Name: Imaging dellamiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri la tecnica di imaging iperspettrale e FLIM per rilevare aggregati proteici amiloidi nei tessuti utilizzando oligotiofeni luminescenti coniugati. Questo metodo offre maggiore selettività e sensibilità rispetto alle tecniche convenzionali.

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Gli autori desiderano ringraziare Mikael Lindgren e Chanan Sluzny per consigli su microscopia di fluorescenza e Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark e Kurt Zatloukal per contribuire in sezioni di tessuto o micrografie visualizzati in questa pubblicazione. La raccolta dei dati presentati nel presente documento è stata finanziata dai contributi degli svedesi Brain Foundation (Hjärnfonden), l'associazione Alzheimer svedese (Alzheimerfonden), il Consiglio di ricerca svedese (VR), l'associazione Göran Gustafsson, Georg &#38; Astrid Olsson, progetto EU FP7 Health LUPAS e Università di Linköping.

Nota: sintesi LCO sono stata eseguita nei nostri laboratori per più di un decennio. Essenzialmente applicando protocolli per sostituzione elettrofila aromatica, Palladio catalizzato Croce-accoppiamento, accoppiamento di ammide e idrolisi dell'estere, personalizziamo sinteticamente sonde per scopi diversi 5 , 12. dopo la sintesi, caratterizzazione e purificazione, il prodotto LCO è liofilizzato e conservato a temperatura ambiente. Alcune delle sonde (tra cui hFTAA) sono ora disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
 1. soluzione di macchiatura LCO Nota: se hFTAA è stato acquistato da un fornitore commerciale, si prega di seguire il fornitore &#39; s istruzioni invece sezione 1.
HFTAA <ol><li>risospendere il liofilizzato in NaOH per preparare una soluzione madre di 1 mg/mL da 2 mM. Tenere il brodo in un flaconcino di vetro a 4 ° C. Il brodo può essere conservato per un anno.</li>
	<li>Il giorno di macchiatura, preparare una soluzione di lavoro diluendo il magazzino 1: 10.000 in tampone fosfato salino (PBS).</li>
</ol> 2. Preparazione dei campioni di tessuto Nota: molti tipi di tessuto possono essere imaged usando hFTAA come un indicatore dell'amiloide. Vedere la Figura 1 per esempi. hFTAA è sensibile alla conformazione aggregata. La macchiatura quindi deve preferibilmente essere eseguita su undisrupted aggregati senza esposizione di epitopo. Qualità spettrale ottimale si ottiene se la fissazione del tessuto è ridotto al minimo. Quindi il materiale congelato fresco, delicatamente fissati in etanolo al momento della colorazione, è comodo. Tuttavia, è possibile rilevare anche i giacimenti di amiloide nel tessuto che è stato risolto con ad es., formalina. hFTAA generalmente penetra il tessuto bene. Selezionare uno spessore di campione che è compatibile con la modalità tecnica di imaging.
<ol><li>Se formalina fisso, parafinembedded sezioni vengono utilizzate, deparafinize in xilene tutta la notte. Immergere le sezioni consecutivi bagni di etanolo al 99%, 70% di etanolo, dH 2 O e PBS, 10 min in ciascuno. Consentire le sezioni di tessuto ad asciugare sotto condizioni ambientali. 
	Attenzione: Xilene è sempre gestito in una cappa chimica. Xilene e altri solventi organici sono dannosi.
	<ol><li>Cryosections scongelare a temperatura ambiente. Difficoltà le sezioni di tessuto in formalina al 10% durante la notte e reidratare tuffandoli in bagni consecutivi di etanolo al 99%, 70% di etanolo, dH 2 O e PBS, 10 min in ciascuno. Consentire le sezioni di tessuto ad asciugare sotto condizioni ambientali.</li>
	</ol></li> <li>: Aggiungere gocce di soluzione di lavoro di hFTAA (circa 200 µ l) per le sezioni di tessuto per coprirlo. La goccia deve rimanere sul posto dalla tensione superficiale. Incubare per 30 min a temperatura ambiente per la macchiatura.</li>
	<li>Risciacquare fuori la soluzione colorante con 500 µ l PBS utilizzando una pipetta e poi immergere il vetrino in bagno di PBS per 10 min. Consenti la sezione ad asciugare sotto condizioni ambientali.</li>
	<li>Montare utilizzando il mezzo di montaggio di fluorescenza. Consentire il mezzo di montaggio a riposare una notte. 
	Nota: hFTAA colorazione può essere eseguita in combinazione con altri metodi di colorazione quali immunofluorescenza, cell - o organello marcatori specifici, ecc. Per eseguire co-macchiatura, eseguire il protocollo di colorazione completo di scelta e aggiungere hFTAA colorazione alla fine, a partire dal punto 2.2. Per esempi, vedere Figura 2. Per l'immunofluorescenza, scegliere preferibilmente un anticorpo secondario che è eccitato a 640 nm o superiore. In questa gamma di lunghezza d'onda, hFTAA non assorbe e quindi non può essere eccitato e non darà fluorescenza. Questo assicura che nessun trapasso è visto tra hFTAA e anticorpo.</li>
</ol> 3. La microscopia Nota: utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di filtri di passaggio lungo. Tutte le impostazioni riportate di seguito sono state usate per generare le immagini nella Figura 4. Modifiche potrebbero essere necessario essere fatta a seconda del campione di tessuto e di tipo amiloide. Anche se hFTAA associato a amiloide è stabile verso lo sbiancamento, si consiglia di spegnere la sorgente di luce quando l'esemplare non è esaminato o imaged.
<ol><li>HIS Nota: l'esperimento è stato effettuato usando un microscopio a epifluorescenza con filtri di emissione di passaggio lungo e una testa di macchina fotografica per suo (Vedi Tabella materiali).
	<ol><li>Uso un microscopio a fluorescenza standard è dotato di una fotocamera iperspettrale e filtri di passaggio lungo. Accertarsi che la fotocamera spettrale è calibrata.</li>
