d, 내 클론 확장에 대 한 새로운 24-잘 / 12 잘 막 격판덮개 전송 준비가 되.</li>
		</ol></li> <li>필요한 경우, MEFs 1mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분 동안에 식민지를 분리, 세척 두 번 hESC/mTeSR1와 막에 코팅 12 또는 24 잘 접시. 성장 단계의 1.1.12 매트릭스 막에 충분 한 강력한 식민지 경우 동결 iPSC 냉동 제조 업체에 따라 미디어를 사용 하 여 MEFs에 식민지 &#39; s 지침.</li>
		<li>단계 1.1.12 20 분에 대 한 dispase의 500 µ L를 사용 하 여에서 막에 도금 강력한 식민지를 분리 하 고 접시 다시 매트릭스 막에 코팅 된 12-잘 접시. 수동으로 어떤 차별화 된 셀 이나 만능 클론 멤브레인에 대 한 풍부 하 게 오염 MEF 급지대 셀 다쳤어요.</li>
		<li>는 멤브레인에 성장 하 여 6-8 d dispase 솔루션으로 앞으로 해리 하 여 플레이트를 코팅 하 고 6 또는 12 잘 플레이트 코팅 도금 신선한 막에서 작은 셀 집계 후 클론을 확장 합니다. 변경 mTeSR1 매체 매일입니다. 얼룩, pluripotency 마커 (OCT3/4 및 분석용 NANOG), FACS 만능 표면 마커 및 차별화 분석 실험의 immunostaining 알칼리 성 인산 가수분해 효소에 의해 재설정된 클론을 특징. 성장 하 고 CRISPR 다른 코팅 솔루션은 구체적으로 언급 하지 않는 한 위에서 설명 편집을 비롯 한 모든 분석에 대 한 막 코팅 판에 클론 문화.</li>
	</ol></li> <li>인간의 특성 Ipsc <ol><li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 참고: 상업 키트는 여기에 사용 됩니다. 자료 테이블을 참조 하십시오.
		<ol><li>매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 상 상속 인간의 Ipsc 접시.</li>
			<li>얼룩 프로토콜을 시작, 문화 매체를 발음 0.05 %1 x PBS의 1 mL로 세포 세척을 트윈 20 (PBST).</li>
			<li>키트 셀에 수정 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 2 ~ 5 분 Aspirate 수정 솔루션에 대 한 RT에서 품 어 다음 PBST와 고정된 셀을 씻어. 건조 우물을 허용 하지 않습니다.</li>
			<li>솔루션 A, B 및 C. 품은 어둠 속에서 (호 일 또는 어두운 컨테이너에 포장) 5 ~ 15 분에 대 한 실 온에서 전지를 혼합 하 여 잘 당 갓된 AP 기판 솔루션의 0.5 mL을 추가 
			참고: 밀접 하 게 모니터 색상 변경 하 고 색상 일반적인 얼룩 피하기 위해 밝은 때 반응을 중지.</li>
			<li>AP 기판 솔루션 발음 및 1 x PBS의 2 mL로 두 번 우물을 세척 하 여 반응을 중지.</li>
			<li>현미경 식민지를 관찰 하 고 4 배 또는 10 배 확대 어떤 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 카메라에서 이미지를 캡처.</li>
		</ol></li> <li>Immunostaining <ol><li>매일 미디어 변경 24-잘 접시에 4-5 d 문화 인간의 Ipsc 접시.</li>
			<li>PBS와 PBS에서 4 %paraformaldehyde (PFA)와 20 분에 대 한 수정에 짧게 한 번 셀 세척.</li>
			<li>실시간에 PBS 가진 10 분 (3 x, 10 분)에 대 한 세 번 세척</li>
			<li>Saturate 일반적인 사이트 10% 일반 염소 또는 당나귀 혈 청 (NS, 동물 이차 항 체에 따라 발생에) PBS에서 실시간에서 40 분 세포내 epitopes만 포함 0.3 %PBS (TX/PBS) permeabilize 하에서 TX-100.</li>
			<li>워시 실시간에 PBS 가진 3 x 5 분</li>
			<li>5%의 신선한 솔루션에서 OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5와 SOX17 항 체 희석 PBS에서 NS 및 2 시간 또는 하룻밤 4 RT에서 품 어 ° c.</li>
			<li>실시간에 PBS 가진 5 분 동안 배를 씻어</li>
			<li>적절 한 보조 알 렉 사 Fluor 488 또는 5%에 568 항 체 희석 NS/PBS 및 실시간에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어</li>
			<li>실시간에서 5 분 동안 배를 씻어</li>
