말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발
2017년 9월 13일
이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.
유방암 세포주와 함께 배양된 말초 혈액 단핵구(PBMC)에서 유래한 파골세포 형성의 체외 인간 전임상 모델의 전반적인 목표는 암세포 파골세포 상호 작용을 모방하는 것입니다. 이 방법은 뼈 미세환경 내에서 암세포와 뼈 세포 상호 작용의 영향에 대한 뼈 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 완전한 인간 전임상 모델이라는 것입니다.
또한 이 방법은 뼈 전이에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 골다공증과 같은 다른 뼈 관련 병리학적 메커니즘에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 건강한 기증자 간의 다양성과 적절한 PBMC 세포 밀도를 선택하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.
이 방법의 시각적 시연은 PBMC 선택 및 시딩 단계에서 숙련도를 달성하기 전에 약간의 수동 경험이 필요하다는 것을 확인해야 하기 때문에 매우 중요합니다. 먼저 EDTA에서 최소 20ml의 건강한 기증자 전혈을 PBS에서 1:1 비율로 희석합니다. 완전히 혼합한 후 혈액 용액을 50ml 원뿔형 튜브에 30ml 분취량으로 나눕니다.
15ml의 림프구 분리 배지를 각 튜브의 바닥에 조심스럽게 밑에 깔아줍니다. 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)로 세포를 분리합니다. 그리고 버피 코트가 들어있는 흰색 단핵 셀을 새로운 15 밀리리터 튜브로 당깁니다.
수확된 세포를 세척당 20ml의 PBS로 두 번 세척한 다음 얼음 위에서 3-5분 동안 5ml의 적혈구 용해 완충액으로 적혈구를 용해합니다. PBS 20밀리리터로 반응을 중지하고 원심분리로 백혈구를 수집합니다. 펠릿을 다시 현탁시키고 카운팅을 위해 알파 M-E-M을 완성합니다.
그런 다음 섭씨 37도 및 5% CO2에서 배양하기 위해 24웰 플레이트의 각 웰에서 평방 센티미터당 5 PBMC 농도의 7포인트에서 세포를 플레이트화합니다. 약 3시간 후, 배양액에서 상층액, 파편, 부착되지 않은 세포 및 용해되지 않은 적혈구를 제거합니다. 그리고 MCSF가 보충된 새로운 배지를 추가합니다.
파종 후 14일 후에 PBS로 세포를 두 번 세척하고 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. 제조업체의 지침에 따라 트랩 염색을 수행하십시오. 파골세포와 같은 세포는 최소 4개의 핵을 가진 TRAP 양성입니다.
파골세포와 같은 세포를 10X 배율로 현미경으로 수동으로 계수합니다. 암세포가 90%의 포화도에 도달했을 때 암세포 유도 파골세포 분화의 경우, 트립신화(trypsinization)에 의해 분리되고 새로운 알파 MEM에서 제곱센티미터당 3개의 세포 농도에 10의 4배로 4배의 제로 포인트 4마이크로미터 공극 삽입물에 파종됩니다. 다음 날, 파종된 삽입물을 완전한 알파 M-E-M의 미분화 1일 도금된 단핵 세포 배양 위에 놓고 2-3일마다 배지를 교체합니다.
그런 다음 공동 배양 시작 11일 후 원하는 다운스트림 분석에 적합한 시약이 들어 있는 새 플레이트로 삽입물을 옮깁니다. 유방암 세포는 암세포에 의해 유도된 웰 내의 파골세포의 수가 양성 성장 인자 대조 웰에서 얻은 수와 유사하기 때문에 파골세포 형성을 유지할 수 있습니다. 그러나 모든 배양에서 관찰되는 파골세포의 수는 세포가 항종양 약물로 처리될 때 감소합니다.
흥미롭게도, 성장 인자에서 유래한 성숙한 파골세포의 표면적은 암세포에 의해 유도된 표면적보다 큽니다. 이러한 효과는 항종양 약물 처리 배양에서는 관찰되지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 7, 8시간 안에 완료할 수 있습니다.
이 절차에 따라 유전자 발현 분석, 웨스턴 블롯, 면역형광 분석 또는 ELISA와 같은 추가 다운스트림 분석을 수행하여 암세포/뼈세포 상호 작용 또는 항종양 약물 메커니즘에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 뼈 전이 분야의 연구자들이 완전한 인간 전임상 모델에서 뼈 미세환경을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단핵구를 공동 배양하고 암세포와 분화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
생물학적 샘플 및 약물로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
본 프로토콜은 암세포와 파골세포 간의 상호작용을 모방하기 위해 유방암 세포주와 함께 배양된 말초혈액 단핵구를 이용한 파골세포 형성의 인비트로(in vitro) 인간 전임상 모델 개발 방법을 설명합니다. 이 모델은 골전이와 관련된 핵심 질문에 답하고 치료 옵션을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 파골세포 형성
- 골전이
- 암세포 상호작용
배경
- 이 모델은 말초혈액 단핵구(PBMC)를 활용합니다.
- 본 모델의 목적은 암세포와 파골세포 간의 상호작용을 재현하는 것입니다.
- 이 연구는 골 관련 병리학을 이해하는 데 있어 중요한 의미를 갖습니다.
- 건강한 공여자 간의 개체 차이가 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.
연구 목적
- 암세포와 파골세포의 상호작용을 모사하기 위함입니다.
- 골 미세환경 내에서 이러한 상호작용의 효과를 조사하기 위함입니다.
- 골 전이 및 관련 질환에 대한 통찰력을 제공하기 위함입니다.
