Name: CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 원핵 주입을 이용한 유전자 조작 골든 시리아 햄스터 생산 프로토콜입니다. 민감한 햄스터 배아 처리 기술과 HECM-9 배지 사용법을 익혀 질병 모델 동물 개발에 기여하세요.

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이 간행물에 보고 된 연구 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID) (ZW)을 수상 번호 1R41OD021979에서 건강의 국가 학회에의 하 고 다음-세대 BioGreen 21에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다 프로그램, 한국, no를 부여 합니다. PJ01107704 (ZW) 하 고 no를 부여. (익)을 PJ01107703입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 건강의 국가 학회 또는 BioGreen 21 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 감사 박사 Nikolas Robl는 원고 편집.

이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 유타 주립 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC 프로토콜: 2484). 이 프로토콜에서 사용 하는 햄스터는 성인 (나이의 6-10 주) LVG 스트레인 시리아 황금 햄스터. 모든 햄스터 Bioinnovation 센터, 유타 주립 대학에서 물고기에서 지 내게 됩니다. 실내 온도 23 ° C에서 설정, 습도 40-50%에서 설정 되 고 가벼운 주기 설정 14 L: 10 (빛: 어둠). 가능 하다 면, 살 균 기술로 배아 조작 및 surugical 절차를 수행 합니다.
1. sgRNA 및 Cas9/sgRNA Ribonucleoproteins (RNP) 준비
<ol><li>SgRNAs 절차에 따라 체 외에 전사 (자료 테이블, 보충 1) 합성 키트 설명서에 설명 된 음성 합성.</li>
	<li>Ribonucleoproteins 조립, 1 µ g의 sgRNA와 Cas9의 2 µ g을 혼합 하 고 10-15 분 동안 실내 온도에 믹스를 품 어. PN 주입, 100 ng / µ L Cas9, 50 ng / µ L sgRNA 10 m m 테 버퍼 (RNase 무료, 자료 테이블)의 농도에서 작업 솔루션을 확인 합니다.</li>
</ol>2. 정 관 수술 준비
참고: 정 관 수술은 나이의 6-8 주에 남성 햄스터에 수행 됩니다. 수술 10-14 일 첫 짝짓기 앞서 수행 되어야 한다. 불 임은 비옥한 여성 짝짓기에서 실패 한 임신에 의해 확인 된다. Vasectomized 남성 일반적으로 성적으로 덜 활성화 되기 전에 1 년 동안 사용할 수 있습니다.
<ol><li>40 mg/kg (마 취 제)와 (xylazine) 10 mg/kg의 복용량과 케 타 민/xylazine의 복 (i.p.) 주입 하 여 남성을 anesthetize. 페달 반사 (발가락 핀치)의 부족으로 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>마른 티슈 페이퍼에 지 recumbency에 sedated 햄스터를 하다. 린스 수술 대체 하 여 살 균 처리의 3 라운드와 복 부 사이 70% 알코올과 povidone-요오드 솔루션 스크럽.</li>
	<li>1.5 c m 중간 선 (그림 1a)에서 각 측에 1 cm를 확장 하는 포에 두개골을 시작 하는 수술가 위 수직 절 개를 확인 합니다. 피부, 피하 조직, 그리고 교육 incise 알바 복 막 공간 (그림 1b)에 액세스할 수.</li>
	<li>고환 및 지방 조직 밖으로 강제로 음 낭의 꼬리 부분에 부드러운 압력을 적용. 집게와 vas deferens를 부드럽게 잡고 하 고 신중 하 게 집게 (그림 1c)의 두 번째 세트로 중이 야에서 혈관을 분리.</li>
	<li>루프를 형성 하는 집게와 vas deferens를 잡으십시오. 그것은 빨간색 때까지 불꽃에 다른 집게의 끝을 열 고 vas deferens의 루프를 제거 하려면 그것을 사용 하 여. 지방 조직과 고환 다시 복 부에 삽입 합니다. 동일한 절차를 반대 하는 사이드에 vas deferens를 제거 합니다.</li>