			<li>1 PBS에 DAPI 함께 품 어0 분 및 세척 2 x 사진을 찍어 실시간 사용 형광 현미경에서 5 분.</li>
		</ol></li> <li>형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) <ol><li>식민지까지 문화와 6 잘 플레이트에 플레이트 인간의 Ipsc 될 80% 합칠 (적어도 10 5 셀 /sample) 매일 mTeSR1 중간 변화.</li>
			<li>실험 당일, 세포를 분리 하 고 프로토콜에 위에 설명 된 대로 단일 세포 현 탁 액에 해리. 10 %FBS 매체와 세척.</li>
			<li>0.5-1에서 resuspend 표면 표식에 대 한 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL</li>
			<li>세포내 표식에 대 한 4%의 1 mL에 resuspend PFA/PBS 및 실 온에서 10 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 세척. 0.1%에서 resuspend TX/PBS와 얼음에 15 분 동안 품 어. 10 %FBS 매체와 다시 세척. 0.5-1에서 resuspend 10 %FBS 매체 및 계속 얼음의 mL</li>
			<li>10 %FBS 중간 포함의 50 µ L에 세포 현 탁 액의 추가 50 µ L TRA-1-60, TRA-1-81 또는 SSEA-4 항 체의 양을 권장 하 고 30 분 1 헤 알을 품고합니다</li>
			<li>10%로 두 번 씻어 FBS.</li>
			<li>Resuspend 10%의 100 µ L에서 FBS 매체 형광 이차 항 체를 포함 하 고 10 %FBS 적절 한 양의 10%에 resuspend로 두 번 30 분 세척에 대 한 품 어 FBS. 라이브 셀 propidium 요오드 화물 염료에 추가 하 여 죽은 세포에서 분화 될 수 있다 &#60; 세포 apoptosis 과정 추정 1 µ g/mL.</li>
		</ol></li> <li>트라이-혈통 차별화 <ol><li>10 6 Ipsc/10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체에 잘 x 1.5-2 2 6 잘 플레이트 씨앗.</li>
			<li>성장 mTeSR1 중간 변화 매일 2-3 d 우물은 80-90%까지 confluent 세포 허용.</li>
			<li>Ectoderm 유도 신경 유도 매체 (님)는 제조업체에 따라 추가 &#39; 6 잘 플레이트의 2-3 스에서 s 지시.</li>
			<li>RPMI 인슐린 마이너스 2 %B27 보충 및 12 µ M를 포함 하는 매체 변경 접시 14의 2-3 스에서 mesoderm 유도 대 한 CHIR99021. 다음 24 h. 추가 5 µ M에 대 한 인슐린 마이너스 2 %B27 보충을 포함 하는 추가 유일한 RPMI RPMI 보통 2 %B27 IWP4 다음 24 h에 대 한 인슐린을 뺀 보충. 72 h 후 바꿉니다 미디어 2-3 디 cardiomyocytes 박동의 생성으로 이어지는 2 %B27 보충 포함 된 RPMI</li>
			<li>Endoderm 유도 MCDB 131 1.5 g/L 나트륨 중 탄산염, Glutamax, 포도 당 10 m m, 0.5 %BSA, 100 ng/mL GDF8, 및 24 h. CHIR99021 없이 동일한 매체에 문화에 대 한 CHIR99021의 5µM x 1와 보완에 6 잘 플레이트의 우물에서 매체 변경 2-3 d 15.</li>
			<li>모든 3 개의 계보에 대 한 2 단계에서 immunostaining 프로토콜을 수행 하 고 관련 마커의 식 확인.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. 게놈 인간의 편집 iPSC 사용 하 여 CRISPR Cas9 <ol><li>준비의 Cas9 단백질 및 sgRNA <ol><li>메 마른 조건에서 microcentrifuge 튜브 Aliquot Cas9 단백질-80에서 튜브를 고정으로 aliquots를 저장 하 고 ° c.</li>
		<li>는 유전자 당 RNAs MIT (http://www.genome-engineering.org/crispr/)에서 소프트웨어 또는 다른 CRISPR 가이드 디자인 webtool 기반 가이드를 대상으로 두 개의 디자인. 녹아웃을 생성 하는 유전자 (열려있는 독서 프레임 기준)의 첫 번째 또는 두 번째 엑손 대상. 두 그렇게 그들은 가깝게 잘라 가이드 선택 (30 ~ 100 bp 간격) 우리가 쉽게 뇌관을 심사의 동일한 세트를 사용 하 여 삭제를 시각화 수 있습니다. 더 높은 품질 평가 점수 및 오프 대상 사이트의 낮은 수를 기반으로 소프트웨어 출력에서 가이드를 선택 하십시오. 상영 프로그램 뇌관 폭발 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용 하 여 뇌관 디자인. 100 이상 이어야 한다 뇌관 심사는 Cas9에서 bp 사이트 잘라내어 PCR 제품 크기 PCR에 의해 쉽게 확대를 위한 400-700 bp 사이 여야 선호.</li>