		<li>Nel software, il nome del progetto, selezionare &#34; immagine spettrale &#34; e Avvia acquisizione.</li>
		<li>Selezionare l'oggetto di interesse attraverso l'oculare utilizzando il filtro di eccitazione 436-nm e spostare il percorso della luce alla telecamera.</li>
		<li>In the caso Data Manager (CDM), selezionare il tipo di campione Spectral, etichetta il campione, e premere Acquisisci. Verrà aperta la finestra di acquisizione.</li>
		<li>Nella finestra di acquisizione &#34; imaging spettrale &#34;, aprire il menu impostazioni, selezionare acquisizione proprietà e impostare l'intervallo spettrale di 460-700, la qualità di velocità alla massima velocità e la misurazione digitare al filtri gas/laser/sottile. Chiudere la finestra di dialogo.</li>
		<li>Nel menu immagine, selezionare live completo. Nella barra di icone, disattivare frange. Selezionare o ridimensionare un'area di immagine che ha il valore di memoria di picco inferiore a 800 MB. Impostare il tempo di esposizione su un valore che dà una luminosità di immagine totale tra 1.000 e 3.000. Nella barra di icone, premere la fotocamera colorata. Acquisizione avrà inizio. Quando l'acquisizione di immagini è completo, premere Salva nella &#34; Acquisisci immagine spettrale &#34; nella finestra di dialogo e &#34; nuova cella &#34; nella finestra di dialogo Gestione dati caso.</li>
		<li>Da the CDM, aprire l'immagine raccolto utilizzando il pulsante di analisi di inizio. Verrà aperta la finestra di analisi di dati.</li>
		<li>Spectral informazioni possono essere raccolti da ogni pixel dell'immagine selezionando ROIs utilizzando la finestra di dialogo visualizzazione spettrale. Scegliere &#34; definire &#34; e selezionare ROIs dalle pertinenti aree dell'immagine.</li>
		<li>Salvare i dati spettrali come un file di testo utilizzando il pulsante di Lib. Il file salvato con estensione txt possa essere importato a qualsiasi software di analisi di scelta. Il file. SLB può essere utilizzato per l'analisi all'interno del software di analisi dati. I dati del cubo iperspettrali da tutta l'immagine possono anche essere esportati come un file raw, come &#34; strati come tif &#34;, o come &#34; strati in formato testo &#34; per applicazioni di analisi di dati e immagini utilizzando software esterni.</li>
	</ol></li> <li>Microscopia confocale Nota: il microscopio confocale è dotato di un laser sintonizzabile come la sorgente di eccitazione. Per tutti gli esperimenti di emissione di fluorescenza, impostare l'intensità del laser allo 0,2% (corrispondente a una potenza media di 3 µW), il foro stenopeico per 1 unità arioso, le dimensioni della cornice a 1.024 px x 1,024 px, la velocità di scansione come 7 e una media di oltre 16 scansioni e la profondità di bit come 8 bit (vedere < s Trong &gt; tabella materiali). Queste impostazioni devono essere regolati per ogni singolo sistema confocale, sorgente laser e tipo di campione.
	<ol><li>Per lo spettro di emissione, raccogliere i dati utilizzando la modalità di lambda e l'eccitazione mediante argon laser insieme a 488 nm. Raccogliere delle emissioni tra 503 e 687 nm utilizzando 22 canali nel rivelatore GASP a 32 canali. Impostare il guadagno a 755.</li>
		<li>Per ottenere immagini a singolo canale, utilizzare la smart impostata opzione. Per FITC (filtro verde), impostare il guadagno a 750 e per Alexa 535 (filtro rosso) impostare il guadagno a 845.</li>
		<li>Per raccogliere lo spettro di eccitazione con il laser sintonizzabile, uso di eccitazione con 1 nm passi tra 490 e 545 nm, mentre la raccolta delle emissioni tra il 551 e 586 nm. Impostare l'intensità del laser al 2% (corrispondente a una potenza media di 30 µW) e il guadagno a 774.</li>
		<li>Per raccogliere Z-stack in modalità spectral, scansione attraverso la profondità della sezione in passi di 0.96 µm. Le stesse impostazioni di eccitazione e di emissione come descritto al punto 3.2.1 possono essere utilizzate ma impostare il guadagno a 730.</li>
	</ol></li> <li>FLIM Nota: il microscopio confocale è dotato di un'unità FLIM (Vedi Tabella materiali).
	<ol><li>Impostare i seguenti parametri per il microscopio confocale: foro stenopeico, 20; lunghezza d'onda di eccitazione, 490 nm; intensità del laser, 0,5% (corrispondente a una potenza media di 7,5 µW). Utilizzare il laser pulsato a 40 MHz.</li>
		<li>Software in the FLIM, impostare fotone contando oltre 550 nm. Nella finestra parametri, seguire il fotone contando fino a quando il Conte Max è circa 4.000 fotone conteggi.</li>
		<li>Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC.</li>
		<li>Adattare i dati a un decadimento esponenziale di 2 componenti del software di FLIM. Una misura che dà un χ 2 &#60; 2 è buona. Il valore sull'asse y è il numero di conteggi per la durata specificata.</li>
		<li>Selezionare una soglia per conteggi includere, ad esempio, 100. Codice di T1 colore e selezionare intervallo di durata. Il decadimento è dipendono dalla struttura dell'amiloide dove è associato il hFTAA. I corsi della vita di fluorescenza tra 300 e 1.000 ps sono stati osservati. Salvare il file.</li>
		<li>Esportare i dati non elaborati utilizzando le opzioni di esportazione e salvare i dati desiderati in una nuova cartella.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+proteins+and+amyloidosis%3A+chemical+identification+and+clinical+classification+International+Society+of+Amyloidosis+2016+Nomenclature+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines.</a> Amyloid. 23, 209-213 (2016).</li>
<li>Buxbaum, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+amyloidoses%3A+are+transgenic+mice+worth+the+time+and+trouble%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?</a> FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).</li>
