Name: 예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 학습하세요 혈장 microRNA 측정을 통한 폐암 조기 검진 방법입니다. 50세 이상 중흡연자의 폐암 위험도를 분류하여 CT 검사의 위양성을 줄이고 비용 효율성을 높입니다.

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저자 감사 파 올라 Suatoni, 엘레나 Bertocchi, 캐롤라이나 Ninni, Annamaria Calanca, 및 처리에 대 한 키 아 라 Banfi 시련 그리고 관리 지원, 자원 봉사자 Claudio Jacomelli와 클라우디오 Citterio 데이터 관리를 위한. 일 암 연구를 위한 이탈리아 협회에 의해 지원 되었다 [탐정 보조금 GS, 및 12162 최대, 14318 No. 15928 (특별 프로그램 "암 위험 평가 및 조기 진단에 대 한 혁신적인 도구", 5 x 1000)]; 이탈리아의 보건 [부여 번호 RF-2010]; 국립 암 연구소 (미국)에서 UO1 CA166905를 부여 합니다. MB는 피코 Pezcoller 친교에 의해 지원 되었다.

프로토콜의 우리의 기관 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
 1. 플라즈마 샘플 컬렉션 스프레이 코팅 K 2 EDTA와 실내 온도에 상점 Vacutainer 튜브에 <ol><li>수집 10 mL의 전 혈 샘플. 
	참고:은 용 혈을 최소화 하려면 2 h 이내 플라즈마를 구분 합니다. 열 충격을 방지 하 고 불특정 미르 릴리스 이어질 세포 세포를 낮은 온도 (즉, 4 ° C)에서 전체 혈액을 저장 하지 마십시오.</li>
	<li>내에서 1 h, 분리 1,258 g와 4 ° C 10 분에 대 한 x에서 첫 번째 원심 분리 단계 플라즈마</li>
	<li>신중 하 게 림프 반지와 접촉을 피하고 15 mL 튜브에 플라즈마 표면에 뜨는 전송.</li>
	<li>분리기 플라즈마 1,258 x g와 4 ° C 10 분에 대 한 두 번째 시간</li>
	<li>1.5 mL cryovials, 튜브의 기지에서 플라즈마 분수 수집 피하에 플라즈마의 aliquot 1 mL.</li>
	<li>저장에 모든 aliquots &#8722;는 용 혈의 평가 대 한 하나를 제외 하 고 80 ° C. 분자 분석 5 주 이내에 수행 되어야 합니다.</li>
</ol> 2. Spectrophotometric 측정 하 여 혈의 평가 <ol><li>즉시 후 플라즈마 분리 단계, 분 광 광도 학, 대 한 베트에서 1시 10분에 1 X PBS (예를 들어, 100 µ L 1 X 900 µ L에서 플라즈마의 플라즈마 샘플의 희석 PBS)와 그것을 균질 혼합 
	참고: 플라즈마 샘플 동결 해야 합니다 하지 spectrophotometric 측정으로는 동결-해빙의 샘플 (그리고 특히 lipemic 샘플에), 수 형성 flocculates spectrophotometric 분석을 방해 하기 전에.</li>
	<li>375에서 흡 광도 읽고 nm, 414 nm, 541, 및 576 750에 nm 기준 정정 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 정착 및 경로 길이 10 m m.의 수행 1 x PBS의 1 mL를 사용 하 여 빈 측정.</li>
	<li>414에서 흡 광도 사이의 비율 nm와 375 nm; 경우 1.4, 보다 높은 hemolyzed 샘플을 고려 하 고 혈액 철수를 반복 (표 1에 QC1).</li>
</ol> 3. 플라즈마 총 RNA 추출 균질 솔루션의 mL 당 1-Thioglycerol의 <ol><li>준비 1-Thioglycerol/균질 (세상에) 솔루션 20 µ L. 1-Thioglycerol 점성 이기 때문에, 정확한 측정을 위한 플라스틱 신중 하 게. 세상에 솔루션 얼음에 또는 2-10 ° C에서 그것을 사용 하기 전에 진정 
	참고: 작업 솔루션은 2-10 ° C에 안정 1 개월.</li>
	<li>일시 동결 건조 된 DNase nuclease 무료의 275 µ L을 추가 하 여 유리병에 물 어 부드럽게 혼합 (소용돌이 하지 않습니다). 시각 보조 추가 5 µ L 파란색의 나 재구성된 DNase를 염색과 nuclease 무료 튜브에 단일 사용 aliquots에 솔루션을 분배. 저장 재구성된 DNase I-30 ° C ~-10 ° c.</li>
	<li>냉장된 세상에 솔루션의 200 µ L 추가 플라즈마의 200 µ L에서 시작,.</li>
	<li>소용돌이 15-30 s 완전 한 균질 화 되도록. 거품 발생 하자 얼음에 정착 하는 샘플</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼 및 무 균된 샘플을 20 소용돌이 가수분해 k 25 µ L의 추가 200 µ L s.</li>
	<li>품은 thermomixer에서 15 분 샘플 preheated 37 ° c.</li>
	<li>악기의 갑판 트레이에 각 샘플에 대 한 카트리지를 로드 하 고 적절 한 위치에는 plugger 놓습니다.</li>
	<li>악기 카트리지에서 적절 한 위치에는 lysate 전송.</li>
	<li>DNase의 추가 5 µ L 나 카트리지에서 적절 한 위치에 솔루션.</li>
	<li>추가 60 µ L 각 차입 튜브의 기지로 nuclease 무료 물.</li>
	<li>선택은 &#34; RSC 미르 조직 &#34; 메서드 실행 자동된 정화를 시작 하 고. 총 RNA 샘플에 저장 될 수 있다 &#8722; 80 ° c.</li>
</ol> 4. Taq 기반 실시간 <ol><li>관심의 miRNAs와 Taq RT 뇌관 풀을 사용 하 여 RNA Taq 예측에 관한 반전 전사 키트 cDNA를 변환할.</li>
	<li>사용자 지정 Taq RT 뇌관 풀의 6 µ L를 사용 하 여 키트의 지침에 따라 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 얼음에 RT 반응 혼합의 준비 12 µ L.</li>
	<li>추가 3 µ l의 총 15 µ L의 최종 볼륨에 대 한 RNA와 5 분을 위한 얼음에서 품 어</li>
	<li>로드 열 cycler 다음과 같이 구성에 RT 반응: 30 분, 30 분, 5 분, 그리고 4에 보류에 대 한 85 ° C에 대 한 42 ° C에서 16 ° C ° c. 
