Name: 각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 인간 각막 기질 세포와 신경 세포의 상호작용을 자연적 세포외기질에서 연구하는 3차원 생체외 모델을 이용한 방법을. 이 기법은 각막 신경 손상과 재생에 대한 통찰을 제공하며 각막 질환 치료에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 우리의 진심으 감사 닥터 벤 파울러에 대 한 그의 기술 편 실험을 확장 하 고 싶습니다.

이 프로토콜은 오클라호마 보건 과학 센터의 대학/기관 검토 위원회 (IRB #4509)의 지침을 따릅니다. 프로토콜의 모든 부분 헬싱키의 선언의 신조를 만났다. 각 막 샘플 국가 개발 및 연구 연구소 (NDRI)와 오클라호마 라이온 스 안구 은행에서 얻은 했다.
1입니다. 1 차 셀의 격리
<ol><li>21.5 cm2 무 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 2 개 mL를 포함 하는 배양 접시에 조직 인간 각 막 조직 샘플을 접수 한 후, 전송 (1 x).</li>
	<li>긁 고 막 돔 얼굴 위로 배치 하 여 각 막 상피를 제거 합니다. 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 철저 하 게 45 ° 각도로 면도날을 사용 하 여 상피 층을 다쳤어요. 다음, 각 막 돔 얼굴 다운 플립 하 고 철저 하 게 완전 한 제거를 보장 하기 위해 45 ° 각도로 면도날으로 기질에서 endothelium을 다쳤어요. 워시 DPBS와 실질 조직.</li>
	<li>실질 조직 유지 하는 DPBS를 사용 하 여 모든 시간에 젖은 stromal 조각 10 외과 블레이드를 사용 하는 작은 조각으로 잘라. 미디어 (2 x 2 m m 조직 플라스 크 당 4 또는 5 조각) 없이 T25 문화 플라스 크에 소독 집게와 장소 stromal 조각을 선택 합니다.</li>
	<li>약 30-40 분 동안 37 ° C에서 플라스 크의 밑바닥에 explants 허용. 준수, 일단 천천히 추가 글의 최소 필수 매체 (EMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 포함 된 항생제/Antimycotic는 explants 방해 없이 플라스 크에.</li>
	<li>부드럽게 37 ° c, 5% CO2배양 기에 플라스 크를 배치 합니다. 세포 분리 시작 때까지 explants는 그대로 두고 플라스 크에서 마이그레이션. 약 2-4 주 후, 셀 100% 합류를 도달 한다. 100% 합류 시 조직 문화 미디어를 제거 하 여 세포를 통과 하 고 셀 DPBS 씻어.</li>
	<li>세포를 트립 신을 추가 하 고 37 ° c.에서 그들을 품 어 약 5 분 후 그들은 분리가 확인 가벼운 현미경에서 세포를 확인 하 고 신선한 미디어를 추가 하 여는 베이스를 중단.</li>
	<li>1000 x g.에서 원심 분리는 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게 제거에 대 한 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 중단 신선한 EMEM 셀 10% FBS 1% 항생제. 셀을 계산 하 고 씨앗 신선한 EMEM와 확장에 대 한 T75 문화 플라스 크에 약 1 x 106 셀 1% FBS 1% 항생제.</li>
</ol>2. 기본 HCFs 문화 및 3D 어셈블리 생성
<ol><li>3D 조립에서 구문을 explants 이전에 성장된 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic, 통로 및 수 HCFs.</li>
	<li>씨 약 1 x 106 셀/잘 신선한 EMEM의 1.5 mL 함께 3D 구조에서 0.4 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 막 삽입에 기본 HCFs의 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 구성의 상단에. 각 구조물의 하단에 같은 미디어의 또 다른 1.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 시드의 24 시간 후 문화 EMEM 셀 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic, 위에 추가 1.5 mL 및 각 구조물의 하단에 1.5 mL에 의해 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C) 자극.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 3 주 동안 인큐베이터에 문화를 유지 하 고 전체 연구 기간 동안 매일 신선한 미디어를 공급. 아니 더 통로 필요 합니다.</li>
</ol>3. 세포 분화 및 공동 문화
<ol><li>3 주 후, 8 x 103 셀/잘 이전 조립된 3D 상단 SH-SY5Y 인간 신경 세포의 10%를 포함 하는 EMEM의 포함 1.5 mL를 구성 하는 것을 추가 FBS, 1% 항생제/Antimycotic, 그리고 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)입니다.<ol>
<li>SH SY5Y 신경 세포 세포 분화를 시작 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 각 막 실질 세포의 위에 성장 하는 것을 허용 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EMEM 1 %FBS 및 10 µ M의 1.5 mL로 세포를 자극 하 여 SH SY5Y 세포 분화를 시작 구성 위에 Retinoic 산. 구성의 하단에는 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고 Retinoic 산 단계 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>5 일 동안이 차별화 미디어에 셀 문화를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 분화 단계에 도달, 1.5 mL 혈 청 자유로운 매체 포함 된 2 셀 전환 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF)와 1%의 nM 항생제/Antimycotic 구성의 상단에 추가 하 여 EMEM에 추가. 구성의 하단에는 EMEM 10% FBS 1% 항생제/Antimycotic 0.5 m m 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic 산 (비타민 C)의 1.5 mL를 추가 합니다. 참고 BDNF 단계 어둠 속에서 수행 되어야 합니다.</li>
	<li>표 1에 표시 된 대로 어떤 추가 분석에 대 한 처리 하기 전에 2 추가 일에 대 한 셀을 문화.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li>
<li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).</li>