<li>Hall, A. M., Roberson, E. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3546481/">Mouse models of Alzheimer's disease.</a> Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).</li>
<li>Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+methods+for+identification+of+amyloid+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Staining methods for identification of amyloid in tissue.</a> Methods in enzymology. , 3-25 (1999).</li>
<li>Klingstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+library+of+oligothiophenes+and+their+utilization+as+fluorescent+ligands+for+spectral+assignment+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates.</a> Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).</li>
<li>Klingstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+conjugated+oligothiophenes+for+sensitive+fluorescent+assignment+of+protein+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies.</a> Chembiochem. 14, 607-616 (2013).</li>
<li>Sjolander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+fluorescent+amyloid+ligand+h-FTAA+for+studying+human+tissues+with+systemic+and+localized+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid.</a> Amyloid. 23, 98-108 (2016).</li>
<li>Magnusson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fluorescence+microscopy+of+prion+strain+specific+PrP+deposits+stained+by+thiophene-based+amyloid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands.</a> Prion. 8, 319-329 (2014).</li>
<li>Radde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42-driven+cerebral+amyloidosis+in+transgenic+mice+reveals+early+and+robust+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology.</a> EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).</li>
<li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).</li>
<li>Nystrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+age-dependent+in+vivo+conformational+rearrangement+within+Abeta+amyloid+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits.</a> ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).</li>
<li>Aslund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pentameric+thiophene+derivatives+for+in+vitro+and+in+vivo+optical+imaging+of+a+plethora+of+protein+aggregates+in+cerebral+amyloidoses%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses.</a> ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).</li>
<li>Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+polyelectrolytes%3A+conformation-sensitive+optical+probes+for+detection+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation.</a> Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).</li>
<li>Mahajan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+beta-sheet+conformation+of+keratin+8+is+a+specific+feature+of+Mallory-Denk+bodies+compared+with+other+hepatocyte+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions.</a> Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).</li>
<li>Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+assessment+of+amyloid+by+oligothiophene+fluorescence+in+subcutaneous+fat+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue.</a> Amyloid. 22, 19-25 (2015).</li>
<li>Arja, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescent+assignment+of+protein+aggregates+by+an+oligothiophene-porphyrin-based+amyloid+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand.</a> Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).</li>
<li>Psonka-Antonczyk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Structure+and+Spectroscopic+Probing+of+Abeta1-40+Fibril+Bundle+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation.</a> Front Chem. 4, 44(2016).</li>
<li>Herrmann, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+drug+design+identifies+polythiophenes+as+antiprion+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds.</a> Sci Transl Med. 7, 299ra123(2015).</li>
<li>Schutz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201008276/abstract">The amyloid-Congo red interface at atomic resolution.</a> Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).</li>
<li>Hammarstrom, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+pentameric+thiophene+derivative+detects+in+vitro-formed+prefibrillar+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates.</a> Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).</li>
<li>CORDIS. <a target="_blank" href="http://cordis.europa.eu/publication/rcn/15792_en.html">Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures)</a>. , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).</li>
<li>Hahn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+and+validating+the+fluorescent+amyloid+ligand+h-FTAA+%28heptamer+formyl+thiophene+acetic+acid%29+to+identify+transthyretin+amyloid+deposits+in+carpal+tunnel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome.</a> Amyloid. , 1-9 (2017).</li>
<li>Johansson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+azide+functionalized+oligothiophene+ligand--a+versatile+tool+for+multimodal+detection+of+disease+associated+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates.</a> Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).</li>
<li>Nordeman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2811%29C+and+%2818%29F+Radiolabeling+of+Tetra-+and+Pentathiophenes+as+PET-Ligands+for+Amyloid+Protein+Aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">(11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates.</a> ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).</li>
</ol>