	참고:는 cDNA 수 저장소-15-20 ° c에 적어도 1 주일.</li>
</ol> 5. 사전 증폭 <ol><li>Taq 마스터 믹스 2 x, 3.75 µ L 사용자 정의 Taq 수영장, 및 6.25 µ L nuclease 무료 물, 25 µ L의 전체 볼륨에 대 한 12.5 µ L와 각 실시간 제품의 믹스 2.5 µ L.</li>
	<li>수행 다음 열 프로 파일에 따라 열 cycler를 사용 하 여 사전 증폭 반응: 95 ° C 10 분, 2 분, 2 분, 15에 대 한 95 ° C의 12 주기 위한 72 ° C에 55 ° C s, 그리고 4 분 동안 60 ° C 다음 개최 10 분 동안 99.9 ° C에서 4 ° c.</li>
	<li>0.1 X TE, pH 8.0의 175 µ L을 추가 하 여 제품을 희석. 
	참고: 희석된 제품 적어도 1 주일에 대 한-15-20 ° C에가 게 될 수 있습니다.</li>
</ol> 6. 사용자 정의 Taq 배열 예측에 관한 카드에 실시간 정량 Pcr 반응 <ol><li>사용 384-잘 microfluidicCustom Taq 배열 예측에 관한 카드는 24 특정 miRNAs (중복에서 발견)에 8 샘플의 플라즈마 레벨을 동시에 측정 하. MiRBase ID (v21) 24 miRNAs는:-미르-101-3 p는-미르-106a-5 p, 미르-126-3 p, 있다-미르-133a-3 p, 미르-140-3 p, 있다-미르-140-5 p,-미르-142-3 p, 있다-미르-145-5 p, 있다-미르-148b-3 p, 있다-미르-15b-5 p, 있다-미르-16-5 p, 있다-미르-17-5 p 미르-197-3 p, 있다-미르-19b-3 p, 있다-미르-21-5 p,-미르-221-3 p,-미르-28-3 p, 있다-미르-30b-5 p, 있다-미르-30 c-5 p는 미르 320a, 있다-미르-451a, 있다-미르-486-5 p, 있다-미르-660-5 p, 그리고는 미르-92a-3.</li>
	<li>Taq 범용 마스터 믹스 X 2의 56.25 µ L와 0.5 mL 튜브에 물 nuclease 무료 55.69 µ L 희석된 PreAmp 샘플의 혼합 1.13 µ L.</li>
	<li>사용자 정의 Taq 배열 예측에 관한 카드에 최대 8 PCR 반응 혼합 로드.</li>
	<li>2 분에 대 한 311 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>배열 카드 마감재와 함께 사용자 지정 카드를 봉인.</li>
	<li>는 실시간 반응 따라 자전거 매개 변수를 수정 하는 실시간 PCR 시스템을 사용 하 여 실행: 10 분, 30 대 97 ° C의 40 주기 94.5 ° C s, 그리고 60 ° C 59.7 s.</li>
</ol> 7. 데이터 추정과 비율 세대 <ol>배경 신호 및 모든 분석 및 샘플 0.15의 고정된 임계값을 제거 하는 자동 기준선을 설정 하는 원시 Ct 값 <li>사용 소프트웨어. 가난한 증폭 곡선 및 가난한 수동 기준 신호 또는 반점 제거 하십시오.</li>
	<li>수출에 원시 Ct 값 &#34;.xls &#34; 형식 값을 사용 하는 Ct 의미 두 중복의 추가 분석을 위해.</li>
	<li>상관 miRNAs &#39; 임상 연구 샘플에 역사적인 측정 식 레벨 (표 2)입니다. 각 사용자 지정 만든된 미세 카드에 샘플의 적어도 50%는 피어슨 경우 &#39; s 상관 관계 &#60; 97.5, 반복 카드 (표 1에 QC2).</li>
	<li>계산에서 &#8722; ΔCts 모든 miRNAs, 미르 비율의 log2 값에 해당 사이.</li>
</ol> 8. 서명 관련된 miRNA에 의해 용 혈의 평가 <ol><li>생성 짧은 저장 플라즈마 샘플에 대 한 각 컷-오프 (log2 값) 다음 미르 비율을 사용 하 여 혈 관련 미르 서명 (1-5 주에 &#8722; 80 ° C): 미르-126/451 &#60; &#8722; 0.07, 15b/451 &#60; &#8722; 3.67, 221/451 &#60; &#8722; 3.18, 30b/451 &#60; &#8722; 1.1, 126/486-5 p &#60; &#8722; 0.33, 15b/486-5 p &#60; &#8722; 3.86, 221/486-5 p &#60; &#8722; 3.17, 30b/486-5 p &#60; &#8722; 1.42, 126/92a &#60; 1.8, 15b/92a &#60; &#8722; 1.8, 221/92a &#60; &#8722; 1.04, 30b/92a &#60; 0.87, 126/16 &#60; &#8722; 2.85, 15b/16 &#60; &#8722; 6.33, 221/16 &#60; &#8722; 5.9, 30b/16 &#60; &#8722; 3.68.</li>
	<li>Hemolyzed 샘플 비율 (8 중에 16)의 50% 이상에서 각각 마감을 초과로 분류 (표 1에 QC3).</li>
</ol> 9. 정의 위험 수준: 높음, 중간, 및 낮은 그림 3에서 보고는 MSC를 구성 하는 miRNA 비율의 <ol><li>4 정의 서명: 적극적인 질병 (RAD)의 존재의 위험 (RD), 질병의 위험 질병 (PD), 및 적극적인 질병 (패드)의 존재.</li>
	<li>각 서명에 대 한 짧은 저장 플라즈마 샘플에 대 한 해당 컷오프 값을 초과 하는 비율을 정의 (1-5 주에 &#8722; 80 ° C). 긍정적인 간주 하는 데 필요한 초과 비율의 수는 9 개의 27 RD와 PD, 그리고 RAD와 패드 ( 그림 3 A) 28 중 14.</li>
	<li>특성 각 샘플을 각각 MSC 위험 수준 다음과 같습니다: 만약 위험 낮은 RD neg &#8745; PD neg &#8745; RAD neg &#8745; 패드 neg, 중간 위험 경우 RD pos &#8746; PD pos &#8745; RAD neg &#8745; 패드 neg; 또는 높은 위험 경우 방사선 pos &#8746; 패드 pos ( 그림 3 B).</li>
</ol>

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가브리엘라 Sozzi, Mattia Boeri와 우고 Pastorino Gensignia 생명 과학에 미르 서명이이 문서 공개에 관한 허가 3 특허 출원의 공동 발명가. 모든 나머지 작가 작품 제출에 관하여 관심 없음 충돌 선언 합니다.