		<li>디자인 두 개의 상호 보완적인 sgRNA 올리고 사이트 양쪽 끝을 잘라 Bsa1로 DNAs (19-22 뉴클레오티드 길이에 따라 가이드 시퀀스). 올리고 DNAs 상업적으로 합성 및 이중 가닥 DNA를 단련 될 수 있습니다. 어 닐 링, 추가 1 µ L 각 100 µ M 가이드, 버퍼 (10 mM Tris, pH7.5 ~ 8.0, 50 m m NaCl, 1 mM EDTA) 어 닐 링의 25 µ L 및 물 23 µ L. Thermocycler 2 분 및 그 후에 점차적으로 25 ° C 이상 45 분을 냉각에 대 한 95 ° C에서 시작 하는 프로그램에서 품 어</li>
		<li>클론 Bsa1 제한 효소로 결과 조각의 2 µ L는 T4 DNA 리가 제조자에 의하여를 사용 하 여 Cas9 바인딩 사이트와 사내 T7 발기인 pCR2.1 벡터의 1 µ L를 소화 &#39; s 프로토콜.</li>
		<li>복제 된 DNA 파편을 연속 하 고 생체 외에서 T7 키트를 사용 하 여 단일 가이드 RNAs를 생성 하는 클론을 녹음 충실도 설정. 상업적인 키트 sgRNAs를 정화 하 고 RNase 무료 물에 elute. RNA 농도 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>Transfection hiPSCs의 <ol><li>셀 40-50% 합칠 때까지 위에서 설명한 대로 hiPSCs mTeSR1 매체에 문화.</li>
		<li>2 시간 nucleofection, 전에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTeSR1 매체의 2 mL 매체 바꿉니다.</li>
		<li>1 시간 후, 준비 대상 웰 스 nucleofected 셀 발음 막, 위, 12-잘 접시에서 준비 하 고 10 µ M 바위 억제제와 mTeSR1 매체의 prewarmed 1 mL을 바꿉니다. 부 화에 대 한 37 ° C에서 유지.</li>
		<li>준비 nucleofection 마스터 믹스 (샘플에 따라 적절 하 게 스케일) P3 1 차 셀의 16.4 µ L 추가 하 여 각 샘플에 대 한 보충, 보충 1 nucleofector 키트, Cas9 단백질의 0.5 µ g의 3.6 µ L 및 각 sgRNA의 0.5 µ g 반응 양 당 22 µ L에서. pMAX GFP 벡터는 또한 제조자에 의하여 nucleofected &#39; 대략 iPSC transfection 효율 추정 하 셀에 s 권고.</li>
		<li>씻어 각 iPSC 우물에서 바위 억제제를 포함 하는 매체를 발음 후 RT PBS의 2 mL와 잘. 다음 발음 PBS, 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어</li>
		<li>는 MTeSR1 매체의 3 mL에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 위아래로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 플라스틱. 15 mL 원심 분리기를 전송 해리 셀 튜브 포함 5 mL mTeSR1 매체.</li>
		<li>셀 셀 카운터 하 고 총 볼륨 0.5 x 10 6 셀/transfection에 필요한 계산. 원하는 양의 셀에 15 mL 원심 분리기 튜브, RT에 5 분 동안 200 x g에서 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
		<li>X 10 6 세포 transfection 마스터 믹스 4 단계에서 준비의 22 µ L에서 0.5의 각 단위를 resuspend. 신속 하 게 nucleocuvette 스트립의 한의 중앙 챔버로 셀을 전송. 프로그램 CB150를 사용 하 여 nucleofector 장치 및 nucleofect 세포로 스트립을 놓습니다.</li>
		<li>Nucleofection, 후 신속 하 게 nucleofected 셀의 각 음에 10 µ M 바위 억제제를 포함 하는 prewarmed mTESR1 매체의 80 µ L을 추가. 부드럽게 위아래로 pipetting 혼합.</li>
		<li>부드럽게 웰 스 판의 막 미리 코팅 12-잘 록 제 3 단계에서 준비 된 mTeSR1 매체를 포함 하는 스트립에서 셀 전송.</li>
		<li>후 1 d 록 억제제 없이 신선한 mTeSR1 매체를 변경 합니다. 수확 nucleofection 단일 셀 정렬 후 2-3 d 세포.</li>
