Name: 말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 학습하세요 말초혈액 단핵세포와 유방암 세포를 공동배양하여 파골세포형성을 모사하는 인체 전임상 모델을 통해 뼈 전이 및 암세포-뼈세포 상호작용을 연구하는 방법을.

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우리는 빈 강 SCP2 셀 라인을 제공 하기 위한 및 편집에 크리스티 아 베르나를 감사 하 고 싶습니다.

인간 osteoclasts 준 서 면된 동의 연구에 참여 하는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 분화 되었다. 연구 프로토콜 1964 헬싱키 선언에서 윤리적인 표준 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
 1. osteoclast 차별화 참고: EDTA에 건강 한 인간 기증자 로부터 말 초 혈액 이나 버 피 코트를 수집. 말 초 혈액의 미만 20 mL를 사용 하지 마십시오. 버 피 코트는 들은 단 세포의 더 큰 풍부 때문에 바람직합니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 다음 단계를 수행.
<li>희석 EDTA 전 혈 1:1 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x <ol>. 다시 잘 중단.</li>
	<li>레이어 림프 구 분리 미디어 (PBS 혈액: 림프 구 분리 미디어, 2:1) 50 mL 튜브에.
	<ol><li>혈액 50 mL 튜브에 PBS에 희석의 30 mL를 플라스틱.</li>
		<li>부드럽게 림프 구 분리 미디어의 15 mL 50 mL 튜브의 하단에 아래에 배치.</li>
	</ol></li> <li>실내 온도 (브레이크)에 10 분 동안 757 × g에서 원심 분리기.</li>
	<li>단 세포를 수집: <ol><li>agitating 없이 단 셀 5 mL 피 펫의 흰색 레이어를 수집 하 고 새로운 50 mL 튜브에.</li>
		<li>PBS의 20 mL와 함께 수집된 PBMCs 희석.</li>
	</ol></li> <li>는 PBMCs 세척: <ol><li>실 온에서 5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다. 한번 반복.</li>
	</ol></li> <li>RBC 세포: 참고: 셀 펠 릿 빨간색 이면 버퍼 솔루션 lysing 적혈구 세포 치료 (재료의 표 참조).
	<li>얼음에 50 mL 튜브</li> <ol>
		<li>붉은 혈액 세포를 lysing 버퍼의 5 mL을 추가.</li>
		<li>는 적혈구 세포를 완료 하려면 3-5 분 기다립니다. 시간 적혈구 오염 정도 따라 다릅니다.</li>
		<li>PBS의 20 mL를 추가 하 여 반응을 중지.</li>
		<li>원심 분리기에서 225 x g 실 온에서 5 분. 튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제. 
		참고: 선택 사항: 아래에 설명 된 RBC 세포 수행 하는 경우는 PBMCs 세척.</li>
	</ol></li> <li>워시 PBMCs: <ol><li>225 x g 실 온에서 5 분 동안에 20 mL의 PBS와 원심 분리기를 추가.</li>
		<li>튜브를 거꾸로 하 여는 상쾌한 삭제.</li>
	</ol></li> <li>다시 완전 한 α-MEM (1% 글루타민 (초기 농도 100 X)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 보충)에 셀 중단.</li>
	<li>는 Neubauer 챔버와 셀을 계산합니다.
	<ol><li>빙 초 산에 샘플 1: 100 희석 및 희석의 10 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
		<li>두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 의미.</li>
	</ol></li> <li>셀 접시: <ol><li>c m 2 당 750000 PBMCs의 농도에 세포 격판덮개.</li>
		<li>5% CO 2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터에 도금된 셀 저장. 
		참고: 디자인 셀 정상 완전 한 α-MEM MCSF 또는 RANKL GFs. 기억 하십시오 적어도 3 기술에서 수행 하는 각 조건 없이 함께 취급 되는 부정적인 컨트롤을 포함 하는 실험을 복제 합니다. 3 생물 복제 수행.</li>
	</ol></li> <li>GFs와 보완 매체 변경: <ol><li>셀 시드 후 약 3 h를 기다릴 한 다음 피 펫 (200-1000 µ L) 파편, 첨부 되지 않은 세포와 적혈구를 삭제 하 여 매체를 제거. 
		참고: 셀 분리를 피하기 위해 매체를 변경할 때 조심.</li>
		<li>추가 새로운 완전 한 α-MEM MCSF의 20 ng/mL으로 보충 (500 µ L/잘). 
		참고: 때 암 세포와 공동 경작, 씨 암 세포 PBMC 시드 후 하루.</li>
	</ol></li> <li>미디어 (α-MEM MCSF의 20 ng/mL로 보충) 2-3 일 마다 변경: <ol><li>200-1000 µ L 피 펫에 의해 매체를 폐기.</li>
		<li>200-1000 µ L 피 펫에 의해 추가 새로운 신선한 매체.</li>
	</ol></li> <li>셀 시드, 후 6-7 일 추가 20 ng/mL RANKL의 완전 한 α-MEM + MCSF.</li>
