CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

이 프로토콜의 전반적인 목표는 CRISPR/Cas9 복합체의 전핵 주입을 통해 유전자 조작 골든 시리아 햄스터를 생산하는 자세한 절차를 시청자에게 제공하는 것입니다. 우리가 Golden Syrian Hamster에서 개발한 이 PN 주입 프로토콜은 이 사업에서 유전 공학을 가능하게 합니다. 이 기술은 동물 모델 개발 분야에 큰 기여를 하고 있습니다.

햄스터 배아가 환경에 극도로 민감하기 때문에, 우리는 햄스터 배아의 특별한 틈새를 수용하기 위해 독특한 전핵 주입 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술의 개발은 처음으로 유전자 조작 햄스터 모델을 생산할 수 있기 때문에 인간 질병 모델링에서 큰 진전입니다. 이 실험의 경우, 전핵 또는 PN 주입 하루 전에 HECM-9 배지가 있는 35mm 접시의 뚜껑에 Zygote 취급 접시와 PN 주입 방울을 준비합니다.

중간 방울을 미네랄 오일로 덮습니다. 방울과 HECM-9 배지의 균형을 맞추기 위해 섭씨 37.5도에서 하룻밤 동안 배양합니다. PN 주사 당일에는 HECM-9를 사용하여 배아 세척 접시를 준비합니다.

필요할 때까지 인큐베이터에 보관하십시오. 난관을 분리하기 위해, 안락사된 과배란 암컷 햄스터를 수술용 커튼에 눕힙니다. 70% 에탄올로 복부를 문지릅니다.

다음으로 피부와 복부 근육층을 정중선에 단단히 잡고 복부 끝을 따라 절개합니다. 복부 장기를 노출시키려면 복막을 절개한다. 다음으로, 가는 집게를 사용하여 자궁 뿔 중 하나를 잡고 복부에서 조직을 집어넣습니다.

자궁을 메소메트리움 및 지방 조직과 분리합니다. 첫 번째 절단은 난관과 난소 사이에, 두 번째는 자궁의 작은 부분을 포함하면서 난관-자궁 접합부를 절단합니다. 같은 고기 접시에 난관을 놓습니다.

해부 현미경으로 접합자를 수집하려면 숫자 5 Dumont 겸자를 사용하여 자궁 뿔의 측면을 잡습니다. 집에서 만든 바늘을 안저 끝에서 난관 내강에 삽입합니다. 그런 다음 300-400 마이크로 리터의 HECM-9 배지로 난관을 세척합니다.

세척 직후, 접합자를 수집하십시오. 취급 접시에 HECM-9로 두 번 씻으십시오. 모든 접합자는 이 발달 단계에서 적층 세포에서 제거되어야 합니다. 그 직후, 빛에 노출되지 않도록 주사를 맞을 때까지 접합자를 인큐베이터에 넣으십시오.

주입을 준비하기 위해 Cas9-sgRNA RNP를 얼음 위에서 해동합니다. 주사 직전에 모세관 작용으로 바늘을 채울 수 있도록 용액이 들어있는 튜브에 바늘의 뒤쪽 끝을 넣어 RNP 용액을 주입 바늘에 넣습니다. 그런 다음 바늘 굽힘의 약 3mm까지 홀더 피펫에 미네랄 오일을 채 웁니다. 홀더 피펫의 끝이 접시 바닥과 수평이 되도록 홀더를 마이크로 인젝터에 놓습니다.

흡입하여 바늘 끝을 중간으로 채웁니다. 그런 다음 주사 바늘을 홀더와 반대쪽 10-15도 각도로 설정합니다. 다음으로, 접합자를 식별하고 홀더 바늘을 사용하여 미세한 흡입을 적용합니다.

약간 더 큰 수핵과 암컷 전핵은 가급적이면 동일한 초점 범위 내에 있어야 하며 보유자와 평행하게 정렬되어야 합니다. 3시 방향의 주사 바늘을 사용하여 투명대와 수컷 전핵을 관통합니다. 전핵이 부풀어 오르면 주사 바늘을 빨리 빼서 핵이 바늘에 부착하는 것을 방지하고 바늘이 손상되지 않도록 합니다.

Cas9/sgRNA 시스템에 의한 STAT2 및 RAG1 유전자에 대한 유전자 표적화의 효율성은 수용 암컷의 출생률과 의도된 유전자 변형을 가진 살아있는 새끼의 수에 의해 평가됩니다. 새끼의 PCR 제한 단편 길이 다형성 분석 또는 PCR-RFLP의 유전형 분석 결과는 유전자 표적화의 효율성을 보여줍니다. 1열은 양대립유전자 표적 대립유전자를 나타냈고, 3열과 7열은 단대립형질 또는 모자이크형으로 표적 대립유전자를 나타냅니다.

이 기술은 연구자들이 인간 질병에 대한 새로운 유전자 조작 햄스터 모델을 개발할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CRISPR/Cas9 복합체의 전핵 주사를 통해 유전자 조작 골든 시리아 햄스터를 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.