	<li>먼저 피부를 봉합 뒤 근육 봉합 동물 복구 될 때까지 30 분 대 한 장에 따뜻한 패드에 동물을 놓습니다. 정상적인 활동을 다시 시작 될 때까지 동물을 관찰 합니다.</li>
</ol>3. 기증/받는 햄스터 준비 일정
<ol><li>모니터 및 기록 estrous 사이클입니다. 참고: 여성 햄스터 출산 직후 유지 되는 안정적인 4 일 estrous 주기 있다. Estrous의 첫날에 여성, 노란 고 스티커 질 출력 (그림 2a)에 의해 식별할 수 있습니다. Estrous의 여성을 4 일에는 투명 하 고, 끈적끈적한 점액 (그림 2b)에 의해 식별할 수 있습니다.</li>
	<li>기증자 햄스터의 superovulation에 대 한 성적으로 성숙한 여성 superovulate (> 6 주) 임신 암 말의 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG; 50 IU/mL로에 녹아 PBS)의 IP 주입 estrous 사이클의 첫 번째 날에 (표 1) 9-12 분 사이. 참고: PMSG는 유도 하는 superovulation에 대 한 하지만 estrous 주기 동기화.</li>
	<li>80-PMSG (4 일, 오후 6-8)의 주입 후 84 h 짝짓기 남성과 감 금 소에 여성을 놓습니다. 햄스터 matings 결합을 초래 하지 않는 플러그는 matings를 보고 하 여 성공적인 matings 확인 해야 합니다.</li>
	<li>Pseudopregnant 여성 vasectomized 남성 estrous의 4 일에 성적으로 성숙한 암컷 짝짓기에 의해 준비. 기증자와 받는 여성을 준비 하기 위한 시간 일정은 표 2에 표시 됩니다. 참고: 사실 임신 여성 또한 받는 사람, 즉, 여성 코트 색상 같은 색상 비옥한 남성과 헝 클 어진 황금 색깔 구별로 사용할 수 있습니다. 배아 전송에서 파생 된 강아지 코트 색상에 따라 확인할 수 있습니다. 사실 임신 여성을 사용 하 여 잠재적인 이점은 이다 endogenously 생산된 배아는 성공적인 임신을 확인 하 고 주입 PN 배아 이식; 하는 데 도움이 받는 사람으로 진정한 임신 여성을 사용 하 여 잠재적인 단점은 PN 주입 태아 필요가 endogenously 경쟁할 배아 이식에 대 한 생산.</li>
</ol>4. 접합 자 격리
<ol><li>문화 매체를 준비 (HECM-9; 보충 2에서 제조 법을 설명 하는), 앞에서 설명한 McKiernan 및 Bavister12.</li>
	<li>PN 주입에 앞서 1 일 접합 자 요리 (25 µ L/드롭)와 HECM 9 35 mm 접시의 뚜껑에 PN 주입 드롭 (100 µ L) 처리를 준비 합니다. 다음 커버 미네랄 오일 중간 상품. 다음과 같은 조건에서 하룻밤 인큐베이터에서 균형 매체: 37.5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 와 100% 습도.</li>
	<li>PN 주입 예정 당일, HECM 9 배아 내뿜는 요리 (1 접시/기증자 햄스터)를 준비 하 고 인큐베이터에서 사용까지 모든 요리를 저장.</li>
	<li>CO2superovulated 햄스터 안락사</li>
	<li>수 란 관 절연<ol>
<li>외과 용 드 레이프 또는 휴지 등 recumbency에서 안락사 여성 햄스터를 놓고 70% 에탄올 스프레이 함께 복 부를 준비 합니다.</li>
		<li>단단히 피부와 복 부 근육 층은 중간에 고 절 개. 복 부 장기 노출 복 incise</li>
		<li>좋은 집게와 자 궁 뿔 중 하나를 파악 하 고 복 부에서 조직 철회. Mesometrium 및 지방 조직에서 자 궁을 구분 합니다. 수 란 관, 자 궁 (자 궁의 작은 부분을 포함)의 교차점에 인접 한은 수 란 관 및 난소와 두 번째 컷 컷을 확인 합니다. 두 oviducts 같은 플러시 접시에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플러시 및 zygotes 수집<ol>
<li>해 부 현미경 아래 #5 Dumont 집게와 자 궁 경적의 측면을 잡고 고 infundibular 끝에서 수 란 관의 루멘으로 수 제 바늘 (그림 3)를 삽입 하 고 300-400 µ L HECM 9 매체의와 수 란 관을 플러시.</li>
