예측에 관한 기반 액체 생 검: 플라즈마 미르 폐 암 검 진에 대 한 서명 분류자 (MSC)의 경험

이 절차의 전반적인 목표는 50세 이상의 심한 흡연자의 폐암 발병 위험을 결정하기 위해 24개의 혈장 순환 microRNA의 수준을 측정하는 것입니다. 이러한 방법은 위양성 노드의 수와 과잉 진단을 줄임으로써 조기 폐암 발견을 위한 저선량 컴퓨터 단층 촬영 선별 프로그램의 비용 효율성을 높일 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적인 분자 실험실을 채택한 표준 장비로 microRNA를 분비하는 것을 쉽게 측정할 수 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 종양 미세환경이 폐암 발병에 미치는 영향을 연구하기 시작했을 때 처음 떠올랐습니다. MicroRNA는 숙주의 반응과 종양과 미세환경 사이의 동적 상호작용을 반영합니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 이러한 유형의 분자 분석을 위해 따라야 하는 표준 운영 절차를 더 잘 이해하는 데 중요합니다.

이 프로토콜을 시작하려면 Vacutainer 튜브를 사용하여 10ml의 전혈 샘플을 수집하십시오. 실온에서 보관하십시오. 열 쇼크 및 세포 용해를 방지하기 위해 전혈을 섭씨 4도와 같은 낮은 온도에서 보관하지 마십시오.

이는 특정 microRNA 방출로 이어집니다. 1시간 이내에 플라즈마를 원심분리하여 분리합니다. 림프구 고리와의 접촉을 피하십시오.

상등액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 동일한 조건에서 상등액을 원심 분리하십시오. 이 혈장 상등액 1ml를 1.5ml 극저온 바이알에 분취하되, 튜브 바닥에서 혈장 분획이 수집되지 않도록 주의하십시오.

RNA 분리를 시작하려면 각 샘플에 대해 200마이크로리터의 혈장에 200마이크로리터의 사전 냉각 OMG 용액을 추가합니다. 15-30 초 동안 완전한 균질화 와류를 보장합니다. 샘플을 균질화하려면 샘플당 200마이크로리터의 용해 버퍼와 25마이크로리터의 단백질 ASK를 추가하고 20초 동안 와류를 사용합니다.

그런 다음 온도 믹서에서 섭씨 37도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, RSC mi-RNA Tissue 방법을 선택하고 핵산 자동 추출기의 데크 트레이에 각 샘플에 대한 카트리지를 로드하고 플런저를 적절하게 배치합니다. 용해물을 옮기고 5마이크로리터의 DNase one 용액을 기기 카트리지의 적절한 위치에 추가합니다.

각 용출 튜브의 바닥에 60마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 자동 정제를 시작하려면 실행을 시작합니다. 총 RNA 샘플을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

Taq miroRNA 역전사 키트를 사용하여 RNA를 CDNA로 전환하려면 관심 mi-RNA와 함께 Taq RT 프라이머 도구를 사용하십시오. 얼음 위에 놓인 1.5ml 튜브에 키트 지침에 따라 RT 반응 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 샘플당 총 RNA 3마이크로리터를 최종 부피 15마이크로리터에 추가합니다.

얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 마지막으로 thermocycler에 샘플을 로드하고 RT 반응을 실행합니다. 그런 다음 각 RT 반응 생성물 2.5마이크로리터를 Taq Master Mix 2X 및 Custom Taq 풀과 혼합합니다.

뉴클레아제가 없는 물을 25마이크로리터의 최종 부피에 추가합니다. 특정 열 프로파일을 사용하여 thermocycler에서 사전 증폭 반응을 수행합니다. 그런 다음 175마이크로리터의 0.1 XTE PH 8.0을 첨가하여 각 제품을 희석합니다.

먼저, 1.13마이크로리터의 희석된 사전 증폭 샘플을 0.5ml 튜브에 2X Taq Universal Master Mix와 혼합합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물을 넣으십시오. 8개 샘플에서 24개의 특정 miRNA의 혈장 수준을 동시에 측정하려면 384웰 미세유체 맞춤형 Taq 어레이 microRNA 카드를 사용하십시오.

카드에서 PCR 반응 혼합물을 사용하여 최대 8개의 반응을 로드합니다. 커스텀 카드를 311배 G로 2분 동안 원심분리하고 어레이 카드 실러로 밀봉합니다. 마지막으로 카드를 실시간 PCR 시스템에 놓고 실시간 PCR 반응을 실행합니다.

데이터를 외삽하고 분석하려면 적절한 소프트웨어를 사용하고 원시 CT 값을 얻습니다. 백그라운드 신호를 제거하도록 자동 기준선을 설정하고 모든 분석 및 샘플에 대해 0.15의 고정 임계값을 설정합니다. 혈액 세포에 의한 miRNA의 비특이적 방출로 인한 잘못된 결과가 발생할 수 있는 분석 불가능한 용혈된 혈장 샘플을 식별하기 위해 사전 분석 품질 관리 단계를 수행해야 합니다.

파장 A414와 A375 사이의 흡광도 비율을 측정하는 플라즈마 샘플의 분광광도계 분석은 용혈된 분석 불가능한 샘플과 비용혈된 샘플의 차이를 보여줍니다. 기술적 문제를 식별하기 위해 RT-QPCR 성능을 평가합니다. 4개의 고품질 미세유체 카드는 낮은 성능의 RT-QPCR을 초래하며, 이 경우 사전 증폭 제품을 새 미세유체 카드에 다시 로드해야 합니다.

좋은 품질의 미세유체 카드는 우수한 성능을 발휘하며, 그런 다음 두 가지 사후 분석 품질 관리 단계를 거칩니다. 품질 관리 단계를 수행한 후 microRNA 시그니처 분류기를 적용합니다. MSC를 구성하는 miRNA 비율의 4가지 시그니처가 생성됩니다.

질병의 위험, 공격적인 질병의 위험, 질병의 존재 및 공격적인 질병의 존재. 네 가지 시그니처를 결합함으로써 위험 수준은 최종적으로 낮음, 중간 또는 높음으로 정의됩니다. 섭씨 80도에서 일주일 동안 플라즈마를 보관하는 것을 제외하고 이 기술을 마스터하면 10시간 안에 완료할 수 있습니다.

8개의 시료를 동시에 분석합니다. microRNA 시그니처 분류기는 지금까지 BioMed Lancaster Screening Trial에 등록된 4,000명 이상의 지원자로부터 수집한 10,000개 이상의 샘플에서 테스트되었습니다. 잠재적으로 이러한 테스트를 통해 진단 알고리즘의 일관성을 높일 수 있습니다.

또한 검진 비용도 절감됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 암 진단 및 기타 심각한 질병에 대한 바이오마커로 사용하기 위해 순환하는 miRNA 수준을 측정할 수 있도록 잘 이해해야 합니다.