	</ol></li> <li>타겟된 hiPSCs의 단일 셀 격리 <ol><li>정렬, 전에 1 일 시드 2 x 10 6 셀/젤라틴 코팅 접시 10 %FBS 매체에 의해 96 잘 MEF 접시를 준비. 클론의 약 70-80 %nucleofection 후 생존과 2-3 MEF 접시 각 편집 실험을 위해 준비 될 수 있다.</li>
		<li>100 보충 hESC 매체 (앞에서 설명한) 매체 변경 다음 하룻밤 인큐베이션 ng /mL bFGF, 1 x SMC4 (억제제 단일 세포 생존 능력을 향상 시키기 위해 미디어에 추가), 그리고 접착 홍보 5 mg/mL fibronectin.</li>
		<li>MTeSR1 매체 1 보충을 mTeSR1에서 12-잘 접시에 hiPSCs에 매체를 대체할 단일 셀 정렬 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 x SMC4.</li>
		<li>는 HiPSCs에서 매체를 발음 하 고 부드럽게 PBS로 세포를 씻어. 각 잘에서 세포 분리 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 PBS 발음 후 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 세포 현 탁 액을 각 영역 (unsupplemented) mTeSR1의 1 mL을 추가 하 고 pipetting 아래로 부드럽게 여러 번 여 생성.</li>
		<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 실시간 Aspirate 상쾌한에 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 고 resuspend mTeSR1의 1 mL에 셀.</li>
		<li>1 단계에서 준비 된 96 잘 접시의 한 셀에 개별 잘 살 균 조건 하에서 100 m m 노즐 셀 정렬을 사용 하 여 단일 셀에 셀 정렬.</li>
		<li>정렬 후 4 일 1 보충 하는 hESC 매체와 문화 매체를 대체이 시점에서 식민지 형성 명백한; 해야 x SMC4.</li>
		<li>정렬 후 8 일 hESC 매체와 2에 대 한 문화 매체를 대체 디</li>
		<li>1 mg/mL 콜라를 사용 하 여 20 분에 대 한 식민지를 분리 하 고 록 억제제와 mTeSR1에서 24-잘 막 코팅 접시에 그들을 전송. 단일 셀 클론 성장 하 고 복제 또는 그들을 확장 후 그들의 게놈 DNA를 추출 하자. 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 대상 DNA PCR에 의해 증폭.</li>
		<li>사용 조각 분석기 키트 젤/염료를 통해 그들을 실행 하 여 모든 클론의 PCR 증폭된 대상 게놈 지역의 초기 심사에 대 한 제조 업체에 따라 믹스 &#39; s 지시. 예제와 함께 실행 되는 적절 한 사다리 그것을 비교 하 여 소프트웨어 PROSize에서에서 결과 조각 크기를 예상 하고있다. 예상 순서 &#39; 편집 &#39; 복제 및 시퀀싱 데이터를 확인 하는 편집 또는 삭제 분석.</li>
		<li>Monoallelic 및 biallelic 클론 차별화에 대 한 증폭 PCR와 pJET1.2 벡터에 복제 편집된 시퀀스. 시퀀싱에 대 한 적어도 8-10 클론 보내고 하나 또는 둘 다 대립 유전자에서 편집 확인 순서를 확인 하십시오.</li>
		<li>성공적으로 타겟된 iPSC 클론 유전형을 통해 확인 되었습니다, 일단 검사는 그들이 하지 pluripotency 손실 또는 염색체 이상이 과정을 통해 얻은 것인지.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
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</ol>

BT는 쳐도 생물 과학 주식 회사의 창립 멤버

Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학16의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ' 무료 '와 효율적인 프로그래밍 리드와 인간의 췌 장 세포에서 생성 하는 효율적인 방법 제시. 결과 인간의 Ipsc는 무료로 바이러스 transgenes, pluripotency를 유지 하 고 알 수 없는 외 인 요인의 사용을 방지. 그래서 우리는 피더 세포에 기본 췌 장 세포를 재설정 다음 식민지 확장, 문화 및 특성에 대 한 막 급지대 무료 이동 Ipsc 공급기 무료 조건에서의 세대 낮은 재활 효율이 있다. 이러한 기술의 융합 신뢰할 수 있는 안정적이 고 보다 효율적인 iPSC 프로그래밍을 제공합니다.