함정 및 방법론 워크플로의 도전 BioMILD은 진단 도구로 순환 miRNAs 분석 첫 번째 예비 연구, 임계값 및 컷-오프 데이터 분석에 활용 회고전 시리즈에서 생성 했다. 플라즈마 샘플의 다른 저장 간격의 문제를 극복 하기 위해 매개 변수는 MSC 성능 증가를 가능 하 게 세련 된 될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, miRNAs 분석을 시작 하기 전에 전체 프로세스의 여러 측면을 포함 기준, 샘플 수집 및 처리, 같은 신중 하 게 평가 될 필요가 그리고 데이터 분석을 위한 생물 정보학 알고리즘 채택. 다음 섹션에서는 현재 종이, 단일 단계 각의 주요 문제를 해결 하 고 다음 그들을 극복 하는 전략을 제안에 설명 된 작업의 가장 중요 한 포인트에 집중할 것 이다.
연구 인구 등록 BioMILD 재판 심사 기준은: 50-75 년 오래 된, 무거운 현재 또는 전 (10 년 미만) 흡연 자 이상 30 팩 년 및 5 년 이내 암의 이전 역사 없이. 이 인구에서 예상된 폐 암 정도와 연간 발생률 했다 약 1%와 0.7%, 각각. MSC 테스트 제안 된 프로토콜에서 설명 된 대로 적용, 분석 인구는 유사한 특성을 유지 해야 합니다. 특히, 위에서 설명한 QC2 단계 유사한 인구에서 얻은 주어진된 기록 데이터와 비교를 포함 한다. 97.5 아래 상관 관계 기술적인 문제를 나타내는 수 있는 동안, 다른 한편으로, 대부분 개인 폐암의 위험을 반영 하는 변경 된 순환 미르 레벨은 실제로 임계값 아래. 즉, 여기에서 보고 된 매개 변수와 함께 QC2 단계 발전 폐암의 고 위험에 인구에 적용 하면 그것은 허용 샘플 제외 될 수 있습니다. 새로운, 적절 한 참조 매개 변수 다음 정의 되어야 합니다 각 인구의 예상 결과 분석에 대 한 특정.
혈액 및 혈 생물 학적 샘플 컬렉션 샘플 품질 및 특성, 손상 하 고 따라서 분석의 최종 결과 수정할 수 있기 때문에 중요 한 사전 분석 단계입니다. 혈액 샘플에 관한 신선한 혈액을 수집 하 고 표본을 최대한 신속 하 게 처리 하는 것이 중요입니다. 샘플 4 ° C에 저장도 중지 및 재개 구절 RNA 강 직의 세포 세포의 용 해 (용 혈)를 유도 하는 수 있습니다 이후 혈액 철수 후 냉동 될 해야 합니다. 혈 프로세스를 최소화 하기 위해 혈액 컬렉션31 에서 2 h 이내 플라즈마를 분리 하기 위하여 건의 된다.
용 혈 주로 적혈구 (Rbc)의 붕괴 및 주변 환경에 자신의 콘텐츠의 필연적인 출시 예정 이다. 이 순환 miRNAs Rbc 세포내 콘텐츠 릴리스는 극적으로 혈액, 잠재적으로 플라즈마 기반 분석30의 정확도 영향을 미치는 예측에 관한 프로 파일 변경 때문에 테스트에 대 한 문제가 될 수 있습니다.
또한 플라즈마 샘플에서 용 혈의 최소 수준을 식별할 수 생체로 miRNAs 순환에 기반한 연구 위해 결정적 이다. 용 혈 수 처음 부과 육안 검사 하 여 이후 플라즈마의 색상 범위는 노란색에서 빨간색 높은 hemolyzed 샘플에 대 한 두 개의 원심 분리 단계 후. 그러나, 단순한 육안 검사 분자 바이오 마커 연구의 맥락에서 충분히 중요 하지 않을 수 있습니다.
Hemolyzed 플라즈마 샘플을 식별 하는 간단한 사전 분석 방법은 파장 (λ)에 spectrophotometric 측정 = 414 방해의 다른 소스에 대 한 적절 한 조정 후 주요 oxyhemoglobin 피크 흡 광도의 nm. 그 이유로, 우리는 375에서 흡 광도 값에 414 nm 피크 정규화 nm, lipidic 콘텐츠33의 지표. 또는, 또는 더 나은, 조합, lipemia-independenthemolysis (HS) 점수 사용된34일 수 있다. Spectrophotometrically 기반 이렇게 무료 헤모글로빈의 6.1 mg/dL 이상 식별할 수 있습니다. 그렇지 않으면, hemolyzed 표본은 적혈구 전용 miRNAs의 검색을 통해 확인할 수 있습니다. 이후도 매우 낮은 비율의 용 혈 적혈구 관련 미르 레벨32에 상당한 증가 이끌어 낼 수 있습니다, Fortunato 외. 효율적으로 할 수 있는 16 miRNAs 비율에 따라 특정 혈 관련 서명 확인 플라즈마 샘플33용 혈을 분류 합니다. 모든 언급 한 분석 실험 흡 광도 비율 414/375부터 조합에서 사용 될 수 있습니다 및/또는 혈 관련 miRNAs 측정 품질 관리로 사후 분석 단계에서 사용할 수 있습니다 반면 HS 추가 비용 절약 사전 분석 단계에서 채택 단계입니다.
절연 및 RNA 순도 miRNAs 순환 추출 RNA 절차 이후 분석의 성공에 대 한 매우 영향력 있는 단계입니다. 플라즈마, 같은 낮은 입력된 샘플에서 시작 추출 miRNAs의 정확한 정량화를 위해 최대한 효율적 수 있어야 합니다. 플라즈마는 nucleases, 그리고 실시간 정량의 다운스트림 효소 반응을 방해할 수 및 순환 miRNAs 검출에 영향을 미칠 수 있는 다른 구성 요소를 포함 하 여 많은 단백질의 높은 농도 의해 특징입니다. 여러 추출 방법 연구의 이러한 종류에서 사용 되었습니다 하지만 일반적으로, RNA 농축 실리 카 기반 이어서 유기 추출 플라즈마 억제제 더 나은 다음 TRIzol 혼자35의 제거할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 지난 몇 년 동안, 수동 추출 자동된 추출에 의해 대체 되었습니다. 오염, 높은 재현성 및 경제 시간 사용의 사소한 위험 수동 격리 프로토콜에 비해 자동화 시스템의 주요 장점이 있습니다. 또한, 자동된 추출 방법 혈액 샘플 및 수동 프로토콜36에 비해 높은 효율에서 가장 높은 miRNA 금액을 굴복.