	<li>매체 변경 (완전 한 α-MEM + MCSF + RANKL) 매 2-3 일: <ol><li>200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.</li>
		<li>는 200-1000 µ L 피 펫과 새로운 매체를 추가합니다. 셀 시드 후 14 일 분화의 유도 중지.</li>
		<li>폐기 매체와 PBS로 두번 세척.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde로 셀 수정: <ol><li>셀 건조 두고.</li>
		<li>추가 4 %paraformaldehyde (재료의 표 참조).</li>
		<li>실 온에서 20 분 동안 품.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde 삭제와 PBS의 500 µ L로 두 번 세척. 
	주의: Paraformaldehyde은 독성; 장갑, 마스크와 안경을 착용 하십시오.</li>
	<li>건조 세포 허용.</li>
	<li>수행 트랩 제조 업체에 따라 얼룩 &#39; s 지침 (재료의 표 참조).</li>
	<li>수동으로 확대 10 배; 현미경 osteoclast 같은 셀의 개수 NA 0.30. 
	참고: Osteoclast 같은 셀 4 핵으로 트랩 + polycarion 셀으로 정의 됩니다.</li>
</ol> 2. 암 세포 배양 참고: SCP2 17, 트리플 부정적인 인간에서 발생 하는 osteotropic 셀 라인 등 유 방 선 암 세포 라인의 종류와 실험을 수행할 수 있습니다 유 방 암 세포 선 (MDA-MB-231), 그리고 호르몬 수용 체 양성 세포 선 MCF7.
<ol><li>75 cm 2 플라스 크에 단층으로 셀 문화.
	<ol><li>75 cm 2 플라스 크에 씨앗 1000000 암 세포.</li>
		<li>1% 글루타민과 10% 태아 둔감 한 혈 청 5% CO 2 분위기에서 보완 하는 완전 한 α-MEM 매체에서 37 ° C에서 셀 저장.</li>
	</ol></li> <li>약 90%의 confluency에서 셀 분리: <ol><li>매체 폐기, PBS, 세척 및 PBS에 트립 신 1 X의 2-3 mL를 추가.</li>
		<li>37에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어 ° c.</li>
		<li>10 mL 피 펫, 효소 반응을 중지를 완전 한 매체의 8 mL을 추가 하 여 75 cm 2 플라스 크에서 분리 된 세포를 수집.</li>
		<li>5 분에 대 한 225 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>암 세포 세척: <ol><li>PBS의 10 mL을 추가.</li>
		<li>5 분에 대 한 600 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>Neubauer 챔버와 암 세포를 계산.
	<ol><li>암 세포를 두 번 이상 계산 및 계산 셀의 평균 총 수집을 복제의 뜻.</li>
	</ol></li></ol> 3. 직접 암 세포의 공동 문화 nd Osteoclasts 향해 Monocytes 겪고 차별화 <ol><li>삽입 (기 공 직경 0.4 µ m)에서 암 세포를 씨앗: <ol><li>c m 2 당 4, 000 셀의 농도에 암 세포 씨.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO 2에서 품 어. 
		참고: 씨 암 세포 PBMC 0.4 µ m 삽입에 공동 문화 실험에 대 한 시드 후 날.</li>
	</ol></li> <li>준수를 셀 수 있도록 24 시간 대기.</li>
	<li>공동 문화 (1.10 부분의 프로토콜 참조)을 시작 하 되 문화 통해 문화를 삽입 하는 장소는 시드.</li>
	<li>미디어 완전 한 α-MEM와 2-3 일 마다 변경합니다.
	<ol><li>200-1000 µ L 피 펫과 매체를 폐기.</li>
		<li>추가 500 µ L 신선한 매체. 
		참고: 공동 문화의 기본 목표는 암 세포의 osteoclastogenic 힘을 이해 하는, 따라서, GFs는 추가 되지 않습니다 α-MEM에. 각 실험에서 공동 문화, ne 포함gative 컨트롤 (1.10 프로토콜의 단계에서 참고)와 osteoclasts RANKL과 MCSF (암 세포)로 분화의 긍정적인 컨트롤입니다. 암 세포는 단 세포에 배치 되지 삽입에 시드 공동 문화의 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>공동 문화를 중지 하 고 암 세포를 사용 하 여 다운스트림 분석: <ol><li>13 일 PBMC 시드 후와 암 세포를 뿌리기, 후 12 일 새로운 접시에 삽입 장소.</li>
		<li>중지 암 세포 배양은 기초 다운스트림 분석 (내용 참조)을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>날 14, osteoclast 차별화를 중지 하 고 셀, 1.15 단계에서 보고 된 문제를 해결.</li>
	<li>수행 트랩 얼룩 즉시 또는 14-30 일 이내. 
	참고: 선택적 얼룩: 트랩 + polycarion 셀 osteoclasts는 것인지 연구 클릭률, osteoclast 특정 마커를 감지 추가 얼룩 수행할 수 있습니다. F-말라 반지의 발견은 다른 osteoclast 특정 얼룩 분석 결과 12 , , 13 14.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

