효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

이 프로토콜의 전반적인 목표는 feeder-free 조건에서 인간 췌장 세포로부터 footprint-free 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, IPSCs)를 생성하고, CRISPR-Cas9 리보핵산단백질을 사용하여 세포를 편집한 후, 최종적으로 수정된 단일 세포 클론의 특성을 분석하는 것입니다. 이 방법은 footprint-free IPSCs의 생성 및 CRISPR-Cas9 리보핵산단백질을 이용한 편집과 같이 인간 줄기세포 게놈 편집 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 편집된 IPSCs의 클론 라인을 높은 신뢰도로 생성할 수 있으며, 모자이시즘(mosaicism)의 증거가 없다는 점입니다.

6-웰 플레이트를 저온 콜라젠으로 코팅한 후, 도입일(0일차)에 웰당 약 2.5 x 10⁵ 개의 세포 또는 최소 60%의 합류도(confluency)를 달성할 수 있도록 2일차에 Prigrow III 배지를 사용하여 초기 계대 인간 일차 췌장 세포를 분주합니다. 도입 당일, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 수확하고 세포 수를 센 후, Sendai 벡터 튜브 한 세트를 얼음 위에서 해동하고 각 튜브의 계산된 부피를 미리 데워진 1 mL의 Prigrow III 배지에 조심스럽게 첨가합니다. 파이펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합합니다.

세포로부터 Prigrow III를 흡입하여 제거하고, 리프로그래밍 바이러스 혼합물을 웰에 천천히 첨가합니다. 그 후 37 °C 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환 24시간 후에 세포 위의 바이러스 혼합물을 조심스럽게 제거하고 신선한 Prigrow III 배지로 교체합니다.

6일째에, 세포 분리 용액 1 mL를 세포에 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 그 다음, rock inhibitor가 포함된 Prigrow III를 사용하여 모든 세포를 전날 준비한 MEF 디시에 분주합니다. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

세포 덩어리나 콜로니의 출현 여부를 정기적으로 관찰하십시오. 이는 리프로그래밍된 세포를 나타내며, 자갈 모양의 형태와 크고 뚜렷한 핵 및 인을 가진 클론 응집체를 형성합니다. iPSC 콜로니로 추정되는 부위를 표시하고 성장을 정기적으로 확인하십시오. 24웰 MEF 플레이트를 준비한 후 형질도입으로부터 거의 4주가 지나면, 분석 증명서(certificate of analysis)의 희석 배수를 기준으로 분주하여 매트릭스 막을 준비하십시오.

24-48개의 콜로니를 선택하여 mTeSR1이 코팅된 매트릭스 멤브레인 24웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 24시간 동안 배양하고 매일 배지를 교체합니다. 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

매트릭스 멤브레인에 도말된 견고한 콜로니를 분리하기 위해 500 mcL의 dispase를 첨가하십시오. 세포를 20분 동안 배양한 후, 매트릭스 멤브레인이 코팅된 12-웰 플레이트에 다시 도말하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 알칼라인 포스파타아제 염색, 면역 염색 및 FACS 분석을 사용하여 클론을 확장하고 특성화하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 sgRNA를 합성한 후 HIPSC를 형질전환하려면, Cas9 단백질 0.5 mcg와 각 sgRNA 0.5 mcg를 22 mcL의 반응 부피로 혼합하여 각 샘플에 대한 뉴클레오팩션 마스터 믹스를 준비합니다. 락 인히비터(rock inhibitor)가 포함된 배지를 흡입하여 제거한 후, 2 mL의 RTPBS를 사용하여 iPSC의 각 웰을 세척합니다. 그런 다음 PBS를 흡입하여 제거하고 1 mL의 세포 분리 용액을 첨가합니다.

플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 3 mL의 mTeSR1 배지에 재현탁하고, 피펫팅을 통해 조심스럽게 위아래로 섞어 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 해리된 세포를 5 mL의 mTeSR1 배지가 들어 있는 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.