정규화 문제 플라즈마 미르 레벨의 정규화는 여전히 논쟁의 문제입니다. 사실, 샘플 품질 또는 수량에 차이가 존재 또는 질병, 따라서 선도 모호한 데이터 해석 하 고 잘못 된 결론의 위험으로 인 한 miRNAs 식 레벨에서 진정한 변화의 식별 방해할 수 있습니다. 지금까지 합의의 부족은 다양 한 표준화 전략37에 결과 있다.
플라스마 견본에서 추출 총 RNA는 일반적으로 형광 기반 분 광 광도 법, 자외선 분 광 광도 법 등 표준 정량화 방법의 임계값 아래 따라서 RNA 대량 표준화38을 제외. 따라서, eluted RNA의 고정 된 금액 보다는 오히려 고정된 볼륨 RT 반응39에 대 한 입력으로 선택 되어야 한다.
MiRNA 분석용 조직 샘플에서 사용 하는 성적 증명서를 내부 관리, RNU48 및 RNU6, 같은 적합 하지 않습니다 extracellular 미르 측정, 표준화로 그들은 둘 다 항상 순환, RNase 중재 저하40, 때문에 감지 되지 않습니다. 그리고 또한 질병 특정 방식으로37에 폐지. 어떤 순환 miRNAs 참조 컨트롤 효과적으로 사용 될 수 있는 경우에 명확 하지 않다. 예를 들어 미르-16은 자주 청소, 하지만 d에 대 한 제안ifferent 연구 암 환자28,37의 플라즈마 샘플에 폐지 됩니다 나타났습니다. 또한, 미르-16 레벨은 혈30높은 영향을.
높은 처리량 분석에 대 한 몇몇 miRNAs 측정 하 고 평균 식 값에 정규화는 일반적으로 인정 된41, miRNAs의 제한 된 수 분석 해야 할 때,이 정규화 방법을 적용할 수 없습니다. 정규화 문제를 우회 하기 위하여 Boeri 외. 이전 24 miRNAs28중 상호 비율에 따라 알고리즘을 설립. 이러한 접근 방식은, 진단 도구 개발에 대 한 매우 유용한 임에도 불구 하 고는 쉽게 miRNAs 종양 개발에 역할을가지고 가능 하 게 하 고 따라서 작동 교정기로 miRNAs 식별 변경 효과적으로 구별 허용 하지 않습니다. 비 앙 키 외. 폐 암 조기 발견을 위한 혈 청 미르 테스트를 개발 하는의 그룹에 의해 채택 된 또 다른 효과적인 전략, 6 "가사 혈 청-miRNAs" 적은 샘플 들을 다양 한 그룹의 기 평균에 정상화 기반 및 환자42의 클래스입니다.
미르-기반 액체 생 검 및 잠재적인 응용 프로그램의 기능 MSC 플라즈마 기반 분자 비-침략 적 테스트 무거운 흡연 자에서 폐암의 조기 진단을 위한 공부입니다. MSC 테스트 높은 감성 (SE, 87%)와 부정적인 예측 값 (NPV, 99%) 폐 암 탐지 LDCT, 여 전에 중간 또는 높은 위험 과목을 확인할 수 있습니다. 특히, MSC LDCT 혼자2919.7%에서 3.7%, 거짓 양성 결과 줄임으로써 LDCT 심사를 구현 수 있습니다. MSC 시험 때만 폐 암 환자, 좋은 전조 성능을가지고 또한 표시 하거나 다른 임상 병리학 매개 변수43,44와 함께 모니터링 도구로 사용 될 수 있는. 잠재적으로, MSC 테스트 폐 암 진단 알고리즘, 따라서 심사 비용 감소의 더 일관성을 사용 수 있습니다.
MSC, 외 조기 폐 암 발견에 대 한 다른 비-침략 적 테스트 보고 되었습니다. 비 앙 키 외. 순환 미르 테스트 34-미르 서명45에 따라 다음 13 미르 서명42감소를 제안 했다. 가져온 혈 청 샘플 fordiscovery 및 유효성 검사에서 지속적인 관찰의 흡연 과목 (우주) LDCT 재판, 심사는 유럽 기관의 종양학 (IEO, 밀라노, 이탈리아)에서 수행. 미르-테스트 위험이 높은 자원 봉사자 폐 암 탐지에 대 한 78% 정확도를 보였다. 13 혈 청 miRNAs와 MSC를 구성 하는 24만 5 miRNAs (92a 미르, 미르-30b, 미르-30 c, 미르-148a, 및 미르-140-5 p) 겹친 했다. 이 다른 유형의 샘플 (플라즈마 대 혈 청)을 시작 하 고 데이터 동화 예정 될 수 있습니다. 사실, 미르-검정, 혈 청, 내부 관리로 서 행동 저자 선택한 6 miRNAs는 3이 있었다 MSC 미르 비율 (미르-15b, 미르-19b와 미르-197) 또한 포함. 그럼에도 불구 하 고, 플라스마에 있는 MSC와 혈 청 샘플 더 미르 테스트 깊이 폐암의 검출에 대 한 미르 기반 액체 생을 사용 하 여를 확인합니다.
폐 암 바이오 마커의 식별에 대 한 프로 파일링 MiRNAs가 래 샘플46또한 수행 하고있다. 가 래를 쉽게 수집할 수 있습니다 고 미르 식 수준에 매우 안정적인 것으로 나타납니다. 그러나, 폐 암 심사 자원 봉사자 50-55 년 보다 오래 하 고 COPD, 따라서가 래를 어렵게 만드는 등 공동 morbidities와 무거운 흡연 자. 실제로, 다른 체액 중 플라즈마로 miRNAs의 잠재적인 역할을 조사 하는 가장 좋은 대안 중 하나입니다 (에 국한 되지 않는) 폐 암 바이오 마커.
전반적으로, 현재의 종이에 설명 된 절차 (암, 신 경계 및 심혈 관 질환 또는 당뇨병)에서 조사 하는 병 리의 종류에서와의 목적에 제한 없이 다양 한 질병의 맥락에서 관련 될 수 있습니다. 임상 (진단, 예 지, 또는 치료에도 반응에 대 한 바이오 마커)를 사용 합니다.