<li>Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Cell+Models+for+Ophthalmic+Drug+Development+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).</li>
<li>Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+nerves+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal nerves in health and disease.</a> Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).</li>
<li>Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+denervation+of+the+rabbit+cornea+affects+epithelial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties.</a> Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).</li>
<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+corneal+tissue+model+with+epithelium%2C+stroma%2C+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation.</a> Biomaterials. 112, 1-9 (2017).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+morphological+and+biochemical+interconversion+of+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).</li>
<li>Griffith, L. G., Naughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+-+Current+challenges+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities.</a> Science. 295 (5557), (2002).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+organized+extracellular+matrix+deposition+by+ascorbic+acid-stimulated+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).</li>
<li>Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+tissue+engineering%3A+current+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Ocular tissue engineering: current and future directions.</a> J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).</li>
<li>Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stiffness+regulates+cellular+contraction+and+matrix+remodeling+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression.</a> J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).</li>
<li>Ruberti, J. W., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelude+to+corneal+tissue+engineering+-+gaining+control+of+collagen+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).</li>
<li>Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+fibrosis%3A+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human corneal fibrosis: an in vitro model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).</li>
<li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).</li>
<li>Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+3D+In+Vitro+Model+to+Accelerate+the+Development+of+Human+Therapies+against+Corneal+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes.</a> PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).</li>
<li>Karamichos, D., Hjortdal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratoconus%3A+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Keratoconus: tissue engineering and biomaterials.</a> J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).</li>
<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
<li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis%3A+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li>
<li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
<li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여러 연구 결과 각 막 질환의 더 나은 이해를 개발 하는 데 도움이 뿐만 아니라 수 치료를 발견 하는 다양 한 동물 모델 개발에 집중 되었습니다. 그러나, 이러한 연구에서 인 간에 게 중요 한 가치는 확인 되지는 않았습니다. 날짜 하려면, 다양 한 생체 외에서 모델 개발 고 널리 그들의 놀라운 임상 중요성으로 조사 되었습니다. 우리의 이전 설립 3 차원 생체 외에서 모델은 새로운 시스템을 크게 비전 연구에 의료 과학 발전에 기여 하 고 vivo에서 이벤트 생체 외에서28 업과의 뽀 얀 능력을 보여줍니다. , 29 , 30.이 프로토콜의 목표는이 체 외에 각 막 모델의 당뇨병 각, 원추 각 막과 같은 각 막 질병과 관련 된 합병증의 세포 및 분자 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있는...