...

요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인1. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자5에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무료 중간 급지대 셀8로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 사용을 피하기 위해 쉽게 전환 수 다음.
프로그래밍, 센다이 바이러스 중재 한 개요 뿐만 아니라이 책에서 우리 또한 원하는 유전자 수정 연구에 대 한 무제한 인간 세포를 공급 하는 Ipsc 편집에 대 한 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 지금 노크 기능 및 녹아웃, 대규모 게놈 삭제, 유전자 검색, 유전자 공학에 대 한 심사는 풀링된 라이브러리를 포함 한 애플 리 케이 션의 광범위 한 사용 되는 Ipsc의 수정에 대 한 CRISPR/Cas9 기술 사용 수많은 모형 유기 체 및 유전자 치료9,,1011 이 기술은 포함 한다 연쇄 상 구 균 pyogenes의 단지의 형성-20-메 르 및 파생 Cas9 nuclease 가이드 RNAs 게놈 대상 시퀀스 3' 뉴클레오티드 protospacer 인접 한에 인접 한 자료 연결을 통해 대상 인식 하기 위해 모티브 (PAM) 시퀀스입니다. Cas9 nuclease 유도 이후에 주로 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 선도 삽입 또는 열려있는 독서 프레임에서 삭제 하 여 복구 하 고 그로 인하여 기능 팸 사이트에서 이중 좌초 휴식 ~ 3 뉴클레오티드 12유전자 녹아웃
인간의 췌 장 세포의 문화에 대 한 세부 정보를 포함 하는 우리의 향상 된 프로토콜, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 프로그래밍, 피더 무료 문화 이후 적응의 높은 효율을 달성 하기 위해 비활성화 mitotically에 그들의 프로그래밍 Matrigel, 설립된 Ipsc의 특성에 CRISPR 가이드 RNA 설계 및 준비, RNP 단지, 단일 셀 정렬 편집된 Ipsc의 클론 라인 생성 하, 쉽게 심사 및 편집, 식별 및 특성으로 Ipsc에 배달 단일 셀 복제합니다. 게놈 삭제 했다 Cas9 단백질 및 두 배 좌초 틈 (DSBs) 유도 하 두 CRISPR sgRNA RNP 복합물의 도입으로 효율적으로이 연구에서 생성 되 고 삭제는 개입의 세그먼트. 이 메서드는 열려있는 독서 프레임에서 삭제를 생성 하기 위한 두 명의 가이드를 사용 하 여에 대문자로 바꿉니다, 그리고 고효율의 낮은 수 선도 NHEJ의 클론 자동된 모 세관에 의해 그 특성화 될 필요가 그리고 클론의 쉬운 예비 심사 전기 이동 법 단위, 조각 분석기입니다. 이러한 효과적인 게놈 인간 줄기 세포 기반 질병 모델을 생성 하는 방법을 편집 곧 모든 줄기 세포 실험실에서 표준 및 일상적인 접근을 될 것입니다. 마지막으로, 정확한 게놈 편집 그것은 줄기 세포 질병 모델링 넘어가 수 만들고 잠재적으로 촉매 세포 기반 치료를 도울 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>센다이 바이러스 벡터 - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>얼음 위에서 해동; S 번호 : 1</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0.05 %, 100 ml; S 아니오: 2</td></tr><tr><td>바위 억제물 (Y-27632)</td> <td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>사용 10 &mu; M; S 번호: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 매체</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S 번호: 4</td></tr><tr><td>혈청 대체(KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S 번호: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S No: 6</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>부분 표본; S 아니오: 7</td></tr><tr><td>L-글루타민 (Glutamax, 100X), 액체</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S 아니오: 8</td></tr>개의 <tr><td>비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S No: 9</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴 용액</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>37&ordm에서 배양; C 1 시간; S 번호 : 12</td></tr><tr><td>SSEA-4 항체</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S 번호: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81 항체</td><td>세포 신호</td><td>4745S</td><td>1/200; S No: 14</td></tr><tr><td>OCT4 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1,000; S 번호 : 15</td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>생명 기술</td><td>A10483-01</td><td>차갑게 유지하십시오. S No: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 형광 488/568 (2차 항체)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202/A10042</td><td>1/2,000; S 번호: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>하이클론</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S No: 18</td></tr><tr><td>100-mm 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S No: 20</td></tr><tr><td>96-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S No: 21</td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S No: 22</td></tr><tr><td>해부 범위&nbsp;</td><td>니콘</td><td>SMZ745</td><td>S No: 23</td></tr><tr><td>피킹 후드</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No: 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; ml 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S No: 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; ml 