모델 전 임상 시험관에 암 세포 및 뼈 세포 사이 누화의 메커니즘을 공부 하 고 새로운 치료 전략을 만드는 데 사용할 수 있는 뼈 전이의 메커니즘을 식별 하기 위해 필요 합니다. 우리는 모델을 완벽 하 게 인간의 생체 외에서 인간 주변 혈액 (그림 3)에서 osteoclastogenesis의 개발. 방법론의 최적화 하는 동안 중요 한 포인트의 번호 식별 하 고 해결 했다. 첫 번째 씨앗을 단 세포의 수량을 우려. 현미경 조사에 의해 취득 하는 셀의 수만 거친 정량화는 림프 톨, monocytes, 후자 되 고 대상 셀 osteoclastogenesis 실험에 대 한 씨앗을 구분 하기가 어렵습니다. 우리 때문에 림프 톨 플라스틱 기판에 고착 하지 않는 및 따라서 대부분 매체의 첫 번째 변화에서 탈락 했다 monocytes를 식별할 수 있었다. 그것은 차별화, 특히 osteoclastogenesis는 사전 osteoclasts 해야 서로 융합 하 ...

뼈 질병1,2,3의 과정에서 뼈 전이 개발 하는 환자의 20-25%와 폐, 유 방, 전립선 암, 등 기본 종양의 종류에 대 한 전이의 일반적인 사이트입니다. 특히, 유 방 암 환자의 70% 죽음4에서 뼈 전이의 증거를가지고. 종양 및 stromal 세포 상호 작용은 암 진행에 필수적인 기본 암에 보조 병 변. 뼈 microenvironment에서 유방암에서 osteolytic 뼈 전이 암 세포, 뼈 세포, 뼈 microenvironment 사이 발생 하는 병 적인 악순환의 설립에 따라 달라 집니다. 암 세포 뼈 재흡수5,,67증가 뼈 균형을 방해.
정상 및 병 적인 조건에서 osteoclasts는 뼈 재흡수에 대 한 책임 셀 반면 osteoblasts, 입금 새로운 매트릭스에 새로운 뼈 대형8에 대 한 책임이 있습니다. Osteoclast 활동 RANKL, 사전 osteoclast 표면에 그것의 수용 체 순위를 바인딩하는 사전 osteoclast 퓨전, 차별화 성숙한 osteoclasts에 필요한 과정을 유도의 표현을 통해 osteoblasts에 의해 통제 된다. Osteoclastogenesis의 유도 뼈 재흡수를 증가합니다. Vivo에서 연구의 많은 수는 크게 뼈 전이 형성9,,1011의 우리의 이해를 개선 했다. 유방암 세포 주 종양에서와 뼈 microenvironment에서 osteoclastogenesis 홍보 뼈 항상성 교란 하 고 뼈 재흡수8. 이 시나리오에서는 모든 분자 사이 상호 작용에 발생 하는 암 세포와 osteoclasts에 중요 한 중요성의. 이미 언급 했 듯이, vivo에서 쥐 모델에서 뼈 전이 형성의 메커니즘을 해명 되었습니다 했습니다. 그러나, 모든 vivo에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인에 대 한 필요, 이외에 높은 비용 및 시간이 걸리는 방법을 포함 vivo에서 실험을 수행 하는 것 다른 몇 가지 단점이 있다. 몇몇 저자는 사전 osteoclasts 라는 RAW246.79,,1011의 murine 라인을 사용 하 여 osteoclastogenesis의 전 임상 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델을 결합 했다. 이 모델의 단점이 사실 셀 이미 사전 osteoclasts 되기 위해 최선을 다하고 있습니다 및 인간 근원의 하지 않습니다에서 줄기. 이러한 이유로, 변환 연구는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델의 뼈 암 세포 상호 작용을 공부 하 여부에서 크게 유익할 수 있었다.
우리 osteoclastogenesis에서 생체 외에서 인간 주변 혈액 샘플12,13에서 시작 하는 방법을 최적화 합니다. Osteoclasts는 monocytes는 존재, 이기는 하지만 작은 정도에, 말 초 혈액 샘플에서에서 파생. 단 세포는 먼저 구분 granulocytes 전체 혈액에 존재 하 고 적혈구에서 Ficoll 밀도 기울기; 그들은 다음 세포와 달리 플라스틱 기판에 그들의 능력 덕분에 선택 됩니다. 시드, 후 셀 14 일 동안 교양. MCSF 및 RANKL GFs monocytes에 먼저 대 식 세포로 그리고 osteoclasts14,15차별화 하는 데 필요한 있습니다. RANKL은 osteoclastogenesis의 후반 단계에서 분화 과정을 유도 하는 데 사용 됩니다 반면 MCSF의 분석 결과, 전체 기간 동안 필요 합니다. 차별화의 초기 단계에서 MCSF monocytes 증식 및14,15살아남을 수 있습니다. Osteoclastogenesis의 두 번째 부분에서, 세포 융합 및 osteoclasts, 고리에 걸 F의 특성 분포를 보여 주는 및 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정), 칼 시 토 닌 수용 체 등 특정 마커를 표현으로 성숙 (CTR) 14 , 15. 우리의 방법을 일 7 ~ 14에서에서 실험 및 MCSF와 RANKL의 첫 번째 7 일 동안 monocyte 문화에 MCSF를 추가 구성 됩니다. 실험의 끝에, osteoclastogenesis로 아래 차별화 된 셀을 계산 하 여 분석 된다.