PH PN MB SN sono azionisti minori in Ebba Biotech che commercializza hFTAA sotto il marchio Amytracker545.

Deposizione di proteine aberrante piegati in amiloide è un evento chiave di molti processi di malattia. Placche di amiloide extracellulare costituito da peptidi Aβ e grovigli neurofibrillari intracellulari formati da tau iperfosforilata sono trovati nel cervello di pazienti con malattia di Alzheimer. Una gamma di differenti proteine, ad esempio, transtiretina (TTR), componente del siero amiloide A (SAA) e misfold catena chiara IgG e manifesto come depositi di amiloide nei tessuti di fuori del sistema nervoso centrale. Anche se mancano di amiloide depositi sono stati conosciuti e studiati per oltre un secolo, abbiamo ancora una conoscenza dettagliata di come amiloide deposizione è avviata a livello molecolare e che cosa può essere fatto per impedire questo processo. Per il morbo di Alzheimer, è necessario confermare come il processo di amyloidosis è associato con il neurodegeneration. Una missione chiave sulla missione per curare amiloidosi è sviluppare romanzo messo a punto strumenti per il monitoraggio dell'amiloide inizio, progressione e regressione; quindi mirata rilevazione dell'amiloide è chiave. Diagnostica clinica potranno a lungo termine, aumentando la sensibilità e la selettività dell'amiloide colorazione metodi7,15. Attuali sfide a questo proposito sono tremendi ed sono un'area di ricerca molto attivo. Un problema principale per lo sviluppo clinico e le prove è diagnosi prognostica. Queste malattie probabile iniziare ben prima che i sintomi compaiono, ma per iniziare con trattamento ci deve essere l'identificazione della malattia. Nel presente documento, la sensibilità è un aspetto fondamentale per nuove metodologie. Inoltre, questo problema è ancora più complesso perché alcuni aggregati proteici sono tossici, alcuni sono protettivi, e alcuni sono neutri. Quindi la possibilità di monitorare specifici aggregati morfotipi è essenziale dal momento che l'esistenza di specie distinte di aggregati è stato suggerito per spiegare il fenotipo eterogeneo segnalato per una varietà di malattie neurodegenerative proteina aggregazione. Per esempio, la proteina prionica è un classico esempio di come una sequenza identica primaria degli aminoacidi possa aggregarsi in distinti morfotipi di aggregazione, che danno luogo a ceppi specifici da prioni. Polimorfismo simile inoltre è stato segnalato per il peptide Aβ, α-synuclein e tau. A questo proposito, LCOs hanno dimostrato di essere strumenti eccezionali per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti. Proteina prionica-ceppo-specifici aggregati, depositi di proteine trovati in parecchi tipi di amiloidosi sistemica, come pure Aβ polimorfico e aggregati di tau sono stati distinti a causa del fenomeno ottico conformazionalmente indotto osservato dal LCOs.
Deposito dell'amiloide è un evento che si svolge nei tessuti che sono difficili da penetrare con metodi biochimici o biofisici di precisione molecolare. La possibilità di sondare eventi ex vivo, in vivoe in vitro usando le stesse molecole LCO pone le basi per unraveling con eventi che si verificano in vivo usando le tecniche che sono solo possibile applicare su ex vivo o in vitro campioni11,17. Un modello strutturale recentemente segnalati ad alta risoluzione mostra che il pentamerica LCO Alca (pFTAA) lega in una cavità formata da catene laterali paralleli con l'asse della fibrilla che attraversa 6 a registro parallelo beta-fili18, dimostrando che è possibilità di acquisire conoscenze di risoluzione atomica relative alle entità del target LCO. In sostanza la modalità di associazione di cavità e l'associazione di pFTAA è simile a colore rosso di Congo19, dettata da una scanalatura fiancheggiata da ripetitivi positivo carica Lys-catene laterali. L'affinità di LCOs sembrano essere migliore rispetto al rosso Congo probabilmente grazie alla catena di flessibilità e forti interazioni di van der Waals degli atomi dello zolfo degli anelli tiofene verso la cavità idrofobica. La rilevazione di specie prefibrillar (prima risponde ThT)5,20 appare dipenda su fogli β ripetitivo, composti nel registro parallelo-beta-fili, che per hFTAA essere due unità di tiofene più di pFTAA sarebbe intervallo di attraversamento di fino a 8 beta-fili.
Il protocollo di colorazione richiede prestando attenzione alla risoluzione dei problemi presso i seguenti passaggi: (i) fissazione: vasta fissazione dei campioni di tessuto possa alterare la struttura dell'amiloide e limitare la possibilità di rilevare la variazione negli spettri di fluorescenza indotti da distorsione conformazionale della molecola hFTAA. La fissazione mite di cryosections da materiale fresco congelato è preferita per ottenere una ottimale risoluzione spettrale. Tuttavia, hFTAA si macchia e reagiscono in amiloide nel tessuto fisso ma con efficacia ridotta e meno variazione spettrale. (ii) epitopo esposizione: pretrattamento del tessuto per ottenere l'esposizione epitopo per il grippaggio dell'anticorpo occasionalmente potrebbe ridurre la capacità per hFTAA da associare a causa delle perturbato struttura dell'amiloide. Se si tratta di un problema, e l'esposizione di epitopo è un passo cruciale nell'anticorpo che macchia protocollo, utilizzando sezioni consecutive per l'anticorpo e hFTAA, rispettivamente può essere considerato. (iii) overstaining: hFTAA è estremamente sensibile. Soluzioni di lavoro dovrebbero essere tenuti a concentrazione bassa nM. Diminuire la concentrazione di hFTAA se la colorazione di fondo è un problema. Se gli elementi che legano hFTAA sono sparsi nel tessuto, un eccesso di hFTAA può aggregare e si accumulano nel mezzo di montaggio. Questo è riconosciuto come la fluorescenza che non è sul piano di messa a fuoco del tessuto stesso. Se questo appare, immergere il vetrino montato in PBS finché il coprioggetto può essere fatto scorrere della sezione, lavate con PBS e rimontare con mezzo di montaggio fresco e un nuovo slittamento del coperchio. (iv) filtro basato su formazione immagine: questo articolo descrive l'imaging di fluorescenza principalmente spettralmente risolte utilizzando filtri di passaggio lungo o più canali di rilevazione. hFTAA può anche essere controllata utilizzando filtri di passaggio corto. Si prega di essere consapevole che questo ridurrà il contrasto e abolire le possibilità per rilevare i colori multipli.
Negli ultimi anni è diventato evidente che come la ricerca di strumenti, LCOs fluorescente e in particolare hFTAA mostrano proprietà altamente promettente. Risultati sono stati dimostrati per una vasta varietà di proteine e Stati di malattia, che vanno dal rilevamento di hFTAA degli aggregati all'interno delle cellule (tau, miosite), amiloide sistematico di amiloide A del siero, transtiretina, catene chiare dell'immunoglobulina (kappa e lambda) seminogelin 1, prion protein (compresi i campioni clinici)21, polipeptide amiloide dell'isolotto e insulina7,15. Un fattore limitante per l'implementazione di hFTAA come strumento diagnostico è che quello microscopia di fluorescenza non è ampiamente utilizzato nei laboratori di patologia sistematica dell'amiloide. Inoltre, la sua non è prontamente disponibile in clinica. Tuttavia, hFTAA la macchiatura dell'amiloide e microscopia di fluorescenza sono stati utilizzati in laboratori clinici in un microscopio a fluorescenza base filtro e dovrebbeessere considerato come un metodo diagnostico gratuito. Questo è stato recentemente dimostrato sulle biopsie del tunnel carpale con amyloidosis di transthyretin utilizzando le impostazioni di base per fluorescenza in un modo automatizzato22.
Inoltre, oltre a varie proteine, hFTAA fluorescenza riconosce una grande varietà di tipi di fibrille e pre-fibrillari aggregati amiloidi, ad esempio, specie fibrillari via sono stati rilevati e caratterizzati. In questa pubblicazione, abbiamo dimostrato una LCO su vari tipi di campione utilizzando tre tecniche di microscopia. L'utilizzo di sintesi controllata ha permesso anche per lo sviluppo di LCOs per versatile rilevamento di target biomolecolari, ad esempio, registrazione delle interazioni di surface plasmon resonance (SPR)23 e radiolabeling per emissione di positroni di positroni (PET)24.
Ad oggi, sono stati pubblicati oltre 25 diverse LCOs con. Un maggiore uso di LCOs per l'imaging dei giacimenti di amiloide aumenterà la conoscenza e la comprensione di come questi aggregati di malattia-collegati montare, smontare e interferiscano con gli organi e gli individui in cui risiedono.