		<li>zygotes를 즉시 수집 하 고 처리 접시에 HECM 9 매체와 두 번 그들을 씻어. 개발의이 단계에서 모두는 zygotes의 적 운 세포에서 걸치기 한다.</li>
		<li>빛에 노출을 최소화 하기 위해 컬렉션 직후에 zygotes 인큐베이터 (37.5 ° C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 와 100% 습도)에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PN 주입
<ol><li>Cas9/sgRNA RNP 얼음에 녹여 고 전체 PN 주입 과정 동안 얼음에 복잡 한을 유지 합니다.</li>
	<li>주입 바늘 주입 실험 직전 Cas9/sgRNA RNP 솔루션을 로드 합니다. Cas9/sgRNA RNP 솔루션이 포함 된 튜브에 주입 바늘의 끝부분을 놓고 모 세관 작용에 의해 바늘을 채우기 위해 Cas9/sgRNA RNP 솔루션을 허용 합니다.</li>
	<li>주입 접시와 바늘을 준비 합니다. 홀더 바늘의 굴곡의 ~ 3 mm 이내에 미네랄 오일에 홀더 피펫으로를 채우십시오. 접시의 바닥에 수평 놓고 홀더는 바늘의 팁과 microinjector에서 흡입에 의해 매체와 바늘의 팁을 작성 합니다. 홀더 반대는 10-15 ° 각도로 주사 바늘을 설정 합니다.</li>
	<li>PN 주입<ol>
<li>zygote를 식별 하 고 잘 흡입 홀더 바늘으로 적용. 이상적으로, 남성과 여성의 pronuclei 같은 초점 범위와 홀더를 정렬된 병렬 있습니다.</li>
		<li>주사 바늘으로 구역 및 남성 pronuclei (3 시 위치)를 침투.</li>
		<li>일단 바늘에 고착에서 핵을 방지 하 고는 pronucleus 손상을 방지 하는 pronucleus 부 주사 바늘을 신속 하 게 철회.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. zygotes Pseudopregnant 햄스터를 전송
<ol><li>(같은 방법으로 정 관 위의 섹션에 설명 된) pseudopregnant 햄스터를 anesthetize 하 고 recumbency 복 부에 수술 드 레이프 또는 건조 티슈 페이퍼에 누워.</li>
	<li>눈 건조를 방지 하 고 천이나 종이 빛 으로부터 눈을 보호 하기 위해 머리를 커버 하는 동물의 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 면도 하 여 신체의 측면 측면을 준비는 몸 povidone-요오드 스크럽 및 3 번 70% 에탄올 스크럽의 3 배를 적용 하 여 다음의 각 측면에 약 4 cm x 4 cm 피부 지역. 게 2 cm 수직 절 개를 2 cm 꼬리 마지막 갈비뼈 ( 그림 4a, 4b에서 같이)는 동물의 뒷면의 각 측에.</li>
	<li>집게와 지방 패드를 잡고 고 수 란 관 및 자 궁 표시 될 때까지 부드럽게 당겨. 클램프는 hemostats와 지방 패드 하 고 반영 지방 패드 dorsally 척추 (그림 4c). 자 궁 관 배아 전송 (그림 4 d)에 대 한 30 게이지 바늘으로 관통 될 수 있다 그런 재생산 지역 위치.</li>
	<li>HECM-9 새로운 접시에 주입된 zygotes 워시. 새로운 유리 피 펫을 사용 하 여 (직경: 150 ~ 200 µ m)를 10-15 zygotes 로드. 뒤에 여러 개의 공기 방울 진주의 사슬으로는 zygotes를 정렬 합니다. 피펫으로 단계 6.3에서에서 오픈 관통된 관으로 삽입 하 고 가볍게는 수 란 관에 zygotes 전송 피 펫에 불어. 부는 첫 번째 공기 방울이 수 란 관으로 (그림 4e)으로 될 때까지 계속 합니다.</li>
	<li>지방 패드를 분리 하 고 복 부 조직을 반환 합니다. 동일한 프로세스에서 다른 수 란 관으로 주입 된 배아의 약 동일한 번호 (10-15) 전송.</li>
	<li>근육과 2 층에 피부를 봉합. 수술 후 무 통으로 피하 Buprenorphine HCL (0.5 mg/kg)를 관리할 수 있습니다. 햄스터 감 금 소를 반환 하 고 복구에 대 한 따뜻한 패드에 케이지를 놓습니다. 동물 마 취에서 완전히 복구 되 면 동물 방에 감 금 소를 반환 합니다. 수술 후 진통제는 다시 6 시간 후 부여 됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li>
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</ol>

