생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

이 프로토콜의 전반적인 목표는 긴밀한 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 설정하기 위해 일차 돼지 뇌 내피 세포를 정제하고 분리하는 것입니다. 이 방법은 약물 전달, 투과성, 수용체 이동, BB의 견고성 및 극성과 같은 혈액 뇌 장벽 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델의 주요 장점은 TEER이 높고 투과성이 낮은 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 만드는 데 사용할 수 있는 1차 뇌 내피 세포의 높은 수율입니다. 이 절차를 시작하려면 뇌를 멸균 흐름 벤치에 놓고 얼음 위에 놓인 비커에 PBS 1리터로 부드럽게 씻습니다.

다음으로, 가는 끝 집게를 사용하여 각 뇌에서 수막을 조심스럽게 제거합니다. 메스를 사용하여 뇌에서 회백질을 한 번에 하나씩 긁어내고 분리된 물질을 얼음 위에 놓인 DMEM/F-12 20밀리리터가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 초기 단편화를 위해 바늘 없이 50ml 주사기를 통해 회백질 물질을 실행합니다.

모든 뇌에 대해 절차를 반복하고 수집된 회백질 물질을 함께 모읍니다. DMEM/F-12 배지를 사용하여 분리된 회백질 물질을 휴대용 조직 균질기의 분쇄기 튜브로 옮깁니다. 느슨한 유봉으로 8 번의 위아래 스트로크를 한 다음 단단한 유봉으로 8 번의 위아래 스트로크를 수행하여 재료를 균질화합니다.

다음으로, 필터 홀더와 140미크론 필터 메쉬가 있는 500ml 파란색 캡 병을 사용하여 균질액을 여과하여 모세혈관을 분리합니다. 모세관 함유 필터를 소화 용액과 함께 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 180RPM으로 페트리 접시를 1시간 동안 배양하거나 10분마다 부드럽게 저어줍니다.

1시간 후 페트리 접시의 현탁액으로 필터에서 모세혈관을 씻어냅니다. 그런 다음 3개의 접시에서 현탁액을 두 개의 50ml 튜브로 분리하고 각 50ml 튜브에 10ml의 DMEM/F-12를 추가하여 분해를 중지합니다. 세포 현탁액을 250배 g, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.

그 후, 상등액을 흡인하고 각 펠릿을 10ml의 DMEM/F-12에 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브에 DMEM/F-12 20ml를 더 추가합니다. PBEC의 부착 조건을 최적화하려면 T-75 플라스크에 코팅 용액을 첨가하여 콜라겐 4가 밀리리터당 150마이크로그램, 피브로넥틴이 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 증류수로 만들어 용액이 전체 표면을 덮도록 합니다.

다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 모세혈관을 해동합니다. 동결 매체를 제거하려면 모세 혈관을 섭씨 4도, 250배 g에서 7분 동안 아래로 돌립니다. 그 후, 상층액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 10 밀리리터 분취액 1-2 밀리리터에 재현탁시킵니다.

그런 다음 모세관 현탁액을 코팅된 T-75 플라스크로 옮기고 플라스크를 부드럽게 기울여 표면에 균등하게 분포되도록 합니다. T-75 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정한다. 하룻밤 배양 후, T-75 플라스크 1개에 대해 밀리리터당 4마이크로그램의 퓨로마이신을 보충한 PBEC 성장 배지 10ml를 준비하고 배지 변경을 수행합니다.

그런 다음 밀리리터당 500마이크로그램의 콜라겐 IV와 밀리리터당 100마이크로그램의 피브로넥틴으로 코팅하고 증류수로 PBEC 파종을 위한 투과성 멤브레인 인서트를 준비합니다. T-75 플라스크에 2ml의 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 트립신화하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5-7분 동안 놓습니다. 뇌 내피 세포를 분리하려면 T-75 플라스크의 측면을 손가락 끝으로 부드럽게 두드린다.

그 후, 세포 용액을 15ml 튜브에 옮기고 250배 g, 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리하여 뇌 내피 세포를 스핀다운합니다. 그 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 1 밀리리터의 매체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 2ml의 매체를 더 추가하여 총 부피를 3ml로 만듭니다.

cell-counting chamber 또는 자동 cell-counting system을 사용하여 수동으로 세포 수를 계수합니다. 비접촉 공동 배양의 경우, 성상세포가 있는 웰로 삽입물을 옮기고, 전날 성상세포 성장 배지로 새로 고침을 받았습니다. 다음 날, PBEC가 포함된 투과성 멤브레인 인서트의 매체를 교체하십시오.

그런 다음 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 각 웰에 750마이크로리터의 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음 인서트에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 인서트당 500마이크로리터의 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음 나머지 750마이크로리터의 분화 배지를 각 성상세포 웰에 추가합니다.

그 후, 다음날까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 분화 배지로 세포를 배양합니다. 분화 배지로 세포를 자극한 다음 날, 챔버를 이중 증류수로 2회, 70% 에탄올로 5분 동안 한 번, 이중 증류수로 두 번 더 헹구어 TEER 측정을 위한 조직 저항 측정 챔버 시스템을 준비합니다. 그런 다음 챔버를 시스템에 연결하고 조직 저항 측정 챔버에 DMEM/F-12 4ml를 첨가한 다음 약 30분 동안 실온에 둡니다.

그런 다음 조직 저항 측정 챔버에 인서트를 조심스럽게 배치하여 TEER 측정을 수행합니다. 다음은 5일 동안 관찰한 PBEC, 배양 및 성상교세포의 위상차 현미경 이미지입니다. 초기 배양 첫날에 정제된 모세관 단편은 모세혈관과 오염 세포의 존재를 모두 보여주었으며, 2일차에 중간 변화를 보이고 추가 성장일째를 보낸 후 모세관 단편에서 성장을 시작하는 PBEC에 대한 선택을 보여주었습니다.

PBEC의 합류 단층은 일반적으로 4일차에서 6일차에 달성되었으며, 이 때 PBEC는 방추 모양의 형태를 보였고 세로로 정렬되었습니다. 바닥 우물에 파종된 쥐 성상세포는 일반적으로 5일 이내에 합류층으로 증식했으며, 2주간의 성장 후 비접촉 공동 배양 모델에 사용되었습니다. 이 기술을 숙달하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 연구자들이 밀접하고 편광된 뇌 내피 세포에서 약물 전달 및 수용체 이동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 in vivo에서 수행할 수 없는 새로운 연구에 사용할 수 있는 in vitro 혈액-뇌 장벽 모델을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.