사용된 방법
- 유방암 세포주와 PBMC의 공동 배양.
- 파골세포 형성 평가.
- 암세포와 골세포 간 상호작용 평가.
- PBMC 세포 밀도의 가변성 분석.
주요 결과
- 이 모델은 암세포와 파골세포 간의 상호작용을 성공적으로 모사합니다.
- 이를 통해 얻은 통찰은 골전이에 대한 치료 전략 수립에 활용될 수 있습니다.
- 잠재적인 응용 범위는 다른 골 관련 질환으로 확장될 수 있습니다.
- 해결 과제로는 공여자의 가변성과 세포 밀도 선택 등이 있습니다.
결론
- 이 인간 전임상 모델은 골전이를 연구하는 데 매우 유용합니다.
- 이는 골 미세환경 내에서의 암세포 상호작용에 대한 이해를 높여줍니다.
- 향후 연구에서는 이 모델을 골 병리학의 더 폭넓은 응용 분야에 활용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 완전 인간 전임상 모델은 생리적으로 관련성 있는 시스템에서 암세포와 파골세포 간의 상호작용을 재현함으로써, 골전이 시 파골세포 생성 경로의 기전적 위험 제거를 가능하게 합니다. 또한 파골세포의 분화 및 기능에 대한 정량적 판독값을 제공하여 항종양 치료제의 표적 검증 및 분석법 개발을 지원합니다. 이 모델은 약물 처리 조건 하에서 두 세포 유형의 상호 작용을 직접 관찰하고 하위 분석을 수행할 수 있게 함으로써, 선도 물질 발굴의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 종양 유도 파골세포 생성에 관한 치료 가설의 조사 및 골 미세환경 내 경로 규명을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 정의된 공배양 조건에서 일차 인간 단핵구로부터의 파골세포 분화를 모델링함으로써 생물학적 리스크 제거 및 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 과학적 가치: 성장 인자 대조군 대비 암세포 자극에 반응하는 파골세포 형성을 정량화하여 예측 신뢰도를 높이고 포트폴리오 우선순위 선정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: RANKL 및 MCSF를 사용하여 PBMC로부터 표준화된 파골세포 분화를 유도함으로써, 후속 워크플로우를 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 운영적 가치: 고정된 세포 밀도 접종(7.5×10⁵ PBMC/cm²)과 정해진 분화 기간(14일) 및 TRAP 기반의 파골세포 정량화를 통해 분석의 표준화와 재현성을 확보합니다.
- 과학적 가치: 간접(조건화 배지) 및 직접 공동 배양 방식 모두에서 파골세포 형성능에 미치는 약물 효과를 테스트하여 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 파골세포 형성 분석법의 최적화를 통해 골다공증 및 기타 골 질환의 질병 관련 모델링을 지원합니다.
- 운영적 가치: 완전한 인간 세포를 사용하여 전임상-임상 외삽 과정에서의 종 간 전이 위험을 줄임으로써 중개 연구의 연속성을 보장합니다.
- 과학적 가치: 약물 효능의 약동학적 바이오마커로서 파골세포 수와 표면적의 변화를 측정함으로써 위험 조정된 개발 진행 결정을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 모델은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴, 그리고 전임상 효능 시험에 이르는 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 특히 뼈 표적 치료제 및 뼈 미세환경 조절제 연구에 유용합니다.
- 발견 생물학: 파골세포 활성화에서 암세포 유래 인자의 가설 검증과 RANKL-독립적 파골세포 유도 메커니즘의 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 단핵구 분리, 분화 및 투과성 인서트를 이용한 유방암 세포주와의 공배양을 통해 파라크린 및 쥬크사크린 신호 전달 연구를 위한 분석 준비 상태를 제공합니다.
- 분석: TRAP 염색, 다핵 세포 계수 및 형태 측정 분석(표면적)을 통해 실험 조건 간 비교가 가능한 정량적 파골세포 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 임상적으로 유의미한 유방암 세포주를 사용하여 전이성 골 미세환경에 대한 약물 효과 연구를 가능하게 함으로써 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 유방암 외에도 다양한 암 유형 및 골 병증 전반에 걸친 파골세포 조절 연구를 위한 재사용 가능한 플랫폼으로 기능합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 파골세포와 암세포 상호작용의 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 제공합니다.
- 운영적 가치: 정의된 PBMC 분리, 파종 밀도 및 사이토카인 보충 프로토콜을 통해 표준화와 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 파골세포 형성 및 기능에 미치는 약물 효과를 조기에 평가할 수 있게 하여, 골전이 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄이고 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 화합물의 파골세포 형성 잠재력을 정량화하고 골미세환경 조절에 기반한 진행 방향을 제시함으로써, 리스크 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- PBMC 분리 및 단핵구 부착을 포함하여 일차 인간 세포 분리, 배양 및 분화 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 세포 계수, 원심 분리, 현미경 관찰(파골세포 계수를 위한 10X 배율) 및 배양(37°C, 5% CO₂)을 위한 장비가 필요합니다.
- 변동성을 최소화하기 위해 PBMC 공여자 소싱, 세포 밀도 최적화(7.5×10⁵ PBMC/cm²), 공배양 시점(암세포 파종 후 11일)에 대한 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 비유방암 세포주로 확장하거나 RANKL/MCSF 이외의 다른 파골세포 자극제를 사용할 경우 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 파골세포 분화 잠재력의 공여자별 변동성과 PBMC 파종 및 공배양 설정 시 수작업 숙련도의 필요성과 같은 실제적인 제한 사항이 포함됩니다.