ZW Auratus 바이오, LLC는.에 금융 관심을가지고, 생물 의학 연구 및 농업 응용 프로그램에 대 한 유전자 조작된 동물을 만드는 전문 생명 공학 회사.

더 나은 인간 질병의 모델로 시리아 황금 햄스터의 잠재력을 악용, 우리는 CRISPR/Cas9 복잡 한 햄스터 게놈을 대상으로 제공 하기 위한 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. PN 주입 프로토콜 배아 배양, 온도 및 빛13의 파장을 포함 하 여 몇 가지 주요 변수를 최적화 합니다. 또한 성공적으로 햄스터에 유전자를 대상으로 실시 하기 위한 따라야 하는 여러 햄스터 관련 동물 처리 절차가 있다. 예를 들어 성적으로 성숙한 여성 햄스터 외 인 호르몬 (예: PMSG)와 동기화 될 수 없는 안정적인 4 일 estrous 사이클 있다. 따라서 각 여성의 estrous 사이클을 정확 하 게 추적 하는 것은 superovulation 및 pseudopregnancy 준비 중요 합니다. 30-그녀는 성공적으로 superovulated 경우는 여성에서 60 zygotes는 생산 수 있습니다. 성공적인 superovulation를 위해 지방 종의 증 착을 고려할 필요가 있다. 특히 그...