Deposizione di amiloide nel tessuto è un marchio di garanzia patologico in un numero malattie come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, amiloidosi sistemica e malattie da prioni. Nonostante la prevalenza di malattie amiloide-relativi e il fatto che quasi 40 diverse proteine fino ad oggi sono stati classificati come precursori dell'amiloide in umano1, piccolo è conosciuto circa la relazione tra il deposito dell'amiloide e il fenotipo della malattia. L'istologia dei campioni provenienti da pazienti umani è stato utilizzato sia per scopi diagnostici e scientifici. Un gran numero di modelli animali è stato istituito per studiare la correlazione tra onere dell'amiloide e comportamento, durata e un numero di altri lettura fenotipica outs di malattia progressione2,3. Grandi sforzi si fanno anche nel design per combattere alcuni dei nostri più temute malattie diffuse e scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, la valutazione del legame tra genotipo, fenotipo, carico della placca dell'amiloide e l'amministrazione di droga non è dritto in avanti. Gli strumenti per la colorazione e di imaging di amiloide nel tessuto hanno smussati e forniscono informazioni di bassa risoluzione sulla struttura e sulla formazione dell'amiloide.
Rosso Congo birifrangenza, ThT e ThS fluorescenza sono esempi di metodi classici per la rilevazione e l'analisi degli oneri dell'amiloide nei campioni di tessuto da biopsie di pazienti e post mortem campioni e modelli animali di malattia4. Queste tecniche sono state utilizzate per decenni (colore rosso di Congo dal 1920 e ThT e derivati dal 1960), e anche se la strumentazione è stata perfezionata e permette un'analisi dettagliata, ancora vengono eseguite le procedure di colorazione e analisi allo stesso modo come quasi un secolo fa.
In questo articolo, descriviamo l'utilizzo di un colorante di amiloide romanzo altamente sensibile, hFTAA5, che consente il rilevamento dei depositi di piccola proteina immaturo con alta precisione, come pure la rilevazione di amiloide maturo. Rispetto ai coloranti convenzionali, è stato dimostrato per rilevare una gamma più ampia di malattia associata proteina aggregati5,6,7hFTAA. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi aggregati distinti8. Qui, descriviamo la macchiatura di hFTAA e l'analisi del tessuto da affermati modelli animali di malattia da prioni e β-amiloide Precursor Protein (APP) topi transgenici progettata per imitare lo sviluppo della placca nella malattia di Alzheimer9,10 . Mostriamo anche analisi di diagnostica e post mortem campioni da pazienti affetti da amiloidosi sistemica. La LCOs hanno proprietà intrinseche che consente loro di riferire sulle differenze conformazionali all'interno di una placca; e combinando due LCOs con caratteristiche diverse per quanto riguarda l'associazione e fluorescenza, la differenza è ancora più pronunciata11. Un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri di passaggio lungo e una testa di macchina fotografica iperspettrale viene utilizzata per consentire la classificazione oggettiva delle proprietà spettrali e la registrazione delle micrografie per analisi spettrale. Microscopia di fluorescenza confocale con un laser sintonizzabile come la sorgente di eccitazione viene utilizzata per valutare le proprietà tridimensionale di una placca amiloide in maggiore dettaglio. Il laser sintonizzabile consente la raccolta di spettro di eccitazione e un passo meno selezione delle lunghezze d'onda di emissione il microscopio permette di co-formazione immagine di fluorescenza LCO e immunofluorescenza per determinare co-localizzazione della proteina dell'obiettivo e dell'amiloide. FLIM offre inedita sensibilità alle differenze conformazionali inflitta la LCOs e rivela differenze che potrebbero non essere rilevate sullo spettro di emissione di fluorescenza.
Gli obiettivi principali con il metodo di colorazione descritto sono di facilitare la rivelazione sensibile di piccoli depositi di amiloide e di caratterizzare polimorfismo conformazionale all'interno di depositi di amiloide. Questa conoscenza è importante per la comprensione di base di malattie di aggregazione di proteine.

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio per fluorescena Dako</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>LeicaDM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Sistema</td> Spectraview precedente <td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td>spettrale ASI</td></tr><tr><td>Software Spectraview</td><td>Imaging</td> <td>spettrale ASI</td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2010b v6.0 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM sistema</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser sintonizzabile in sintonia</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza lifetime imaging

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Proteine che al deposito dell'amiloide in tessuti in tutto il corpo può essere la causa o la conseguenza di un gran numero di malattie. Tra questi troviamo le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e di Parkinson che affligge principalmente il sistema nervoso centrale e amiloidosi sistemica come amiloide nel fegato, carpale dove depositare i amiloide A del siero, transthyretin e catene chiare di IgG tunnel, milza, rene, cuore e altri tessuti periferici. Amiloide è stato conosciuto e studiato per più di un secolo, spesso utilizzando coloranti specifici dell'amiloide come colore rosso di Congo e Tioflavina T (ThT) o Thioflavin (ThS). In questa carta, presentiamo heptamer-formile tiofene acido acetico (hFTAA) come esempio di complementi recentemente sviluppati per questi coloranti chiamati luminescenti oligotiofeni coniugati (LCOs). hFTAA è facile da usare ed è compatibile con la co-macchiatura in immunofluorescenza o con altri markers cellulari. Approfondite ricerche ha dimostrato che hFTAA rileva una vasta gamma di aggregati proteici di malattia associata che convenzionale coloranti dell'amiloide. Inoltre, hFTAA può anche applicarsi per assegnazione ottico di morfotipi distinti aggregati per consentire studi di polimorfismo della fibrilla dell'amiloide. Mentre la metodologia di formazione immagine applicata è facoltativa, abbiamo qui dimostrano l'imaging iperspettrale (HIS), microscopia confocale e durata di fluorescenza (FLIM) di imaging laser. Questi esempi mostrano alcune delle tecniche di imaging dove LCOs possono essere utilizzati come strumenti per acquisire una conoscenza più dettagliata della formazione e proprietà strutturali di amiloidi. Una limitazione importante alla tecnica è, come per tutte le tecniche di microscopia ottica convenzionale, il requisito di dimensioni microscopiche di aggregati per consentire il rilevamento. Inoltre, l'aggregato dovrebbe comprendere una struttura ripetitiva di β-foglio per consentire per l'associazione hFTAA. Eccessiva esposizione di fissazione e/o epitopo che modificano la struttura aggregata o conformazione può render poveri hFTAA associazione e quindi porre limitazioni all'accurato imaging.