폐 암은 가장 흔히 진단 암 모든 암 진단1의 약 25%, 전세계. 지난 2 년간, 주로 감소 담배 사용으로 인해 폐암 사망 율에 있는 꾸준한 감소에도 불구 하 고 폐암 남성과 여성 모두에서 암 사망의 주요 원인이 남아 있습니다. 2017 년, 약 25%와 미국 및 유럽, 각각1,2에서 전체 암 사망자의 20%에 대 한 계정에 예언 된다.
때문에 증상 초기 질병에서 일반적으로 발생 하지 않습니다, 폐 암의 대부분 늦은 단계에서 진단 됩니다. 치료 적 개입 및 치료3의 가난한 효능에 대 한 제한 된 가능성을이 끈다. 따라서, 많은 과학적인 노력 조기 폐 암 발견에 대 한 효과적인 테스트 식별 겨냥 된다.
시험 검사의 다양 한 저 선 량 컴퓨터 단층 촬영 (LDCT) 초기 단계 폐암 암4검출을 위한 방사선에 비해 더 나은 도구는 계산 하는 반면 가슴 방사선 폐 암 검 진에 값은 보여 줍니다. 또한, thatscreening LDCT의 사용으로 감소 폐 암 사망률 현재와 전 무거운 흡연 자5중 최대 20%까지 표시 되었습니다. 이러한 데이터는 여러 전문 단체4,6지침에 정의 된 대로 높은 위험 인구에 폐 암 검사의 사용을 지원.
메모, LDCT 심사에 대 한 중요 한 관심사 중의 허위-긍정적인 결과 및 과다 진단의 높은 비율이 이다. 그렇게 되 고, 과학계는 보고 이러한 문제를 극복 하 고 LDCT 검사의 특이성을 증가 하는 전략에 대 한. 비-침략 적 보완 마커의 개발 여기 유용할 수 있었다. 날짜 하려면, 광범위 한 조사를 받고, miRNAs, 셀 무료 DNA, 유전자 메 틸 화, 작은 단백질 등 바이오 마커 후보 목록이 있다7.
혈액 기반 바이오 마커, miRNAs, 순환 및 면역 반응 생체를 포함 하 여는 고급 유효성 검사 단계8를 도달 하는 그. 면역 반응 생체 두 세포와 표면 종양 항 원에 대 한 면역 반응 폐 암 환자9에 내장은 지식을 기반으로 합니다. 예를 들어, Ajona 외. C4d, 진단 및 폐암 암10의 예 후에 고아 한 보충 통로의 저하 제품의 역할을 평가. 그렇지 않으면, 상용 자가 혈 청 테스트 7 종양 관련 항 원 비 작은 세포 폐 암 환자에서 검증 되었고 감의 36%와 91%의 특이성11을 검사 합니다. 면역 반응 생체 흥미로운, 하지만 추가 유효성 검사 연구는 잠재적인 임상 응용 프로그램에 필요한.
miRNAs는 내 생 적인 작은 비 코딩 RNAs 보존된 메커니즘 및 동물 및 식물 왕국 전 큰 기능적 중요성. 단백질 번역을 규제 하는 miRNAs의 역할: 그들은 대상 유전자12의 큰 세트의 식을 억 누르다. 그것은 잘 문서화 되었습니다 변경 ofmiRNAs' 식 가장 인간의 암12,,1314의 병 인에 기여. 또한, 종양 및 stromal 세포 릴리스 miRNAs, microvesicles에 또는 플라스마와 혈 청15,16,17 소변 등의 체액으로 RNA 의무적인 단백질에 협회를 통해 그들의 설립에 의해 안정 , 그리고 타 액18. 호스트 응답 및 종양의 microenvironment19의 동적 상호작용 miRNAs 순환 따라서 반영 수 있습니다. 함께 찍은이 관측 만들었습니다 순환 miRNAs 인간 암의 검출에 대 한 생체의 유망한 클래스를.
다른 방법을 사용 하 여 검출 될 수 있다 순환 miRNAs: microarray 플랫폼20, 양적 반전 전사 PCR (RT-정량)21, 그리고 다음 세대 시퀀싱 (NGS)14,22. 앞서 언급 한 기술에 기반한 다양 한 식 프로필 연구 지난 몇 년 동안에서 개발 되었습니다. Microarray 높은 처리 기술, 하나의 단일 분석 결과 miRNAs의 수천까지 분석할 수입니다. 그러나, 그것은 낮은 동적 범위와 실시간 정량 또는 NGS에 비해 특이성 있다. 또한, microarray 비 양적 방법, 따라서 더 실험적인 확인이 필요. 계열 기반 방법을 알 수 없는 miRNAs의 식별 수 있으며 검색 단계에 특히 적합. 다른 한편으로, NGS 방법 아직도 비싸다 및 특별 한 장비 및 전문가 bioinformaticians, 따라서 큰 유효성 검사 동료 및 임상 설정23그들의 사용을 제한 할 거. 순간, 실시간 정량 Pcr 순환 진단/임상 컨텍스트24에서 미르 검색 위한 가장 채택한 플랫폼입니다. 다른 실시간 정량 Pcr 기술 miRNAs 분석에 사용할 수 있지만 TaqMan PCR 뒤 줄기 루프 RT는 가장 널리 사용 되25. 이 기술은 매우 민감하고 정확 하다 (단일 뉴클레오티드 차별)는 높은 동적 범위; 그러나, 그것은 알려진된 miRNAs만의 검색 수 있습니다.
예측에 관한 품질 관리 외. 광범위 하 게 miRNAs26세 상술 한 기술 따라 프로 파일링에 대 한 몇 가지 상용 플랫폼의 특성을 조사 하는 Mestdagh에 의해 (miRQC 연구) 연구. 분석 함으로써 조직 및 혈 청 샘플에서 196 miRNAs, 재현성, 정밀도, 특이성, 및 차동 식의 용어 색인 다른 플랫폼의 성능을 평가 했다. 결과 NGS를 기반으로 하는 플랫폼 및 microarray 기술 했다 높은 재현성 및 특이성, 하지만 실시간 정량 플랫폼 더 정확 하 고, 민감한, 특히 몸 같은 낮은 입력된 RNA 샘플에 대 한 높은 탐지 율을 했다 나타났습니다. 체액입니다. 따라서 실시간 정량 일상적인 임상 진단에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 가장 적합 한 방법이 될 것으로 보인다.
2011 년, Sozzi 그 외 여러분 첫 번째 LDCT screeningtrial (INT IEO 재판)27 에 등록 된 자원 봉사자와 24 miRNAs 순환 간의 상호 비율에 의해 구성 된 4 개의 miRNA 서명에서 수집 된 플라즈마 샘플의 miRNA 프로 파일 분석 생성 되었다. 이러한 서명 했다 어떤을 가진 환자에서 질병 자유로운 개인을 차별 할 수 또는 치명적인 폐암 LDCT 질병 탐지28전에 시간 또는 최대 2 년. 더 종이에서 처음 설명 같은 그룹으로 3 단계의 위험에 환자를 충 하기 위해서는 4 개의 miRNA 서명은 결합 하 여 얻은 미르 서명 분류자 (MSC),:, 중간, 높고 낮은. 그것의 임상 유틸리티 가벼운 심사 재판, 비교 관찰 팔29연례 또는 격 년제 LDCT 팔 무작위 연구에서 1000 명 이상의 개인의 대형 회고전 세트에서 확인 했다. 실제로, MSC 및 LDCT 조합 감소에 의해 LDCT 거짓 양성 율 약 5 번 하 고 3 개의 MSC 위험 그룹은전반적인 생존 연관 된.
"피코 IRCCS Istituto Nazionale 데이 Tumori"에서 2013 년에 나중에, (밀라노, 그것) 예비 심사 시험 (BioMILD) 기반으로 MSC 테스트 시작 된 플라즈마 LDCT 구현. BioMILD 평가판에 등록 자원 봉사자 LDCT 및 혈액 철수를 즉시 미르 사용자 정의 만든된 미세 카드를 사용 하 여 프로 파일링에 대 한 플라즈마를 별도의 처리를 받 다. LDCT 및 msc와 결과의 조합은 특정 알고리즘24심사 정의 합니다.
현재 작업에서 BioMILD 시험에 사용 되는 전체 방법론 프로토콜 설명, RNA 추출, 플라즈마 절연, 혈액 샘플 컬렉션에서 시작 하 고 실시간 정량 미세 카드를 만든 사용자 지정 사용 하 여 프로 파일링 24 miRNAs 식. 높은 일관성과 재현성을 감안할 때, 이러한 절차 사용할 수 있습니다 또한 다른 질병에서 액체 biopsies 미르 기반 개발에 대 한.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; PBS 1개&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE-17-516</td><td></td></tr><tr><td>20xTE 버퍼, pH 8.0</td><td>분자 프로브</td><td>T11493</td><td>20X 주식 용액을 최종적인 농도로 희석하여 Nuclease-free water Nuclease-free water&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC miRNA 조직 키트&nbsp;</td><td>Promega</td><td>AS1460</td><td>키트에는 균질화 용액, DNase I, Proteinase K, 용해 버퍼 및 카트리지가 포함되어 있습니다. 1-티오글리세롤의 경우 흡입 및 피부 및 눈과의 접촉을 피해야 합니다. 흄 캐비닛 아래에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA 역전사 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 TaqMan RT 프라이머 풀&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4459649</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 프리앰프 마스터 믹스 2X&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>커스텀 TaqMan&nbsp; 프리앰프 풀&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4459657</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4440048</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 TaqMan 어레이 MicroRNA 카드&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td>는 <td>샘플을 로드하기 전에 맞춤형 TaqMan Array MicroRNA 카드를 실온으로 가져갈</td><td>4449137</td></tr><tr><td>있습니다. Vacutainer Safety-Lock 혈액 수집 세트&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>367286-364815</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer 플라스틱 스프레이 코팅 K2EDTA 튜브.&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>라벤더 BD 헤모가드 클로저&nbsp;</td></tr><tr><td>큐벳 PS 세미 마이크로&nbsp;</td><td>폭스바운드/PBI</td><td>&nbsp; 643-0326</td><td>광 경로 10 mm</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c UV-VIS 분광광도계</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic 바이알 1.5 ml&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359033</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>원심분리기를 4도로 가져옵니다. C 플라즈마 수집 시작 전</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3S+ 원심분리기</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-37520</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer T- 쉐이커</td><td>Euroclone&nbsp;</td><td>A00564</td><td>써모 믹서를 37도로 가져오세요. C RNA를 시작하기 전에&nbsp; 추출</td></tr><tr><td>Maxwell RSC Instrument</td><td>Promega</td><td>AS4500</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR 시스템 9700 thermo-cycler&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR 시스템&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 RUO 소프트웨어&nbsp;</td><td>써모 피셔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arrey 카드 스테이커/실러</td><td>써모 피셔</td><td>4331770</td><td></td></tr></tbody></table>