골든 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus) 생물 의학 연구에 대 한 가장 널리 사용 되는 설치류 중 하나입니다. 농업의 미 교육부에 따르면 약 100000 햄스터 동물 복지 행위 (http://www.aphis.usda.gov; 액세스에 의해 보호 종 중 총 실험 동물 사용의 13%, 2015 년에는 미국에서 사용 되었다 3 월 10 일, 2017).
햄스터는 다양 한 인간 질병의 연구에 다른 설치류에 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어 햄스터에서 유도 된 N-nitrosobis(2-oxopropyl) 아민 (밥)의 histopathology 췌 장 ductal adenocarcinomas 비슷합니다 인간의 췌 장 종양, 밥 처리는 주로 쥐와 폐에서 갑 상선 종양, 간 종양에 유도 하는 동안 마우스1. 햄스터는 작은 설치류 adenoviruses의 복제를 지원 하기 위해 발견, 때문에 그들은 또한 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 벡터 및 안티 아 데 노 바이러스 약2,,34테스트를 위한 선택의 모델. 혈의 연구에 햄스터 모델 쥐 및 쥐에 비해 우위를 제공 하는 점에서 또 다른 예가입니다. 인간과 햄스터 지질 대사 경로에 큰 유사성을 전시 하 고 두 종 인코딩 cholesteryl 에스테 르 이동 단백질 (CETP), 지질 물질 대사, CETP는 쥐에 결 석 하 고5쥐에 중심 역할을 담당 하는 유전자. 또한, 햄스터 출혈 질병 더 에볼라 바이러스6에 노출 다음 인간 형상의 대표적인 개발. 햄스터 아 테 롬7, 구두 carcinomas8및 선 동적인 myopathies9공부에 대 한 선택의 모델도 있습니다. 최근에, 그것은 또한 증명 되었습니다 햄스터 안데스 바이러스 감염에 매우 취약 하 고 hantavirus 폐 증후군 같은 질병, 안데스 바이러스 감염10만 설치류 모델을 개발.
신뢰할 수 없는 작은 설치류 모델을 사용할 수 있는 인간의 질병을 연구 소설 유전 동물 모델에 대 한 unmet 필요를 해결 하기 위해 우리가 최근에 햄스터에 CRISPR/Cas9 시스템 적용에 및 유전자 여러 줄의 생산 햄스터11설계. 햄스터 zygotes는 환경 milieus에 매우 민감한 같은 다른 종에서 개발 된 PN 주입 프로토콜 적합 하지 않습니다. 따라서, 우리는 햄스터 햄스터 배아 시험관을 처리 하기 위한 특별 한 요구를 수용 하는 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템 및 받는 사람 여성에 주입 된 배아의 전송에 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 준비에서 동반 단계를 사용 하 여 자세한 PN 주입 절차를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Cas9</td><td>Invitrogen</td><td>B25640</td><td>1 &뮤; 지/&무; L (~6.1 &mu; M)</td></tr><tr><td>GeneArtTM 정밀 합성 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td> 인간 혈청의 <td>sgRNA 합성</td></tr><tr><td>알부민</td>용 <td>Sigma</td><td>A1653</td><td>배양 매체용</td></tr><tr><td>조명기</td><td>Nikon</td><td>NI-150</td><td>배아 이식용</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 14S</td><td>배아 배양용</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>주사 바늘 제작용</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti-S</td><td>미세 주입 현미경</td></tr><tr><td></td><td>invitrogen</td><td>SMZ745T</td><td>배아 이식 용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M1840</td><td>어둠 보관</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877-2000IU</td><td>과배란 용</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 복잡 한 pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Pronuclear (PN) 주입 기술 1 셀 단계 배아의 pronuclei로 외국 유전 물질을 소개 하는 마우스에 처음 설립 되었다. 소개 유전 물질 배아 게놈으로 통합 하 고 외국 유전 정보 전송 주입된 태아의 어머니를 육성 하기 위해 유전자 변형 동물 생성 수 있습니다. 마우스에 성공, PN 주입 성공적으로 많은 다른 동물 종에 적용 되었습니다. 최근, PN 주입은 성공적으로 고용 되었다 유전자-수정 된 시 약을 소개 활동, 여러 실험실에서 사이트별 유전 수정 하 고 동물 농장을 CRISPR/Cas9 시스템 등. 마스터링 PN 주입 하 여 유전자 변형된 동물을 생산 하기 위해 microinjection 능력의 특별 한 세트, 뿐만 아니라 연구원 이해 해야 한다 재생산 생리학 및 동작의 대상 종 각 종족 고유 때문에 도전입니다. 예를 들어 시리아 황금 햄스터 배아는 독특한 PN 주입 기술을 우리의 그룹에 의해 최근 혁신까지이 종에 불가능 했다 그런 생체 외에서 요구 사항 처리. 우리의 종 수정 PN 주입 프로토콜, 우리는 여러 유전자 녹아웃 (KO)를 생성 하 고 모델 인간의 질병을 성공적으로 사용 되었습니다 (기) 햄스터를 쫓 고에 성공 했다. 여기 우리 햄스터, 배아 처리 조건, 배아 전송 절차, zygotes에 CRISPR/Cas9 복잡 한을 제공 하기 위한 PN 주입 절차를 설명 하 고 농업 유전자를 생산 하는 데 필요한 수정 햄스터.