뉴클레오펙션 마스터 믹스에 P3 일차 세포 보충제 16.4 mcL와 Nucleofector 키트의 보충제 1 3.6 mcL를 추가합니다. 세포 수를 세고 원심 분리한 후, 0.5 x 10⁶개의 세포 단위당 이전에 준비한 트랜스펙션 마스터 믹스 22 mcL에 재현탁합니다. 세포를 Nucleocuvette 스트립의 웰 하나에 있는 중앙 챔버로 빠르게 옮깁니다.

그런 다음, 스트립을 Nucleofector 장치에 넣고 program CB150을 사용하여 세포를 뉴클레오펙션합니다. 뉴클레오펙션 후, 10 micromolar rock inhibitor가 포함된 예열된 mTeSR1 배지 80 mcL를 뉴클레오펙션된 세포가 있는 각 웰에 빠르게 첨가합니다. 파이펫팅으로 천천히 섞어줍니다.

스트립의 세포를 rock inhibitor가 포함된 mTeSR1 배지가 담긴 매트릭스 막 코팅 12웰 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮깁니다. MEF 플레이트를 준비한 후 배양 두 번째 날에, 단일 세포 분리 전 최소 2시간 동안 HIPSC의 배지를 mTeSR1에서 1XSMC4가 보충된 mTeSR1로 교체합니다. HIPSC의 배지를 흡입하여 제거하고 PBS를 사용하여 세포를 조심스럽게 세척합니다.

그런 다음 각 웰에 500 mcL의 세포 분리 용액을 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 각 웰에 1 mL의 mTeSR1을 첨가하고 파이펫으로 여러 번 부드럽게 섞어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 미리 준비한 96-웰 플레이트의 개별 웰에 단일 세포를 분주합니다.

분류 후 4일이 지나면 콜로니 형성이 뚜렷하게 나타나야 합니다. 이 시점에서 배양액을 1X SMC4가 첨가된 HESC 배지로 교체하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 표적 DNA를 추출 및 확장한 후, 프래그먼트 분석 키트를 사용하여 모든 클론의 PCR 증폭 표적 게놈 영역을 제조사의 지침에 따라 겔 염색 믹스로 실행하십시오.

텍스트 프로토콜에 따라 다능성 iPSC 클론을 확인합니다. Sendai 바이러스 형질도입 전, 췌장 세포는 전형적인 방추형 모양을 보입니다. 12일째까지 MEF 상에서 인간 다능성 세포 콜로니와 유사한 작고 조밀한 콜로니가 나타납니다.

일반적으로, 완전히 리프로그래밍된 인간 IPSC 콜로니는 경계가 매우 뚜렷하며 23일에서 30일 사이에 수확할 수 있습니다. 여기 23일 차의 분리된 콜로니가 나와 있습니다. 췌장 세포의 Sendai virus 리프로그래밍 후, 피더 프리(feeder-free) 조건에서 수확 및 배양한 IPSC 콜로니의 전형적인 위상차 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.

오른쪽에는 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase)로 염색되어 붉은색을 띠는 IPSC 콜로니들이 보입니다. 이 패널들에서 볼 수 있듯이, 다능성 마커인 OCT4 및 NANOG에 대한 면역 염색을 통해 IPSC를 확인하였습니다. 본 실험에서는 IPSC를 세포 표면 마커로 염색하였으며, 단일 세포 현탁액을 대상으로 FACS 분석을 수행하였습니다.

녹색 피크는 췌장 IPSC를 나타내며, 보라색 피크는 IPSC 음성 세포를 포함합니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 분리 및 세포 배양을 위해 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 IPSC 및 ESC의 유전자 타겟팅과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있으며, 정밀한 유전자 변형을 통해 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 풋프린트가 없고 피더 세포가 없는 iPSC를 안정적으로 생성하고, 게놈 편집을 양측 대립유전자에 대해 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.