GFs에 의해 분화를 유도 하는 monocyte 문화는 우리의 전 임상 모델의 기초를 형성 한다. 우리 유방암 세포의 osteoclastogenic 힘을 더 잘 이해 하는 GFs 없이 공동 문화 시스템 최적화. 우리가 먼저 개발 간접 공동 문화 매체를 추가 하 여 (80% α-최소한의 필수 매체 (α-MEM)와 20% 조절 매체에서에서 수집 된 유방암 세포의 문화는 했다 셀에 약 90% 합칠 겪고 차별화12 . (혈 청 부족 조건 하에서 수집 되지 않습니다) 바른된 매체 24 시간 후 수집 된 고 1: 4의 비율에 신선한 매체와 혼합. 바른된 매체 부정적인 제어에 관하여 상당한 osteoclast 차별화를 유도 한다. 그러나, 암 세포 및 뼈 세포 간의 상호 상호 작용에 대 한 정보는 손실 간접 공동 문화를 사용 하는 경우, 우리는 개선 우리의 시스템 직접 공동 문화를 수행 하 여. 우리는 0.4 µ M 삽입 및 단 세포 도금 했다 우물에 그들을 배치에서 암 세포를 시드. 이 메서드를 사용 하 여 셀 같은 매체를 공유 하 고 분 비 단백질을 교환 한다. 우리는 따라서 osteoclastogenesis 암 세포13에 의해 유도 된의 완전히 인간의 전 임상 모델을 만들었습니다.
이 시스템은 매우 다재 다능 하 고 다른 연구 목적, 예를 들면, 뼈 전이에 약물의 역할을 조사 하는 약리 연구에 사용 될 수 있습니다. 우리의 모델 효능과 뼈-타겟 요법 암 세포13의 뼈 microenvironment에 antitumor 약물의 행동의 메커니즘을 연구를 가능 하 게. 올바른 컨트롤 실험 설계, 즉, 암 세포와 개별적으로 경작 osteoclasts 쉽게 마약 활동에 공동 문화에 미치는 영향을 이해 하는 것 있습니다. 이 이렇게 공부 되 고 마약 대상 모두 암 세포와, 예를 들어, osteoclasts everolimus16때 더욱 흥미로운 됩니다. 이 모델은 또한 암 세포 및 뼈 세포 사이 상호 작용의 새로운 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&알파; MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Life-technologies</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Life-technologies</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>보관 표시를 준수해야 합니다</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>보관 표시를 준수해야 합니다</td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, 백혈구(TRAP) 키트</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 매체</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>SIgma</td><td>11814389001 ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone</td><td>COD. ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 4% 수용액, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 세포주</td>, <td>ATCC</td><td>, CRM-HTB-267</td><td></td></tr>, <tr><td>MCF7</td>, <td>ATCC,</td><td>HTB-22</td><td></td></tr>, <tr><td>트랜스웰</td>, <td>코닝</td><td>, 3470-Clear</td><td>: 이 인서트는 24웰 플레이트용입니다. 6.5 mm, 0.4 & M; 모공 크기</td></tr></tbody></table>