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (msc)의 경험

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

최소 침 습 테스트, 액체 생 검 등의 전 임상 단계에서 조기 폐 암 발견에 대 한 개발은이 치명적인 질병의 결과 개선 하기 위해 중요 합니다. MicroRNAs (miRNAs)는 조직의 특정, 작은, 비 코딩 RNAs 생물학 신호의 extracellular 메신저 역할을 할 수 있는 유전자 발현 조절 종양 및 그 주변 microenvironment 사이 잡담에서 파생 된. 그들은 따라서 폐암의 조기 발견을 위한 이상적인 후보자를 대표할 수 있었다. 이 작품에서는, 재판 심사 폐암에 등록 자원 봉사자의 플라즈마 샘플의 사용자 지정 만든된 미세 카드 및 양적 실시간 PCR를 사용 하 여 순환 미르 테스트의 예비 유효성 검사에 대 한 방법론 워크플로 제안 합니다. 또한, 기술적인 문제와 일반적인 혈 관련 miRNAs의 릴리스 분석에 영향을 미칠 수 있습니다, 이후 표준 운영 절차에 포함 된 품질 관리 단계도 제공 됩니다. 프로토콜과 재현할 수는 신뢰할 수 있는 양적 결과; 그러나, 큰 임상 시리즈를 사용 하면 사전 분석 및 분석 기능 수 신중 하 게 평가 한다.