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S No: 26</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S No: 28</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No: 31</td></tr><tr><td>Countess&trade; Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S No: 32</td></tr><tr><td>Faxitron X-ray system</td><td>Faxitron</td><td>CellRad</td><td>S No: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No: 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>1mg/ml 재고; S No: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>hESC 인증 matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>희석하려면 차가운 DMEM/F-12를 사용하십시오. S 번호: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>재고 10 ug/ml; S 번호 : 38</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>PBS의 4 % 주식; S 번호 : 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>산타 크루즈</td><td>사우스 캐롤라이나 - 21705</td><td>1/100; S 번호: 40</td></tr><tr><td>nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S 번호: 41</td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P9416-100ML</td><td>S 번호: 42</td></tr><tr><td>알칼리 인산가수분해효소 키트</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S 번호: 43</td></tr><tr><td>Cas9 단백질</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>해동 및 분취; S 번호: 44</td></tr><tr><td>염소 또는 당나귀 혈청</td><td>시그마</td><td>D9663/G9023</td><td>S 번호: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S 번호: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S 번호: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S 번호: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S 번호: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S 번호: 50</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S No: 51</td></tr><tr><td>Mega Shortscript T7 kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Mega Clear kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>S No: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>CloneJET 클로닝 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No: 56</td></tr><tr><td>Fragment analyzerTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>S No: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>실온; S No: 58</td></tr><tr><td>동결 매체 mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>냉동 매체 CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S No: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>인간 췌장 세포</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>S No: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; 신경 유도 매체</td><td>줄기세포 기술</td><td>5835</td><td>S 번호: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>S 번호: 65</td></tr><tr><td>2% B27-인슐린</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>S 번호: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72052</td><td>S 번호: 67</td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72552</td><td>S 번호: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S 번호: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S 번호: 70</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8761-100ML</td><td>S 번호: 71</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8270-100G</td><td>S 번호: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>S 번호: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>S 번호: 74</td></tr><tr><td>TUJ1 항체</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S No: 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No: 76</td></tr><tr><td>SOX17 항체</td><td>R & D 시스템</td><td>AF1924</td><td>S No: 77</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&trade;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S No: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II(세포 분류기)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S No: 80</td></tr></tbody></table>

효율적인 생성 및 급지대 무료 ipsc crispr cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 "NGG" protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.