말 초 혈액 monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

종양 세포 및 뼈 세포 뼈 microenvironment에서 사이 누화 뼈 전이 형성의 메커니즘 이해 결정적 이다. 우리는 생체 외에서 완전히 인간의 전 임상 모델을 유방암 세포 및 osteoclasts로 차별화를 진행 하는 monocytes의 공동 문화를 개발 했다. 우리는 주변 혈액 건강 한 기증자 로부터 수집 된 샘플에서 시작 하는 osteoclastogenesis의 모델을 최적화. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) 처음 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 분리, 높은 밀도에서 시드 되었고 두 성장 인자 (GFs)을 추가 하 여 차별화 하는 유도: 핵 요인-κB ligand (RANKL) 및 대 식 세포의 수용 체 활성 콜로 니 자극 인자 (MCSF). 셀은 14 일 문화에 남아 다음 고정 고 다운스트림 분석 하 여 분석. Osteolytic 뼈 전이에 뼈에 암 세포 도착의 효과 중 하나는 osteoclastogenesis의 유도 이다. 우리는 따라서 GFs와 관련 하 여 암 세포의 분화 능력 연구 유방암 세포의 공동 문화 우리의 모델 도전. 암 세포 osteoclast 상호 작용을 공부 하는 간단한 방법 간접 공동 문화 조절된 매체 유 방 암 세포 배양에서 수집 하 고 신선한 매체와 혼합의 사용에 따라 수행 하는 것입니다. 이 혼합물 다음 osteoclast 차별화를 유도 하는 데 사용 됩니다. 우리는 또한 직접 공동 문화는 암에서 세포, monocytes 분화를 겪고 매체 공유와 분 비 요소를 교환 하는 방법을 최적화 합니다. 이것은 상당한 개선을 원래 간접 공동 문화 메서드를 통해 연구자는 두 종류의 세포 상호 작용을 관찰 하 고 암 세포와 osteoclasts 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에서 파생 된 씨 셀 라인을 전이성 뼈 microenvironment에 약물의 효과 연구 수 있습니다. 모델도 골다공증 또는 다른 뼈 조건 등 다른 질병 연구를 사용할 수 있습니다.

메서드는 쉽게 인간의 말 초 혈액에 monocytes osteoclasts를 구별 하기 위해 최적화 되었다. Monocyte 문화 암 세포, 암 세포의 뼈 전이에 osteoclastogenesis를 유지 할 수 있다 (문학18에서 같이) 확인을 경작 했다. Osteoclasts 암 세포에서 분화 하 고 GFs는 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclast 같은 셀 있는 셀 4 이상의 핵 이며 트랩 (보라색 세포를) 얼룩이 지기에 대 한 긍정적인. Osteoclast는 정의 하는 데 사용 하는 핵의 수에 대 한 허용된 컷오프는 318, 하지만 우리는 최소한 잘못 된 반응의 위험을 줄이기 위해 4를 사용 하기로.
모델은 oste...