인체 각 막에서는 가장 밀도가 innervated 조직입니다. 신경 터치, 고통, 온도, 다양 한 감각에 대 한 책임은 그리고 또한 상처 치유, 반사, 눈물 분 비5,,67및 생산에 필수적인 역할을 했습니다. 각 막, 실질 신경 줄기 limbal 총에서 발생 하 고 광선으로 주변 각 막 stroma를 입력 합니다. Stromal 신경 조직 콜라겐 lamellae 평행 이며, 그들은 더 작은 성숙기로 그들은 천박한 기질5,8쪽으로 진행으로 분기. 상피 층을 관통 하는 신경 섬유를 추가 하 고 따라서, 신경 분포 널리 퍼져 각 막 상피와 기질. 따라서, 신경 분포는 각 막의 건강 하 고 병에 걸린 상태에서 필수적인 역할을 하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 stromal 신경 상호 작용을 모방 하는 종류의 첫 번째 모델 소설 3 차원 생체 외에서 의 발전을 공개. 그것은 가장 설립, 잘 특징이 라인 신경 성장을 공부 하는 데 사용 중 SH-SY5Y 셀 라인이이 연구를 위해 사용 했다. SH SY5Y 셀 라인 두 기판 부착 (S 형) 생산 설명 되었으며 neuroblastic (N 형) 세포 transdifferentiation9를 받을 수 있습니다. 그 결과,이 셀 라인은 N 형 셀의 트리플 연속 subclone 선택에서 파생 된, 비록 그것은 또한 포함 retinoic 산 및 두뇌 파생 된 사용을 통해 신경 세포로 분화를 겪고 수 S 형 세포의 작은 수 科 요소9. 이 당뇨병 성 망막 증 (DM) 및 다른 눈 질병와 관련 된 각 막 합병증의 더 나은 이해로 이어질 수 있는 도구를 제공 합니다. 하 고 눈 질병을 가진 환자에서 신경 세포 배양과 관련 된 어려움 때문에이 3D 생체 외에서 모델 신경 상호 작용을 공부 하 고 각 막 stroma로 신호에 상당한 영향을 제공 합니다.
질병 상태는 종종 매우 큰 규모, 손상 된 삶의 질으로 이어지는 신체의 다양 한 조직 영향을. 눈 dystrophies는 종종 조직의 질병 및 시력의 손실 또는 심지어 영구적인 시력 상실을 리드와 관련 된 일반적인 합병증. 포괄적인 연구는 종종 질병 상태 뿐만 아니라 기저 세포 수준에서 효과의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 이러한 질병의 효과 연구, 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 조직 엔지니어링 응용 프로그램의 도움으로 개발 되었습니다. 각 막 조직 공학 응용 과학10,11,12,,1314, 다양 한 분야에 걸쳐 큰 관심을 얻고 있다 하지만 여전히 주요 제한 중 실제 응용 프로그램을 거부, 감염과 흉터10,11,12,,1314이식 각 막 등. 여러 연구를 성공적으로 개발 하 고 다양 한 생체 외에서 모델3,15,,1617,18, 설립 있다 19,20,21,22,23,,2425,26. 3 차원 생체 외에서 모델은 가장 유망한와 큰 과학적 관심의. 3D 모델은 더 나은 vivo에서 세포 및 생리 적 이벤트 섬유 증 중 중요 하 고 상처 치유15,27,,2829거울 알려져 있습니다. 이러한 생체 외에서 모델 각 막 합병증 등 다른 질병 상태를 치료에 새로운 치료 접근을 찾는 중요 한 역할을. 각 막 기능에 신경 분포의 중요 한 역할에도 불구 하 고 약간의 노력이 했다 각 막 조직 설계 구조2,3내 주변 신경 확산을 촉진. 그러나, 제안 된 3D 생체 외에서 셀 구조는 원하는 조직 기능을 달성 하기 위하여 대상 조직 모방.
당뇨병 각 신경 결함 때문에 여기서 설명 하는 모델에 대 한 명백한 응용 프로그램은, 인간의 생체 외에서 모델 Keratoconus와 Fuchs dystrophies 등 누릴 수 있는 다른 여러 각 막 질환 있다. 우리의 3D 모델이이 전망에서 나온다 고 약 납품을 평가 하기 위해 각 막 직물의 생체 외에서 표현 및 새로운 눈 약의 안전의 개발을 제안.