다음 두 가지 중요 한 단계의 결과에 따라 유전자 변형된 햄스터를 생성에서 설명한 프로토콜의 효율성: 받는 사람 성과 의도 유전 수정 라이브 새끼 수의 라이브 출생 률. 출산 율은 배아 품질의 직접적인 결과 및 PN 사출 고 배아 전송 절차를 수행 하는 개인의 기술. 조작된 배아의 발달 잠재력 손상 되지 보장 하기 위해, 큰 관심은 햄스터 배아의 시험관에서 처리 하는 동안 필요 합니다. 우리는 정기적으로 pseudopregnant 받는 사람 여자와 라이브 출생 률의 60-80%를 얻을. 표 3 에서는 RAG1 녹아웃 실험에서 라이브 출생 률 (pseudopregnant 여성 사용 되었다) 및 STAT2 녹아웃 실험 (사실 임신 검은 암컷 사용 되었다;이 경우 출산 율으로 계산 했다는 새끼의 비율 황금 강아지 생산).
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

클러스터의 pronuclear (PN) 주입은 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced 그리고 CRISPR 관련 단백질-9 nuclease (CRISPR/Cas9) 시스템은 생산 하는 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터는 매우 효율적인 방법. 여기, 우리는 유전자 녹아웃 햄스터 CRISPR/Cas9 시스템의 생산에 대 한 자세한 PN 주입 프로토콜을 설명합니다.

CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

본 프로토콜의 전반적인 목적은 CRISPR/Cas9 복합체의 전핵 주입법을 통해 유전자 변형 골든 시리안 햄스터를 제작하는 상세 절차를 시청자에게 제공하는 것입니다. 우리가 골든 시리안 햄스터에서 개발한 이 전핵 주입 프로토콜은 이 품종의 유전공학적 조작을 가능하게 합니다. 이 기술은 동물 모델 개발 분야에 큰 기여를 할 것입니다.햄스터 배아는 환경에 매우 민감하므로, 당사는 햄스터 배아의 특수한 환경에 맞춘 독자적인 전핵 주입 프로토콜을 개발하였습니다. 이 기술의 개발은 유전적으로 조작된 햄스터 모델을 최초로 제작할 수 있게 함으로써 인간 질병 모델링 분야에 있어 큰 진전을 이룬 것입니다. 본 실험을 위해 전핵(PN) 주입 하루 전, HECM-9 배지를 사용하여 접합자 취급 접시와 35 mm 접시 뚜껑 내의 PN 주입 드롭을 준비하십시오.배지 방울을 미네랄 오일로 덮습니다. 방울과 HECM-9 배지의 균형을 맞추기 위해 37.5 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PN 주입 당일에 HECM-9를 사용하여 배아 세척용 디쉬를 준비합니다.필요할 때까지 인큐베이터에 보관하십시오. 난관을 분리하려면, 안락사시킨 과배란 유도 암컷 햄스터를 수술포 위에 등이 위로 오도록 눕힙니다. 복부를 70% ethanol로 닦아내십시오.다음으로, 정중선의 피부와 복근층을 단단히 잡고 복부 끝을 따라 절개합니다. 복부 장기를 노출시키기 위해 복막을 절개합니다. 이어서, 미세 핀셋을 사용하여 자궁각 중 하나를 잡고, 해당 조직을 복부 밖으로 견인합니다.자궁을 광간막 및 지방 조직으로부터 분리합니다. 첫 번째 절개는 난관과 난소 사이에서 수행하고, 두 번째 절개는 난관-자궁 접합부 근처에서 자궁의 일부를 포함하여 수행합니다. 분리한 난관들을 동일한 해부 접시에 넣습니다.해부 현미경 하에서 접합자를 수집하려면, 5번 Dumont 핀셋을 사용하여 자궁각의 측면을 잡습니다. 수제 바늘을 깔때기 끝부분부터 수란관의 내강으로 삽입합니다. 그런 다음, 300에서 400 µL의 HECM-9 배지로 수란관을 세척합니다.세척 직후 접합자를 수집하고, 핸들링 디쉬에서 HECM-9으로 2회 세척합니다. 발달의 이 단계에서는 모든 접합자로부터 난구 세포가 제거되어 있어야 합니다. 그 직후, 빛 노출을 피하기 위해 주입 전까지 접합자를 인큐베이터에 넣어 둡니다.주입 준비를 위해, Cas9-sgRNA RNP를 얼음 위에서 해동합니다. 주입 직전에, 주입 바늘의 뒷부분을 용액이 담긴 튜브에 넣어 모세관 현상으로 바늘이 채워지도록 하여 RNP 용액을 충전합니다. 다음으로, 홀더 피펫에 미네랄 오일을 바늘 굴곡 지점에서 약 3mm 높이까지 채웁니다. 홀더 피펫의 끝이 디시 바닥과 수평이 되도록 마이크로 인젝터에 홀더를 배치합니다.흡입을 통해 바늘 팁을 배지로 채웁니다. 그런 다음, 주입 바늘을 홀더 반대 방향으로 10~15도 각도로 설정합니다. 다음으로, 접합자를 찾아 홀더 바늘을 사용하여 미세하게 흡입합니다.약간 더 크기가 큰 수성 전핵과 여성 전핵이 가급적 동일한 초점 범위 내에 있으며 홀더와 평행하게 정렬되어야 합니다. 주입 바늘을 3시 방향에 두고 투명대를 통과하여 수성 전핵에 진입합니다. 전핵이 팽창하면, 핵이 바늘에 달라붙거나 손상되는 것을 방지하기 위해 주입 바늘을 빠르게 회수합니다.Cas9/sgRNA 시스템을 이용한 STAT2 및 RAG1 유전자의 유전자 타겟팅 효율은 수용 암컷의 생존 출산율과 의도한 유전자 변형을 가진 생존 새끼의 수로 평가합니다. 새끼들을 대상으로 실시한 PCR 제한 효소 절편 길이 다형성 분석(PCR-RFLP)의 유전자형 분석 결과는 유전자 타겟팅 효율을 보여줍니다. 1번 레인은 양쪽 대립유전자가 모두 타겟팅된 경우를 나타내며, 3번과 7번 레인은 단일 대립유전자 또는 모자이크 형태로 타겟팅된 대립유전자를 보여줍니다.이 기술은 연구자들이 인간 질환의 새로운 유전자 변형 햄스터 모델을 개발할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 CRISPR/Cas9 복합체의 전핵 주입을 통해 유전자 변형 골든 시리아 햄스터를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.

높은 처리량 측정 적합성 Leptospira interrogans Transposon 삽입 돌연변이 중 황금 시리아 햄스터 감염의 병렬 시퀀싱

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

칠면조 (HVT)의 herpesvirus 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대에 대 한 벡터 플랫폼으로 널리 사용 됩니다. 이 문서는 통합된 NHEJ-CRISPR/Cas9 및 Cre Lox 시스템을 사용 하 여 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 세대에 대 한 간단 하 고 빠른 접근을 설명 합니다.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

배우세요 CRISPR/Cas9 원핵 주입을 이용한 유전자 조작 골든 시리아 햄스터 생산 프로토콜입니다. 민감한 햄스터 배아 처리 기술과 HECM-9 배지 사용법을 익혀 질병 모델 동물 개발에 기여하세요.

CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산

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