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

유방암 세포주와 함께 배양된 말초 혈액 단핵구(PBMC)에서 유래한 파골세포 형성의 체외 인간 전임상 모델의 전반적인 목표는 암세포 파골세포 상호 작용을 모방하는 것입니다. 이 방법은 뼈 미세환경 내에서 암세포와 뼈 세포 상호 작용의 영향에 대한 뼈 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 완전한 인간 전임상 모델이라는 것입니다.또한 이 방법은 뼈 전이에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 골다공증과 같은 다른 뼈 관련 병리학적 메커니즘에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 건강한 기증자 간의 다양성과 적절한 PBMC 세포 밀도를 선택하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.이 방법의 시각적 시연은 PBMC 선택 및 시딩 단계에서 숙련도를 달성하기 전에 약간의 수동 경험이 필요하다는 것을 확인해야 하기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 EDTA에서 최소 20ml의 건강한 기증자 전혈을 PBS에서 1:1 비율로 희석합니다. 완전히 혼합한 후 혈액 용액을 50ml 원뿔형 튜브에 30ml 분취량으로 나눕니다.15ml의 림프구 분리 배지를 각 튜브의 바닥에 조심스럽게 밑에 깔아줍니다. 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)로 세포를 분리합니다. 그리고 버피 코트가 들어있는 흰색 단핵 셀을 새로운 15 밀리리터 튜브로 당깁니다.수확된 세포를 세척당 20ml의 PBS로 두 번 세척한 다음 얼음 위에서 3-5분 동안 5ml의 적혈구 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다. PBS 20밀리리터로 반응을 중지하고 원심분리로 백혈구를 수집합니다. 펠릿을 다시 현탁시키고 카운팅을 위해 알파 M-E-M을 완성합니다.그런 다음 섭씨 37도 및 5% CO2에서 배양하기 위해 24웰 플레이트의 각 웰에서 평방 센티미터당 5 PBMC 농도의 7포인트에서 세포를 플레이트화합니다. 약 3시간 후, 배양액에서 상층액, 파편, 부착되지 않은 세포 및 용해되지 않은 적혈구를 제거합니다. 그리고 MCSF가 보충된 새로운 배지를 추가합니다.파종 후 14일 후에 PBS로 세포를 두 번 세척하고 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 제조업체의 지침에 따라 트랩 염색을 수행하십시오. 파골세포와 같은 세포는 최소 4개의 핵을 가진 TRAP 양성입니다.파골세포와 같은 세포를 10X 배율로 현미경으로 수동으로 계수합니다. 암세포가 90%의 포화도에 도달했을 때 암세포 유도 파골세포 분화의 경우, 트립신화(trypsinization)에 의해 분리되고 새로운 알파 MEM에서 제곱센티미터당 3개의 세포 농도에 10의 4배로 4배의 제로 포인트 4마이크로미터 공극 삽입물에 파종됩니다. 다음 날, 파종된 삽입물을 완전한 알파 M-E-M의 미분화 1일 도금된 단핵 세포 배양 위에 놓고 2-3일마다 배지를 교체합니다.그런 다음 공동 배양 시작 11일 후 원하는 다운스트림 분석에 적합한 시약이 들어 있는 새 플레이트로 삽입물을 옮깁니다. 유방암 세포는 암세포에 의해 유도된 웰 내의 파골세포의 수가 양성 성장 인자 대조 웰에서 얻은 수와 유사하기 때문에 파골세포 형성을 유지할 수 있습니다. 그러나 모든 배양에서 관찰되는 파골세포의 수는 세포가 항종양 약물로 처리될 때 감소합니다.흥미롭게도, 성장 인자에서 유래한 성숙한 파골세포의 표면적은 암세포에 의해 유도된 표면적보다 큽니다. 이러한 효과는 항종양 약물 처리 배양에서는 관찰되지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7, 8시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차에 따라 유전자 발현 분석, 웨스턴 블롯, 면역형광 분석 또는 ELISA와 같은 추가 다운스트림 분석을 수행하여 암세포/뼈세포 상호 작용 또는 항종양 약물 메커니즘에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 뼈 전이 분야의 연구자들이 완전한 인간 전임상 모델에서 뼈 미세환경을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단핵구를 공동 배양하고 암세포와 분화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.생물학적 샘플 및 약물로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

노치 신호는 세포 간의 직접 접촉에 의존하는 셀룰러 통신의 한 형태입니다. 체외에서 Notch 신호를 적절하게 유도하려면 Notch 리간드를 고정된 상태의 세포에 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 파골세포 전구체에서 Notch 신호의 체외 자극 방법을 설명합니다.

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RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

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여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

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파골세포는 신체의 주요 뼈 흡수 세포입니다. 이 프로토콜은 인간 말초 혈액 단핵구로부터 파골세포의 시험관내 분화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 항상성 및 질병에서 파골세포 생물학을 더 깊이 이해하는 데 중요한 도구로 사용될 수 있습니다.

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인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

학습하세요 말초혈액 단핵세포와 유방암 세포를 공동배양하여 파골세포형성을 모사하는 인체 전임상 모델을 통해 뼈 전이 및 암세포-뼈세포 상호작용을 연구하는 방법을.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

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