<table><tbody><tr><td>건강한 각막 조직</td><td>NDRI</td><td></td><td>안구 외상이나 전신 질환이 없는 기증자의 샘플</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 용액 (1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>멸균 집게</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter 집게</td></tr><tr><td>단일 가장자리 면도날</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 메스 칼날 No.10</td><td>Feather 수술용 칼날</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s 최소 필수 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>10% FBS는 미디어 준비에 필요합니다</td></tr>. <tr><td>Life</td> <td>Technologies</td><td>15240-062의 Gibco 15240-062</td><td>1% 항생제-항진균제는 미디어 준비에 필요합니다</td></tr><tr><td>. 0.05% Trypsin EDTA(1X)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0.4-&mu의 폴리카보네이트 멤브레인 인서트; m 모공</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>2-O-&alpha;-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SMB00390-14</td><td></td></tr><tr><td>왁스 블록</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y 신경모세포종 세포</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3014-10UG</td><td>10uM의 최종 농도를 사용해야</td></tr> 합니다 <tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td>2nM의 최종 농도를 사용해야</td></tr> 합니다 <tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Pure Grade-Sterile DMSO 사용</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 세포 배양 처리 EasYFlasks (T25)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 세포 배양 처리된 EasYFlasks (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

조직 공학 인간 각 막 교체 각 막 시력 손실1에서 고통을 전세계 약 10 백만 명에 대 한 높은 수요로 인해 상당한 인정을 받고 있다. 가능한 인간 각, 3 차원 (3D) 조직에 중요 한 진행에 대 한 수요를 해결 하기 위해 공학이 했다2,,34. 이러한 각 막 모델 에서부터 간단한 단층 시스템 3D 전체 두께 각 막 등가물2로 이어지는 다층된 모델.
그러나, 생체 외에서 질병 모델의 맥락에서 3 차원 조직 설계 각 막의 사용 날짜 부족 유사 다층된 3 차원 각 막 조직 구조, 기능, 및 서로 다른 세포 유형 (즉, 신경, 네트워킹을 공부 상피와 기질, 내 피)2,3. 또한, 생체 외에서 각 막 조직 모델에 대 한 수요는 제약 제품에 대 한 동물 실험을 줄이기 위해 시도에서 증가 했다. 따라서, 더 정교한 모델은 인간의 생리 적 요구 사항, 시스템 일치 하는 데 필요한 그리고 더 환자 인구에 관련 된 모델의 개발은 절대적으로 필요 하다. 각 막에 여러 세포 유형 영향을 받는 질환과 dystrophies Keratoconus, 당뇨병 각 Fuchs, 등을이 모델에 포함 된 기본 인간 각 막 섬유 아 세포 (HCFs) 건강 한 기증자와에서 뉴런에서의 3D 공동 문화 모델 SH SY5Y 셀 라인입니다. 인간의 각 막 조직 내에서 2 개의 세포 유형 사이 상호 작용을 조사 하기 위해 처음으로 수 있습니다. 우리는이 모델 잠재적으로 관련 된 신경 손상 하는 각 막 질환의 신경 기질 상호 작용 하는 근본적인 메커니즘을 해 부 수 믿습니다. 이 3D 모델 vivo에서 각 막 직물의 기본 해 부 및 생리 적 특성을 반영 하 고 수 도구로 사용 될 미래에는 각 막 결함 조사로 동물 테스트 하기 전에 다양 한 에이전트의 효능을 심사.

그림 1 은 작업 모델 3D 생체 외에서 단계별 대표 이미지입니다. 첫 번째 단계에서 세포 인간 각 막에서 격리 됩니다. 다음, 그들은 폴 리카 보 네이트 막에 성장 하 고 자기 secreted 3 차원 매트릭스를 비타민 C와 자극. 이 3D 구조 시스템 유도는 다층 세포 vivo에서의 합성-stromal 매트릭스 처럼. 그 후, 신경 세포는 신경 세포 분화를 시작 하 여 뒤 stromal 세포 위에 시드. 이것은 각 막 실질 세포와 3 차원 생체 외에서 모델에 차별화 된 신경 세포의 공동 문화. 그림 2 의 3D 자체 조립된 구조 (그림 2A) 폴 리카 보 네이트 막 보여주는 높은 확대 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지 이며 각 막 실질 세포 은닉 자체 조립된 ...