이 책에서 우리 통합 또는 발자국 무료 센다이 바이러스 벡터를 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서 iPSC의 세대에 대 한 간단 하지만 효율적인 프로토콜을 따라 했습니다. 그림 1A 이 재활 프로토콜의 도식 적인 표현을 보여준다. Prigrow III 매체에 경작 하 고 센다이 바이러스 위에서 설명한 대로 불리고 인간의 췌 장 세포가 상업적으로, 구매 되었다. 췌 장 세포를 형성 하는 불리고 스핀 0, 당일 센다이 바이러스 변환 후 ~ 5 일에 대 한 모든 형태학 상 변화를 보여주지 않았다 하지만 다음 더 큰 핵과 nucleoli 반올림 될. 일부 초기 식민지 주 후 변환 후 보였다 하지만 그들은 했다 하지, 우리의 경험, 이러한 식민지 신속 하 게 분열 하 고는 일반적으로 '초기 부분적으로 재설정된 셀'을 강력한 식민지를 설정 하지 않습니다. 약 10-15 일 후 변환, 작은 밝은 식민지 관찰 했다 고 성장 (<st...

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 feeder-free 조건에서 인간 췌장 세포로부터 footprint-free 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, IPSCs)를 생성하고, CRISPR-Cas9 리보핵산단백질을 사용하여 세포를 편집한 후, 최종적으로 수정된 단일 세포 클론의 특성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 footprint-free IPSCs의 생성 및 CRISPR-Cas9 리보핵산단백질을 이용한 편집과 같이 인간 줄기세포 게놈 편집 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편집된 IPSCs의 클론 라인을 높은 신뢰도로 생성할 수 있으며, 모자이시즘(mosaicism)의 증거가 없다는 점입니다.6-웰 플레이트를 저온 콜라젠으로 코팅한 후, 도입일(0일차)에 웰당 약 2.5 x 10⁵ 개의 세포 또는 최소 60%의 합류도(confluency)를 달성할 수 있도록 2일차에 Prigrow III 배지를 사용하여 초기 계대 인간 일차 췌장 세포를 분주합니다. 도입 당일, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 수확하고 세포 수를 센 후, Sendai 벡터 튜브 한 세트를 얼음 위에서 해동하고 각 튜브의 계산된 부피를 미리 데워진 1 mL의 Prigrow III 배지에 조심스럽게 첨가합니다. 파이펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합합니다.세포로부터 Prigrow III를 흡입하여 제거하고, 리프로그래밍 바이러스 혼합물을 웰에 천천히 첨가합니다. 그 후 37 °C 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후에 세포 위의 바이러스 혼합물을 조심스럽게 제거하고 신선한 Prigrow III 배지로 교체합니다.6일째에, 세포 분리 용액 1 mL를 세포에 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 그 다음, rock inhibitor가 포함된 Prigrow III를 사용하여 모든 세포를 전날 준비한 MEF 디시에 분주합니다. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.세포 덩어리나 콜로니의 출현 여부를 정기적으로 관찰하십시오. 이는 리프로그래밍된 세포를 나타내며, 자갈 모양의 형태와 크고 뚜렷한 핵 및 인을 가진 클론 응집체를 형성합니다. iPSC 콜로니로 추정되는 부위를 표시하고 성장을 정기적으로 확인하십시오. 24웰 MEF 플레이트를 준비한 후 형질도입으로부터 거의 4주가 지나면, 분석 증명서(certificate of analysis)의 희석 배수를 기준으로 분주하여 매트릭스 막을 준비하십시오.24-48개의 콜로니를 선택하여 mTeSR1이 코팅된 매트릭스 멤브레인 24웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 24시간 동안 배양하고 매일 배지를 교체합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.매트릭스 멤브레인에 도말된 견고한 콜로니를 분리하기 위해 500 mcL의 dispase를 첨가하십시오. 세포를 20분 동안 배양한 후, 매트릭스 멤브레인이 코팅된 12-웰 플레이트에 다시 도말하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 알칼라인 포스파타아제 염색, 면역 염색 및 FACS 분석을 사용하여 클론을 확장하고 특성화하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 sgRNA를 합성한 후 HIPSC를 형질전환하려면, Cas9 단백질 0.5 mcg와 각 sgRNA 0.5 mcg를 22 mcL의 반응 부피로 혼합하여 각 샘플에 대한 뉴클레오팩션 마스터 믹스를 준비합니다. 락 인히비터(rock inhibitor)가 포함된 배지를 흡입하여 제거한 후, 2 mL의 RTPBS를 사용하여 iPSC의 각 웰을 세척합니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고 1 mL의 세포 분리 용액을 첨가합니다.