Sensibile e selettiva la colorazione dei depositi di amiloide da un gran numero di proteine in molti diversi tipi di tessuto da pazienti umani e animali da esperimento è vitale per la diagnostica clinica così come nella ricerca scientifica. In questa carta, dimostriamo come questo può essere raggiunto utilizzando LCOs, esemplificato dal hFTAA, per la colorazione e imaging multimodale di amiloide da una selezione di tipi di tessuto. Sin dalla prima pubblicazione di tiofene-basato dell'amiloide ligandi più di dieci anni fa13, amiloide depositi composti da un'ampia gamma di proteine in una varietà di tessuti sono stati Imaging utilizzando LCOs6,7,11, 14,15,16 (Figura 1). In combinazione con anticorpi o altri marcatori istologici, la LCOs fornire ottimi strumenti per scopi diagnostici sia scientifici (Figura 1a, Figura 2). Con un'appropriata selezione dei marcatori fluorescenti, fluorofori diversi possono essere imaged sulla stessa sezione (Figura 1a, hFTAA e DAPI, Figura 2a hFTAA nel setup di immunofluorescenza). È anche possibile utilizzare sezioni consecutive per la macchiatura utilizzando il campo chiaro e fluorescenza (Figura 2b, hFTAA e DAB macchiatura dell'anticorpo). Recentemente, hFTAA ha dimostrato di essere un complemento molto promettente al rosso Congo colorazione diagnostica clinica7,15 (Figura 3).
Sviluppo di tecniche di imaging negli ultimi decenni ha aumentato la necessità di amiloide coloranti che possono discriminare tra minuti, ma le stesse differenze di tempo profonda in depositi di amiloide in maniera quantitativa. Il sistema coniugato all'interno il LCO fornisce una capacità unica di relazione sulla variazione nella sua modalità di associazione. Torsione della molecola può condurre ad una distorsione negli angoli associazione nel sistema coniugato e ostacolare il trasporto di elettroni (Figura 4a). Questo a sua volta riflette sulle proprietà fluorescenti di LCO durata di emissione sia in lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione. Usiamo la sua in un microscopio a fluorescenza verticale dotato di filtri di passaggio lungo per l'emissione. Per eccitazione e spettri di emissione in microscopia confocale e FLIM, usiamo un LSM780 con laser pulsato. Per esemplificare le diverse tecniche, abbiamo ripreso un oggetto (la placca beta amiloide (Aβ) in un topo transgenico APP) (Figura 4b–e). Spettri di fluorescenza iperspettrale (Figura 4b) consente la valutazione di shift spettrali e variazione di intensità all'interno di diverse regioni della placca. Spettro di eccitazione in microscopia confocale (Figura 4c) può essere utilizzato per determinare la lunghezza d'onda di eccitazione ottimale per esperimenti a valle, ad es., combinazione di macchiatura con diversi fluorofori. Questo metodo può rivelarsi utile per il rilevamento delle differenze conformazionali nella modalità di associazione del LCO. Spettro di emissione nella modalità confocale può essere utilizzato per determinare le proprietà di emissione di fluorescenza da hFTAA o da una combinazione di diversi fluorofori per valutare colocalizzazione negli esperimenti di combinazione con diversi LCOs o LCO e immunofluorescenza combinazioni. La durata di fluorescenza di hFTAA è fortemente influenzata da piccole variazioni nella modalità di associazione di hFTAA. Quindi FLIM è uno strumento potente nel discriminare tra le differenze imposte hFTAA dalla destinazione dell'associazione (Figura 4D). Questo consente ad esempio la discriminazione tra prionica diversi ceppi8. Imaging confocale e trasformazione Z-stack in immagini tridimensionali è uno strumento utile per esplorare la forma complessiva di un'aggregazione amiloide (Figura 4e). Ancora una volta, l'uso di ulteriori fluorofori possa aiutare a comprendere la composizione di un deposito.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg"> 
Figura 1: vari tipi e proteine aggregati tessuto risultati h-Alca macchiatura di: (una) Mallory-Denk corpi costituiti da aggregati di cheratina in un fegato (controcolorati con DAPI), inclusioni p62-positivo r (b) in sporadici corpo di inclusione miosite (s-IBM) tessuto muscolare, (c), amiloide del polipeptide amiloide isolotto nel pancreas umano, del cervello (d), della catena chiara dell'amiloide di immunoglobulina nell'intestino umano, (e), Sheep scrapie (prioni) nel topo, (f ) Cronica malattia (prioni) nel cervello di topo, (g), Aβ placche nel cervello di topo di APP23, di spreco (h), Aβ patologia nel cervello di topo APP/PS1 e la biopsia (io) grasso strisci da campioni diagnostici di amiloide da transtiretina nei pazienti umani graduata 1-4 secondo standard rosso Congo (CR) segnando. Aree gialle mostrano hFTAA macchiato i giacimenti di amiloide e blu è autofluorescence dal tessuto adiposo. La lunghezza della barra di scala è specificata in ogni pannello. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg"> 
Figura 2: esempi di co-macchiando con gli anticorpi. (un) Co-colorazione con anti-siero proteina dell'amiloide A (AA) immunofluorescenza e hFTAA di umano amiloide AA sulla stessa sezione. In alto a sinistra: AA anticorpo emissione 640 nm; hFTAA superiore destra a 488 nm; mascherina del pannello di fondo colocalizzazione di mostrare immagini in giallo. (b), dell'anticorpo che macchia e hFTAA fluorescenza su sezioni consecutive. Pannello superiore: AA anticorpo DAB macchiatura, pannello inferiore: hFTAA imaged con un filtro di emissione longpass. Barra della scala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg"> 
Figura 3: Confronto tra fluorescenza con filtri di passaggio corto transthyretin amiloide nel cuore umano macchiato ematossilina/Congo di Mayer rosso (un–d) con ematossilina/hFTAA di Mayer (e). (un) campo chiaro immagine, (b), campo chiaro, fluorescenza, (c), campo chiaro + polarizzatori incrociati, (d), campo chiaro + fluorescenza + polarizzatori incrociati, (e) hFTAA fluorescenza nel 405Nm + eccitazione di 480 nm (sezioni consecutive ad un–d). Barra della scala: 100 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg"> 
Figura 4: lo stesso oggetto macchiato con hFTAA ed imaged con diverse tecniche è dimostrato utilizzando una piastra Aβ in un topo invecchiato di APP23. (un) la fluorescenza proprietà di hFTAA è dettato dal suo stato conformazionale. Struttura di hFTAA nello stato di planare e contorto è mostrata. (b) Hyperspectral imaging per la valutazione dello spettro di emissione continuo. Spettri nel pannello inferiore sono colore codificato secondo "in box" regioni di interesse nell'immagine. (c) (i) confocale imaging per l'imaging di eccitazione e spettro (ii e iii) e formazione immagine dell'emissione in modalità filtro o spettrale (iv). (d), fluorescenza formazione immagine di corso della vita per il rilevamento delle differenze conformazionali di amiloide, dove durate più brevi si trovano nella periferia della placca Aβ e i tempi di vita sono più al centro della placca. Istogramma nel pannello inferiore mostra la distribuzione dei tempi di vita per l'intera placca. L'immagine è di colore secondo la scala sotto l'istogramma. (e) dello stack Z confocale raccolti in modalità di filtro per visualizzare la struttura tridimensionale di oggetti. La lunghezza della barra di scala è specificata in ogni pannello. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Deposito dell'amiloide è un segno distintivo di diverse malattie e affligge molti organi diversi. Questo articolo descrive l'applicazione della fluorescenza luminescenti oligotiofenici coniugati macchiatura in combinazione con tecniche di microscopia di fluorescenza. Questo metodo di colorazione rappresenta un potente strumento per il rilevamento e l'esplorazione di aggregati proteici nelle configurazioni sia clinici che scientifici.