이 프로토콜에는 새로운 3 차원 생체 외에서 모델을, 어디 각 막 실질 세포와 분화 된 신경 세포 교양 함께 시험에는 두 종류의 세포 상호 작용의 이해를 돕기 위해 설명 합니다.

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 자연 세포외 기질에서 인간 각막 기질 세포와 신경 세포 사이의 세포 상호 작용을 조사하는 것입니다. 이 프로토콜은 원추각막, 당뇨병성 각막병증 및 Fuchs' 이영양증과 같은 각막 질환 및 이영양증을 연구하도록 확장될 수 있습니다. 이 방법은 특정 각막 질환 또는 영양 이상증 동안 기질 신경 상호 작용의 기본 메커니즘과 결함을 식별함으로써 인간 각막 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 세포가 생체 내에서 실제 인간 각막 조직의 더 우수하고 정확한 모델을 제공하는 자체 세포 외 기질을 in vitro에서 분비할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 각막 질환 치료로 확장되는데, 세포 간 및 세포 외 기질 상호 작용의 평가가 각막 조직의 정확한 표현을 보장하고 보다 표적화된 약물 개발을 가능하게 하기 때문입니다. 이제 이 방법은 각막 신경 손상과 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 약물 스크리닝 및 개발과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 인간 각막 조직 샘플을 받으면 조직을 21.5제곱센티미터 접시에 담아 멸균된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 2밀리리터가 들어 있습니다. 각막 돔을 앞면이 보이도록 놓고 면도날을 45도 각도로 사용하여 상피층을 긁어냅니다.다음으로 각막 돔을 뒤집어 뒤집어 기질의 내피를 철저히 긁어냅니다. DPBS로 기질 조직을 세척합니다. 기질 조각을 DPBS로 적신 상태로 유지하고 숫자 10 수술 날을 사용하여 기질 조직을 작은 조각으로 자릅니다.멸균 겸자를 사용하여 기질 조각을 배지가 없는 T25 배양 플라스크로 옮깁니다. 외식식물이 섭씨 37도의 플라스크 바닥에 약 30-40분 동안 부착되도록 합니다. 기질 조직을 정밀하게 절단한 후 플라스크를 조심스럽게 인큐베이터로 옮깁니다.30-40분 정도 소요한 다음 미디어를 천천히 추가하는 것이 중요합니다. 이 단계는 외식재의 완전한 부착을 허용하고 분리를 방지하는 데 중요합니다. 일단 부착되면 10%의 소 태아 혈청과 1%의 항생제-항진균제를 함유한 Eagle's Minimum Essential Medium을 외식식물을 방해하지 않고 플라스크에 천천히 첨가합니다.플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 부드럽게 놓습니다. 세포가 플라스크에서 분리되어 이동하기 시작할 때까지 외식을 방해받지 않고 그대로 두십시오. 약 2-4주 후에 세포는 100% 합류점에 도달해야 합니다.100% 합류 시 조직 배양 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 세척하여 세포를 통과시킵니다. 세포에 트립신을 첨가한 다음 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 5분 후, 광학 현미경으로 세포를 관찰하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.새로운 배지를 추가하여 단백질 분해를 중단하고 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 1000 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포를 새로운 배지에 현탁시킵니다.세포 계수를 수행한 후, 추가 증식을 위해 T75 배양 플라스크의 6개 세포에 약 10배의 1배를 새로운 배지로 파종합니다. 3D 구조를 조립하려면 먼저 인간 각막 섬유아세포를 통과시키고 계수한 다음 0.4미크론 공극이 있는 폴리카보네이트 멤브레인 인서트에 6개의 HCF에 대해 약 10배의 시딩을 합니다. 구조체 상단에 1.5ml의 새 배지를 추가합니다.그런 다음 동일한 매체 1.5ml를 각 구조체의 바닥에 또 다른 피펫으로 주입합니다. 24시간 후, 0.5밀리몰의 비타민 C가 보충된 1.5밀리리터의 미디엄을 각 구조체의 상단과 하단에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 3주 동안 배양하고 격일로 비타민 C가 함유된 신선한 배지를 추가합니다.이것은 세포가 자신의 세포 외 기질을 분비하고 조립하도록 자극합니다. 3주 후, 이전에 조립된 3D 구조체 위에 있는 세 번째 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에 8배 10을 추가합니다. 이 단계에서 정확한 세포 수를 계산하고 세포 분화를 시작하기 전에 24시간을 허용하는 것이 중요합니다.배양 24시간 후, 10%FBS와 10마이크로몰 레티노산이 함유된 EMEM 1.5ml로 세포를 자극하여 SH-SY5Y 세포 분화를 시작합니다. 그런 다음 비타민 C를 함유한 배지 1.5ml를 구조체 바닥에 추가합니다. 레티노산은 빛에 민감하므로 이 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.5일 후 세포가 분화 단계에 도달하면 2개의 나노몰 BDNF와 1%의 항생제-항진균제를 포함하는 1.5ml의 무혈청 배지를 구조체 상단에 추가합니다. 신선한 비타민 C가 보충된 배지를 구조물 바닥에 추가합니다. 추가 분석을 위해 처리하기 전에 추가로 2일 동안 세포를 배양합니다.이것은 폴리카보네이트 막과 그 위에 앉은 각막 기질 세포를 보여주는 3D 자체 조립 구조체의 고배율 투과 전자 현미경 이미지입니다. 이 이미지는 기질-신경 세포 배열을 나타내는 상단에 위치한 분화된 신경 세포를 보여줍니다. 이미지의 화살표는 신경 세포를 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안 외식식물을 절단할 때 각막 조직을 항상 젖은 상태로 유지하고 수술 기구와 칼날을 멸균 상태로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자연 세포외 기질에서 인간 각막 기질 세포와 신경 세포 간의 세포 상호 작용을 조사하기 위해 이 체외 모델을 설정하고 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. BDNF, 레티노산 및 수술용 칼날로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보호복을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