BioMILD 평가판은 무거운 흡연 자 개인의 큰 일대에 첫 줄 스크린 테스트로 결합된 LDCT MSC 접근의 효율성을 테스트 목적으로 폐암의 조기 발견에 대 한 예비 연구. 위험의 클래스 24 플라즈마 순환 miRNAs 간의 비율을 평가 하는 miRNA 테스트에 근거 하 여 각 자원에 기인 된다. 크게 보고30,,3132, 혈 혈액 세포에 의해 miRNAs의 일반적인 릴리스 때문 잘못 된 결과 얻을 수 있기 때문에, 미르, 순환의 분석에 대 한 중요 한 문제입니다. 제안 된 방법론 워크플로에서 미리 분석 품질 관리 단계 ( 표 1에 QC1) 식별 하 hemolyzed, 그리고 따라서 비-analyzable, 플라즈마 샘플 설명 했다. 그림 1 hemolyzed (그림 1A)와 각각 A414/A375 값 (그림 1B) 플라즈마 샘플 비 hemolyzed의 spectrophotometric 분석을 보고합니다. 임상 맥락에서 분자 테스트의 결과이 QC1 수 자원 관리를 위한 중요 한 했다 혈액 샘플링을 반복 하 고, 대부분의 경우에서 복원 샘플.
분자 처리 후 실시간 정량 성능 정확 하 게 어떤 기술적인 문제를 식별 하기 위해 평가 되어야 한다. 그림 2 A 낮은 성능 때문에 가난한 수동 기준 신호 실시간 정량 Pcr을 보여줍니다. 이 경우에 새로운 미세 카드 사전 증폭 제품을 다시 로드 하는 것이 좋습니다. 실시간 정량 Pcr 그림 2B, 잘, 수행할 때 카드 미르 식 값 비교 역사적인 측정 되도록 처음 게시물 분석 품질 관리 단계로 진행 (QC2 표1에서). QC2 단계가 실패 하면 기술적인 문제가 발생 했을 수 반전 녹음 방송 또는 사전 증폭 반응에 그리고 반전 녹음 방송에서 시작 하는 전체 분자 처리를 반복 하는 것이 편리.
품질 관리의 마지막 단계 ( 표 1에 QC3) 평가 또한 분자 수준에서 용 혈. (미르-16, 미르-451, 미르-486-5 p, 그리고 미르 92a) 4 적혈구 관련 miRNAs의 식 수준을 비교 했다 4 비 혈 관련된 miRNAs (미르-126, 미르-15b, 미르-221, 및 미르-30b)의 그들에 의해 구성 혈 관련 미르 서명 생성에 16 (4x4) 미르 비율. 긍정적인 샘플 hemolyzed, 부정적인 샘플 프로토콜 섹션 9 및 그림 3에 설명 된 대로 최종 MSC 위험 수준 분류를 진행 하는 동안으로 분류 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig1.jpg"> 
그림 1: 신선한 혈장 샘플의 spectrophotometric 분석. (A) 2 hemolyzed의 spectrophotometric 프로필 고 (B) 2 hemolyzed 비 플라즈마 샘플, 파장 A414 및 A375 사이의 흡 광도 비율을 측정. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig2.jpg"> 
그림 2 : 미세에서 실시간 정량 성능 카드 분석. 증폭 및 multicomponent (A)을 비교 가난 하 고 (B) 좋은 품질 미세 카드 플롯 합니다. 모든 24 miRNAs와 단일 exemplifying 미르는 각 패널에 보고 됩니다. Multicomponent 작이 실시간 정량 Pcr 반응에서 발생 하는 수동 기준 신호를 보여 줍니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56326/56326fig3.jpg"> 
그림 3: 위험 계층에 대 한 MSC 알고리즘. 자원 봉사자 6 플라즈마 샘플을 고려 하는 대표적인 결과 재판 심사 BioMILD에 등록. (A) 위험 질병 (RD), 위험 적극적인 질병 (RAD), 질병 (PD), 적극적인 질병 (패드), 그리고 플라즈마 샘플에 대 한-80 ° C에 저장 된 해당 컷오프 값 (log2)의 존재의 존재의의 미르-비율 ' 서명 최소 1 주 및 5 주까지. (B) 조합 높은 (H)에서 analyzable 샘플 충 4 서명을의 (I), 중간 및 낮은 (L) MSC 위험 수준. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56326/56326fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기, 우리 조기 폐 암 발견에 대 한 순환 예측에 관한 서명 분류자 테스트를 수행 하는 시험 검사는 BioMILD에 채택 하는 상세한 프로토콜 제시.