플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 3 mL의 mTeSR1 배지에 재현탁하고, 피펫팅을 통해 조심스럽게 위아래로 섞어 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 해리된 세포를 5 mL의 mTeSR1 배지가 들어 있는 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.뉴클레오펙션 마스터 믹스에 P3 일차 세포 보충제 16.4 mcL와 Nucleofector 키트의 보충제 1 3.6 mcL를 추가합니다. 세포 수를 세고 원심 분리한 후, 0.5 x 10⁶개의 세포 단위당 이전에 준비한 트랜스펙션 마스터 믹스 22 mcL에 재현탁합니다. 세포를 Nucleocuvette 스트립의 웰 하나에 있는 중앙 챔버로 빠르게 옮깁니다.그런 다음, 스트립을 Nucleofector 장치에 넣고 program CB150을 사용하여 세포를 뉴클레오펙션합니다. 뉴클레오펙션 후, 10 micromolar rock inhibitor가 포함된 예열된 mTeSR1 배지 80 mcL를 뉴클레오펙션된 세포가 있는 각 웰에 빠르게 첨가합니다. 파이펫팅으로 천천히 섞어줍니다.스트립의 세포를 rock inhibitor가 포함된 mTeSR1 배지가 담긴 매트릭스 막 코팅 12웰 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮깁니다. MEF 플레이트를 준비한 후 배양 두 번째 날에, 단일 세포 분리 전 최소 2시간 동안 HIPSC의 배지를 mTeSR1에서 1XSMC4가 보충된 mTeSR1로 교체합니다. HIPSC의 배지를 흡입하여 제거하고 PBS를 사용하여 세포를 조심스럽게 세척합니다.그런 다음 각 웰에 500 mcL의 세포 분리 용액을 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에 1 mL의 mTeSR1을 첨가하고 파이펫으로 여러 번 부드럽게 섞어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 미리 준비한 96-웰 플레이트의 개별 웰에 단일 세포를 분주합니다.분류 후 4일이 지나면 콜로니 형성이 뚜렷하게 나타나야 합니다. 이 시점에서 배양액을 1X SMC4가 첨가된 HESC 배지로 교체하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 표적 DNA를 추출 및 확장한 후, 프래그먼트 분석 키트를 사용하여 모든 클론의 PCR 증폭 표적 게놈 영역을 제조사의 지침에 따라 겔 염색 믹스로 실행하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 다능성 iPSC 클론을 확인합니다. Sendai 바이러스 형질도입 전, 췌장 세포는 전형적인 방추형 모양을 보입니다. 12일째까지 MEF 상에서 인간 다능성 세포 콜로니와 유사한 작고 조밀한 콜로니가 나타납니다.일반적으로, 완전히 리프로그래밍된 인간 IPSC 콜로니는 경계가 매우 뚜렷하며 23일에서 30일 사이에 수확할 수 있습니다. 여기 23일 차의 분리된 콜로니가 나와 있습니다. 췌장 세포의 Sendai virus 리프로그래밍 후, 피더 프리(feeder-free) 조건에서 수확 및 배양한 IPSC 콜로니의 전형적인 위상차 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.오른쪽에는 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase)로 염색되어 붉은색을 띠는 IPSC 콜로니들이 보입니다. 이 패널들에서 볼 수 있듯이, 다능성 마커인 OCT4 및 NANOG에 대한 면역 염색을 통해 IPSC를 확인하였습니다. 본 실험에서는 IPSC를 세포 표면 마커로 염색하였으며, 단일 세포 현탁액을 대상으로 FACS 분석을 수행하였습니다.녹색 피크는 췌장 IPSC를 나타내며, 보라색 피크는 IPSC 음성 세포를 포함합니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 분리 및 세포 배양을 위해 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 IPSC 및 ESC의 유전자 타겟팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있으며, 정밀한 유전자 변형을 통해 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 풋프린트가 없고 피더 세포가 없는 iPSC를 안정적으로 생성하고, 게놈 편집을 양측 대립유전자에 대해 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 인간 췌장 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로틴을 이용한 발자국 없는 iPSC 생성 및 유전자 편집 방법을. 이 기술은 높은 신뢰성으로 편집된 클론 계통을 생성하고 모자이크 현상이 없어 정밀한 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

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