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

L'obiettivo generale di questo metodo è la rilevazione di depositi di aggregati proteici in contesti sia clinici che scientifici. Viene descritta la colorazione con acido eptaformil tiofen acetico e l'analisi di tessuti provenienti da modelli animali di malattia da prioni e malattia di Alzheimer. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo degli amiloidi, come la presenza di piccole quantità di aggregati proteici e le loro intrinseche variazioni conformazionali.Il vantaggio di questa tecnica è che è più selettiva e più sensibile rispetto ad altre tecniche convenzionali. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la diagnosi di varie malattie da malfolding proteico, grazie alla possibilità di personalizzare le sonde per la tecnica di visualizzazione desiderata. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontrano difficoltà perché hFTAA richiede una concentrazione di colorazione estremamente bassa.HFTAA presenta anche lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione più lunghe rispetto ai coloranti convenzionali. Preparare la soluzione dell'oligotiophene coniugato luminescente risospendendo l'hFTAA liofilizzato in idrossido di sodio due millimolare per ottenere una soluzione madre di un milligrammo per millilitro. Trasferire la soluzione madre in un vial di vetro e conservarla a quattro gradi Celsius.Se si utilizzano sezioni in paraffina fissate con formalina, desparaffinare in xilolo durante la notte. Nel giorno della colorazione, immergere le sezioni in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH2O e PBS per dieci minuti ciascuno. Successivamente, lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambiente.Mentre il tessuto si asciuga, preparare una soluzione lavorativa di hFTAA diluendo la soluzione madre di uno a 10.000 in PBS. Quando il tessuto è asciutto, aggiungere gocce della soluzione lavorativa di hFTAA su ciascuna sezione di tessuto in modo da coprirla completamente. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Risciacquare la soluzione di colorazione con 500 microlitri di PBS, quindi immergere il vetrino nel bagno di PBS per 10 minuti. Dopo aver lasciato asciugare la sezione in condizioni ambiente, montarla utilizzando un mezzo di montaggio fluorescente. Lasciare riposare il mezzo di montaggio per tutta la notte.Il rilevamento degli amiloidi può essere eseguito direttamente dopo il montaggio, o addirittura senza montaggio. Tuttavia, se l'obiettivo dell'esperimento è ottenere informazioni spettrali di alta qualità, è preferibile un'incubazione notturna. Aprire il software del microscopio, assegnare un nome al progetto, selezionare l'immagine spettrale e avviare l'acquisizione.Selezionare l'oggetto di interesse attraverso l'oculare utilizzando il filtro di eccitazione a 436 nanometri e deviare il percorso della luce verso la fotocamera. Nel gestore dati, selezionare il tipo di campione spettrale, etichettare il campione e premere acquisisci. Si aprirà la finestra di acquisizione.Nell'immagine spettrale, aprire il menu delle impostazioni, selezionare le proprietà di acquisizione e impostare l'intervallo spettrale da 460 a 700, la qualità della velocità alla massima velocità e il tipo di misurazione su filtri stretti per laser a gas. Chiudere la finestra di dialogo. Nel menu dell'immagine, selezionare visualizzazione completa in tempo reale.Nella barra delle icone, disattivare le frange. Selezionare una regione da acquisire e assicurarsi che il valore massimo della memoria sia inferiore a 800 megabyte. Impostare il tempo di esposizione a un valore che produca una luminosità totale dell'immagine compresa tra 1.000 e 3.000.Nella barra delle icone, premere la fotocamera colorata. L'acquisizione avrà inizio. Quando l'acquisizione dell'immagine è completa, premere salva nella finestra di dialogo acquisisci immagine spettrale e nuova cella nella finestra di dialogo gestore dati caso.Dal gestore dei dati del caso, aprire l'immagine raccolta utilizzando il pulsante avvia analisi. Si aprirà la finestra di analisi dei dati. Le informazioni spettrali possono essere raccolte da ciascun pixel dell'immagine selezionando aree di interesse (ROI) mediante la finestra di dialogo visualizzazione spettrale.Scegliere di definire e selezionare le ROI dalle aree rilevanti dell'immagine. Salvare i dati spettrali come file di testo utilizzando il pulsante Lib. Il file txt salvato può essere importato in qualsiasi software di analisi a scelta.Aprire il software del microscopio e iniziare configurando il microscopio confocale. Impostare l'intensità del laser al 0,2%, il pinhole a un'unità di Airy, la dimensione del fotogramma a 1.024 per 1.024 pixel, la velocità di scansione a sette con media su 16 scansioni e la profondità di bit a otto bit. Per raccogliere lo spettro di emissione, selezionare la modalità lambda e il laser al 488 nanometri.Raccogliere l'emissione tra 499 e 691 nanometri utilizzando 22 canali del rilevatore gasp a 32 canali. Impostare il guadagno a 755. Cliccare sul pulsante live e modificare la tavolozza in indicatore di intervallo, quindi regolare il guadagno in modo da evitare pixel sovraccarichi in rosso.Fare clic sul pulsante di arresto, quindi acquisire l'immagine con il pulsante di cattura. Per ottenere immagini a singolo canale, selezionare l'opzione di configurazione rapida. Selezionare FITC e Alexa 532.Selezionare la separazione lineare e applicarla. Regolare il guadagno in modo da evitare pixel sovraccarichi. Per FITC, impostare il guadagno a 693 e per Alexa 532, impostare il guadagno a 433 durante la modalità live.Fare clic sul pulsante di arresto, quindi acquisire l'immagine con il pulsante di scatto. Passare il microscopio alla modalità FLIM. Impostare il pinhole a 20, la lunghezza d'onda di eccitazione a 490 nanometri e l'intensità del laser al 0,5%. Utilizzare laser a impulsi a 40 megahertz.Nel software FLIM, impostare il conteggio dei fotoni a oltre 550 nanometri. Nella finestra dei parametri di visualizzazione, seguire il conteggio dei fotoni finché il valore massimo non raggiunge circa 4.000 conteggi di fotoni. Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC.Questa immagine mostra corpi di Mallory-Denk, costituiti da aggregati di cheratina negli epatociti epatici, contrastati con DAPI. Qui, le inclusioni positive per P62 sono mostrate nel tessuto muscolare scheletrico della miosite a corpi di inclusione sporadica. Questa immagine mostra un'inclusione amiloide del polipeptide amiloide dell'isola nel pancreas umano.Qui è mostrato un deposito di amiloide di catena leggera di immunoglobulina nell'intestino umano. Questa immagine mostra depositi di aggregati della proteina prionica del scrapie ovino nel cervello di topo. Qui sono mostrati aggregati della proteina prionica nel cervello di un topo infetto con la malattia da wasting cronica.Questa immagine mostra le placche di amiloide A-beta nel cervello del topo APP23. E questa immagine mostra la patologia da A-beta nel cervello del topo APP-PS1. Questi strisci di biopsia adiposa da campioni diagnostici di amiloidosi da transtiretina in pazienti umani sono stati classificati da uno a quattro secondo lo standard di valutazione con Rosso Congo.Le aree gialle mostrano depositi di amiloide della transtiretina marcati con hFTAA, e il blu è l'autofluorescenza del tessuto adiposo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di effettuare la colorazione a una concentrazione adeguatamente bassa. Ricordare inoltre di utilizzare filtri passa-alto per ottenere il massimo contrasto e per evitare l'autofluorescenza e la fluorescenza di fondo.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunofluorescenza, al fine di identificare la proteina aggregata e le proteine coaggregate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'amilosiodosi per esplorare le strutture degli aggregati proteici e ha permesso alla chimica organica di progettare nuovi sonde per questi bersagli. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la colorazione con LCO e di come effettuare l'analisi mediante diverse tecniche di imaging.