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

이 절차의 전반적인 목표는 50세 이상의 심한 흡연자의 폐암 발병 위험을 결정하기 위해 24개의 혈장 순환 microRNA의 수준을 측정하는 것입니다. 이러한 방법은 위양성 노드의 수와 과잉 진단을 줄임으로써 조기 폐암 발견을 위한 저선량 컴퓨터 단층 촬영 선별 프로그램의 비용 효율성을 높일 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 분자 실험실을 채택한 표준 장비로 microRNA를 분비하는 것을 쉽게 측정할 수 있다는 것입니다.이 방법에 대한 아이디어는 종양 미세환경이 폐암 발병에 미치는 영향을 연구하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. MicroRNA는 숙주의 반응과 종양과 미세환경 사이의 동적 상호작용을 반영합니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 이러한 유형의 분자 분석을 위해 따라야 하는 표준 운영 절차를 더 잘 이해하는 데 중요합니다.이 프로토콜을 시작하려면 Vacutainer 튜브를 사용하여 10ml의 전혈 샘플을 수집하십시오. 실온에서 보관하십시오. 열 쇼크 및 세포 용해를 방지하기 위해 전혈을 섭씨 4도와 같은 낮은 온도에서 보관하지 마십시오.이는 특정 microRNA 방출로 이어집니다. 1시간 이내에 플라즈마를 원심분리하여 분리합니다. 림프구 고리와의 접촉을 피하십시오.상등액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 동일한 조건에서 상등액을 원심 분리하십시오. 이 혈장 상등액 1ml를 1.5ml 극저온 바이알에 분취하되, 튜브 바닥에서 혈장 분획이 수집되지 않도록 주의하십시오.RNA 분리를 시작하려면 각 샘플에 대해 200마이크로리터의 혈장에 200마이크로리터의 사전 냉각 OMG 용액을 추가합니다. 15-30 초 동안 완전한 균질화 와류를 보장합니다. 샘플을 균질화하려면 샘플당 200마이크로리터의 용해 버퍼와 25마이크로리터의 단백질 ASK를 추가하고 20초 동안 와류를 사용합니다.그런 다음 온도 믹서에서 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, RSC mi-RNA Tissue 방법을 선택하고 핵산 자동 추출기의 데크 트레이에 각 샘플에 대한 카트리지를 로드하고 플런저를 적절하게 배치합니다. 용해물을 옮기고 5마이크로리터의 DNase one 용액을 기기 카트리지의 적절한 위치에 추가합니다.각 용출 튜브의 바닥에 60마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 자동 정제를 시작하려면 실행을 시작합니다. 총 RNA 샘플을 섭씨 80도에서 보관하십시오.Taq miroRNA 역전사 키트를 사용하여 RNA를 CDNA로 전환하려면 관심 mi-RNA와 함께 Taq RT 프라이머 도구를 사용하십시오. 얼음 위에 놓인 1.5ml 튜브에 키트 지침에 따라 RT 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 샘플당 총 RNA 3마이크로리터를 최종 부피 15마이크로리터에 추가합니다.얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 마지막으로 thermocycler에 샘플을 로드하고 RT 반응을 실행합니다. 그런 다음 각 RT 반응 생성물 2.5마이크로리터를 Taq Master Mix 2X 및 Custom Taq 풀과 혼합합니다.뉴클레아제가 없는 물을 25마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다. 특정 열 프로파일을 사용하여 thermocycler에서 사전 증폭 반응을 수행합니다. 그런 다음 175마이크로리터의 0.1 XTE PH 8.0을 첨가하여 각 제품을 희석합니다.먼저, 1.13마이크로리터의 희석된 사전 증폭 샘플을 0.5ml 튜브에 2X Taq Universal Master Mix와 혼합합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물을 넣으십시오. 8개 샘플에서 24개의 특정 miRNA의 혈장 수준을 동시에 측정하려면 384웰 미세유체 맞춤형 Taq 어레이 microRNA 카드를 사용하십시오.카드에서 PCR 반응 혼합물을 사용하여 최대 8개의 반응을 로드합니다. 커스텀 카드를 311배 G로 2분 동안 원심분리하고 어레이 카드 실러로 밀봉합니다. 마지막으로 카드를 실시간 PCR 시스템에 놓고 실시간 PCR 반응을 실행합니다.데이터를 외삽하고 분석하려면 적절한 소프트웨어를 사용하고 원시 CT 값을 얻습니다. 백그라운드 신호를 제거하도록 자동 기준선을 설정하고 모든 분석 및 샘플에 대해 0.15의 고정 임계값을 설정합니다. 혈액 세포에 의한 miRNA의 비특이적 방출로 인한 잘못된 결과가 발생할 수 있는 분석 불가능한 용혈된 혈장 샘플을 식별하기 위해 사전 분석 품질 관리 단계를 수행해야 합니다.파장 A414와 A375 사이의 흡광도 비율을 측정하는 플라즈마 샘플의 분광광도계 분석은 용혈된 분석 불가능한 샘플과 비용혈된 샘플의 차이를 보여줍니다. 기술적 문제를 식별하기 위해 RT-QPCR 성능을 평가합니다. 4개의 고품질 미세유체 카드는 낮은 성능의 RT-QPCR을 초래하며, 이 경우 사전 증폭 제품을 새 미세유체 카드에 다시 로드해야 합니다.좋은 품질의 미세유체 카드는 우수한 성능을 발휘하며, 그런 다음 두 가지 사후 분석 품질 관리 단계를 거칩니다. 품질 관리 단계를 수행한 후 microRNA 시그니처 분류기를 적용합니다. MSC를 구성하는 miRNA 비율의 4가지 시그니처가 생성됩니다.질병의 위험, 공격적인 질병의 위험, 질병의 존재 및 공격적인 질병의 존재. 네 가지 시그니처를 결합함으로써 위험 수준은 최종적으로 낮음, 중간 또는 높음으로 정의됩니다. 섭씨 80도에서 일주일 동안 플라즈마를 보관하는 것을 제외하고 이 기술을 마스터하면 10시간 안에 완료할 수 있습니다.8개의 시료를 동시에 분석합니다. microRNA 시그니처 분류기는 지금까지 BioMed Lancaster Screening Trial에 등록된 4,000명 이상의 지원자로부터 수집한 10,000개 이상의 샘플에서 테스트되었습니다. 잠재적으로 이러한 테스트를 통해 진단 알고리즘의 일관성을 높일 수 있습니다.또한 검진 비용도 절감됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 암 진단 및 기타 심각한 질병에 대한 바이오마커로 사용하기 위해 순환하는 miRNA 수준을 측정할 수 있도록 잘 이해해야 합니다.

microrna-based-liquid-biopsy-experience-plasma-mirna-signature

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 특정 유전자 발현을 측정하기 위해 항체 마이크로어레이를 사용하여 miRNA 형질 주입된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술을 설명합니다. 특색지어진 프로토콜에서는 세포 주기 및 혈관 신생을 중단하는 데 있어 조합 miRNA 치료의 활성 식별을 위해 항체 마이크로어레이를 수행합니다.

항체 마이크로어레이: miRNA 처리된 폐암 세포의 단백질 발현을 연구하는 기술

MicroRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 조직 특이적이고 작은 비암호화 RNA이며 폐암의 조기 발견에 이상적인 후보가 될 수 있습니다. 주요 프로토콜에서는 조기 폐암 검진을 위해 환자의 혈액 샘플에서 microRNA를 분리할 것입니다.

miRNA 추출: 혈장 샘플에서 miRNA를 추출하는 방법

혈장 분리 엑소좀은 조기 발견 및 질병 진행을 위한 바이오마커의 검출 및 추적 관찰을 위한 비침습적이고 반복 가능한 방법으로 사용할 수 있습니다. 이 동영상은 비소세포폐암 환자의 혈장 샘플에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 DNA 및 단백질 추출에 사용될 수 있습니다.

엑소좀 분리: 비소세포폐암 환자의 혈장에서 엑소좀을 분리하는 기법

이 비디오는 유기 추출과 유리 섬유 컬럼 농축을 사용하여 대장암 환자의 혈장 샘플에서 순환 microRNA를 추출하는 방법을 설명합니다. miRNA는 혈청 및 혈장과 같은 생물학적 유체에서 안정적이므로 암 진단, 예후, 치료 의사 결정 및 모니터링을 위한 이상적인 순환 바이오마커입니다. 이 방법은 환자의 임상 결과를 예측할 수 있는 새로운 순환 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

순환 miRNA 추출: 유기 추출 및 Small RNA 농축을 통해 혈장 샘플에서 miRNA를 분리하는 방법

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

이 프로토콜은 순환하는 miRNA 오염을 방지하고 NSCLC에서 miRNA의 바이오마커 기능을 평가하기 위해 Proteinase K 및 RNAse 처리와 함께 상용 엑소좀 분리 키트를 통해 NSCLC 환자의 혈장에서 방출되는 엑소좀에서 miRNA 프로파일링을 수행할 수 있는 가능성을 설명합니다.

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 &#39;플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

전임상 시험에서 인간 대상 시험으로 전환되는 새로운 약물 표적을 식별하는 것은 과학적인 우선 순위입니다. 이를 위해 여기에서는 유전자 고갈이 암 세포주 스페로이드에 미치는 영향을 조사하기 위한 기능적 유전체학 접근 방식을 설명하며, 이는 생체 내에서 인간 암을 보다 적절하게 모델링합니다.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

학습하세요 혈장 microRNA 측정을 통한 폐암 조기 검진 방법입니다. 50세 이상 중흡연자의 폐암 위험도를 분류하여 CT 검사의 위양성을 줄이고 비용 효율성을 높입니다.

예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

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