corneal-tissue-engineering-an-vitro-model-stromal-nerve-interactions

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 일차 인간 각막 섬유아세포와 분화된 신경 세포의 3차원 공동 배양 모델 시스템을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이 공동 배양 시스템은 기질-신경 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

인간 각막 섬유아세포와 뉴런의 3D 공동 배양 모델 생성

우리는 세포의 행동을 연구하는 전기 방사 막을 내 micropockets의 제조를위한 기술을보고합니다. 구체적으로, 우리는 PLGA (폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드)) 마이크로 피처 구비 각막 생체 재료 소자의 생산을위한 마이크로 광과 전기 방사의 조합을 설명한다.

마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

전직에 대 한 프로토콜 vivo 막 기관 문화 모델 부상 치료 연구는 설명 하는 유용한. 이 모델 시스템 재생 치유를 촉진 하는 에이전트 또는 조직된 3D 다세포 환경에서 약물 독성의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.

생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

Descemet's Stripping Only는 Fuchs 내피 각막 이영양증으로 인한 중앙 각막 굿태를 가진 환자가 말초 세포가 내피층을 재생시키기 위해 Descemet의 막을 벗겨내는 실험 절차입니다. 우리는 eFGF1 (NM141)에 의해 자극된 가속화된 치유와 함께 영양 장애 인간 각막 생체외 에서 DSO를 시뮬레이션하는 새로운 방법론을 제시한다.

조작된 섬유아세포 성장 인자 1에 의해 자극된 가속화된 치유를 통해서만 Descemet의 스트리핑의 인간 각막 배양 모델

본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.

배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사

여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.

쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략

배우세요 인간 각막 기질 세포와 신경 세포의 상호작용을 자연적 세포외기질에서 연구하는 3차원 생체외 모델을 이용한 방법을. 이 기법은 각막 신경 손상과 재생에 대한 통찰을 제공하며 각막 질환 치료에 활용됩니다.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

더 많은 동영상 탐색