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Questo video descrive una tecnica per colorare gli amiloidi in sezioni di tessuto utilizzando un colorante oligotiofene coniugato luminescente - acido acetico eptamero-formil tiofene, o hFTAA - per l'imaging a fluorescenza. Gli amiloidi sono aggregati proteici anomali ricchi di fogli di β. La loro rilevazione in campioni di tessuto è utile nella diagnosi e nel trattamento delle malattie associate all'amiloide o delle proteinopatie.

Colorazione hFTAA dei depositi di amiloide: una tecnica per visualizzare le fibrille amiloidi utilizzando un colorante a base di oligotiofene per l'imaging a fluorescenza in sezioni di tessuto

Fonte: Nyström, S., et al., Imaging di tessuti amiloidi colorati con oligotiofeni coniugati luminescenti mediante microscopia confocale iperspettrale e imaging del tempo di vita della fluorescenza. J. Vis. Exp. (2017). Questo video mostra l'analisi delle strutture amiloidi con la microscopia a fluorescenza o FLIM, utilizzando il colorante hFTAA per rivelare nuclei compatti come blu/verde e periferie instabili come rosso/giallo in immagini codificate a colori, riflettendo l'organizzazione...

Analisi delle strutture amiloidi in una sezione di tessuto mediante microscopia a fluorescenza con imaging a vita

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.

Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

L'imaging a vita di fluorescenza monitora, quantifica e distingue le tendenze di aggregazione delle proteine nei modelli di malattia di C. elegans viventi, invecchiamento e stressati.

Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Lo sbiancamento iterativo spettrale estende la multiplexità (IBEX) si basa sulla tecnica IBEX di base aggiungendo il blocco dell'eparina per ridurre al minimo il legame non specifico e sfruttando il rilevamento spettrale con la miscelazione computazionale per sopprimere l'autofluorescenza. Questo approccio accelera l'acquisizione delle immagini riducendo al contempo le fonti di fondo, consentendo solide analisi proteomiche spaziali multi-round e ad alto parametro.

Imaging ad alto plex con microscopia confocale spettrale per ridurre al minimo la fluorescenza tissutale non specifica

Scopri la tecnica di imaging iperspettrale e FLIM per rilevare aggregati proteici amiloidi nei tessuti utilizzando oligotiofeni luminescenti coniugati. Questo metodo offre maggiore selettività e sensibilità rispetto alle tecniche convenzionali.

Imaging dellamiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging (Video) | JoVE Journal

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

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