각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

이 프로토콜의 전반적인 목표는 자연 세포외 기질에서 인간 각막 기질 세포와 신경 세포 사이의 세포 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 원추각막, 당뇨병성 각막병증 및 Fuchs' 이영양증과 같은 각막 질환 및 이영양증을 연구하도록 확장될 수 있습니다. 이 방법은 특정 각막 질환 또는 영양 이상증 동안 기질 신경 상호 작용의 기본 메커니즘과 결함을 식별함으로써 인간 각막 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 세포가 생체 내에서 실제 인간 각막 조직의 더 우수하고 정확한 모델을 제공하는 자체 세포 외 기질을 in vitro에서 분비할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 각막 질환 치료로 확장되는데, 세포 간 및 세포 외 기질 상호 작용의 평가가 각막 조직의 정확한 표현을 보장하고 보다 표적화된 약물 개발을 가능하게 하기 때문입니다. 이제 이 방법은 각막 신경 손상과 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 약물 스크리닝 및 개발과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 인간 각막 조직 샘플을 받으면 조직을 21.5제곱센티미터 접시에 담아 멸균된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 2밀리리터가 들어 있습니다. 각막 돔을 앞면이 보이도록 놓고 면도날을 45도 각도로 사용하여 상피층을 긁어냅니다.

다음으로 각막 돔을 뒤집어 뒤집어 기질의 내피를 철저히 긁어냅니다. DPBS로 기질 조직을 세척합니다. 기질 조각을 DPBS로 적신 상태로 유지하고 숫자 10 수술 날을 사용하여 기질 조직을 작은 조각으로 자릅니다.

멸균 겸자를 사용하여 기질 조각을 배지가 없는 T25 배양 플라스크로 옮깁니다. 외식식물이 섭씨 37도의 플라스크 바닥에 약 30-40분 동안 부착되도록 합니다. 기질 조직을 정밀하게 절단한 후 플라스크를 조심스럽게 인큐베이터로 옮깁니다.

30-40분 정도 소요한 다음 미디어를 천천히 추가하는 것이 중요합니다. 이 단계는 외식재의 완전한 부착을 허용하고 분리를 방지하는 데 중요합니다. 일단 부착되면 10%의 소 태아 혈청과 1%의 항생제-항진균제를 함유한 Eagle's Minimum Essential Medium을 외식식물을 방해하지 않고 플라스크에 천천히 첨가합니다.

플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 부드럽게 놓습니다. 세포가 플라스크에서 분리되어 이동하기 시작할 때까지 외식을 방해받지 않고 그대로 두십시오. 약 2-4주 후에 세포는 100% 합류점에 도달해야 합니다.

100% 합류 시 조직 배양 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 세척하여 세포를 통과시킵니다. 세포에 트립신을 첨가한 다음 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 5분 후, 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.

새로운 배지를 추가하여 단백질 분해를 중단하고 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 1000 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 새로운 배지에 현탁시킵니다.

세포 계수를 수행한 후, 추가 증식을 위해 T75 배양 플라스크의 6개 세포에 약 10배의 1배를 새로운 배지로 파종합니다. 3D 구조를 조립하려면 먼저 인간 각막 섬유아세포를 통과시키고 계수한 다음 0.4미크론 공극이 있는 폴리카보네이트 멤브레인 인서트에 6개의 HCF에 대해 약 10배의 시딩을 합니다. 구조체 상단에 1.5ml의 새 배지를 추가합니다.

그런 다음 동일한 매체 1.5ml를 각 구조체의 바닥에 또 다른 피펫으로 주입합니다. 24시간 후, 0.5밀리몰의 비타민 C가 보충된 1.5밀리리터의 미디엄을 각 구조체의 상단과 하단에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 3주 동안 배양하고 격일로 비타민 C가 함유된 신선한 배지를 추가합니다.

이것은 세포가 자신의 세포 외 기질을 분비하고 조립하도록 자극합니다. 3주 후, 이전에 조립된 3D 구조체 위에 있는 세 번째 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에 8배 10을 추가합니다. 이 단계에서 정확한 세포 수를 계산하고 세포 분화를 시작하기 전에 24시간을 허용하는 것이 중요합니다.

배양 24시간 후, 10%FBS와 10마이크로몰 레티노산이 함유된 EMEM 1.5ml로 세포를 자극하여 SH-SY5Y 세포 분화를 시작합니다. 그런 다음 비타민 C를 함유한 배지 1.5ml를 구조체 바닥에 추가합니다. 레티노산은 빛에 민감하므로 이 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.

5일 후 세포가 분화 단계에 도달하면 2개의 나노몰 BDNF와 1%의 항생제-항진균제를 포함하는 1.5ml의 무혈청 배지를 구조체 상단에 추가합니다. 신선한 비타민 C가 보충된 배지를 구조물 바닥에 추가합니다. 추가 분석을 위해 처리하기 전에 추가로 2일 동안 세포를 배양합니다.

이것은 폴리카보네이트 막과 그 위에 앉은 각막 기질 세포를 보여주는 3D 자체 조립 구조체의 고배율 투과 전자 현미경 이미지입니다. 이 이미지는 기질-신경 세포 배열을 나타내는 상단에 위치한 분화된 신경 세포를 보여줍니다. 이미지의 화살표는 신경 세포를 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 외식식물을 절단할 때 각막 조직을 항상 젖은 상태로 유지하고 수술 기구와 칼날을 멸균 상태로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자연 세포외 기질에서 인간 각막 기질 세포와 신경 세포 간의 세포 상호 작용을 조사하기 위해 이 체외 모델을 설정하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BDNF, 레티노산 및 수술용 칼날로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보호복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.