Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

이 이미징 장치 제작의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유충의 상처 치유에 대한 현미경 분석을 위한 수정 가능한 플랫폼을 만드는 것입니다. 이 방법은 콜라겐 섬유 재편성의 기여도 및 손상 후 후속 조직 재생에 대한 세포 반응과 같은 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상처 입히기와 이미징이 단일 장치 내에서 발생하는 반면 꼬리 재성장은 장치에 의해 방해받지 않는다는 것입니다.

또한 zWEDGI의 여러 기능 구획은 다양한 유충 단계와 일련의 실험 프로토콜을 수용하기 위해 독립적으로 수정할 수 있습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 원하는 형상과 속성으로 장치의 PDMS 구성 요소를 모델링합니다. 포토폴리머 3D 프린터를 사용하여 금형을 인쇄한 후 미세한 브러시, 스프레이 병의 변성 알코올 및 압축 공기를 사용하여 금형을 청소합니다.

경화되지 않은 수지, 특히 마이크로 채널 영역의 모든 재료를 부드럽게 문질러 제거합니다. 그런 다음 경화되지 않은 수지는 제브라 피시 유충에 독성이 있으므로 UV 후경화 장치에서 각 측면에서 60분 동안 금형을 후경화합니다. 200방 사포를 사용하여 모든 천장 표면이 사포와 접촉할 때까지 평평한 표면에 금형의 캐비티 면을 샌딩합니다.

400 및 600 그릿 사포로 가볍게 사포질을 점진적으로 하여 금형의 모든 형상 면에 걸쳐 매끄럽고 평평한 표면을 생성합니다. 그런 다음 다이얼 표시기를 사용하여 샌딩 후 캐비티의 깊이를 측정하여 설계 깊이에 가까운지 확인합니다. 금형과 유리 커버 디스크를 물을 채운 초음파 세척기에 30분 동안 넣거나 흐르는 물에 씻어내어 청소합니다.

이소프로필 알코올과 여과된 압축 공기를 사용하여 금형과 덮개를 청소하고 건조시킵니다. 공기 중 파편으로 인한 오염을 최소화하기 위해 장치를 제작할 장소로 깨끗한 벤치를 준비합니다. 플라스틱 컵에 베이스와 활성제를 5:1의 비율로 부어 PDMS를 만듭니다.

나무 공예 스틱으로 2분 동안 잘 섞어 빵을 반죽하듯 젤을 저어줍니다. 모든 거품이 사라질 때까지 25-45분 동안 진공 데시케이터에서 혼합물의 가스를 제거합니다. 그런 다음 10ml 주사기를 사용하여 주형이 반월판으로 약간 넘칠 때까지 각 3D 프린팅 금형의 캐비티에 약 0.75ml의 PDMS를 채웁니다.

채워진 곰팡이를 45분 동안 가스를 제거하여 채울 때 형성되었을 수 있는 추가 기포를 제거합니다. PDMS로 채워진 주형 위에 유리 커버 디스크를 적용하고 디스크를 비스듬히 눌러 기포가 갇히지 않도록 합니다. 유리 디스크 커버를 적용할 때 과도한 PDMS를 배출할 수 있습니다.

그런 다음 작은 래칫 클램프를 사용하여 커버 디스크를 금형에 단단히 고정합니다. 효율성을 위해 멀티 클램프 장치를 사용할 수 있습니다. PDMS 장치와 클램핑된 금형을 섭씨 100도의 오븐에서 최소 90분 동안 경화합니다.

그런 다음 오븐에서 곰팡이를 제거하고 쉽게 다룰 수 있을 때까지 식히십시오. 경화된 PDMS 장치가 포함된 금형을 벤치 바이스에 고정하여 금형의 형상이 작업 스테이션 벤치와 평행하게 위를 향하도록 합니다. 팁이 평평한 핀셋을 사용하여 금형에서 PDMS 당김 탭을 분리하여 PDMS 장치를 제거하기 시작합니다.

그런 다음 핀셋으로 금형 둘레를 작업합니다. PDMS는 섭씨 90도에서 최소 100분 동안 경화되어야 하며, 그렇지 않으면 끈적끈적한 상태로 금형에 달라붙습니다. 장치를 충분히 오래 경화했다는 좋은 표시는 금형과 PDMS 장치 사이의 계면에서 실제로 기포가 표시되어 쉽게 제거될 것임을 나타냅니다.

여과된 압축 공기와 핀셋을 사용하여 당김 탭을 잡고 장치 아래에 공기를 불어넣어 금형에서 장치를 부드럽게 들어 올립니다. 다음으로, PDMS 장치를 유리 바닥 접시의 덮개 안쪽에 거꾸로 놓아 구속 터널 쐐기가 플라스틱에 닿도록 합니다. 그런 다음 거꾸로 된 zWEDGI가 있는 접시 덮개와 해당 유리 바닥 접시를 내부 유리가 위를 향하도록 플라즈마 클리너에 넣습니다.

압력이 500밀리토르에 도달할 때까지 플라즈마 세척실을 비웁니다. 무선 주파수 또는 RF 전력을 높음으로 설정하고 장치와 접시를 약 2분 동안 RF 주파수에 노출시킵니다. 그런 다음 챔버의 압력을 천천히 낮추고 장치와 접시를 클린 룸 후드로 되돌립니다.

접시 덮개에서 PDMS 장치를 제거합니다. 그런 다음 PDMS zWEDGI를 유리 바닥 접시의 중앙 웰에 조심스럽게 배치하여 유리의 올바른 방향으로 뒤집습니다. PDMS가 유리에 접착되도록 하려면 핀셋의 뒤쪽 끝을 사용하여 마이크로 채널의 미세한 형상 주위에 압력을 가하여 PDMS를 가장자리 쪽으로 매끄럽게 만듭니다.

PDMS 장치를 가볍게 눌러 기포가 장치 아래에 갇히지 않도록 합니다. 접시에 70% 에탄올을 넣고 마이크로피펫을 사용하여 구속 터널을 포함한 채널을 헹굽니다. 그런 다음 에탄올을 제거하고 이중 증류수를 사용하여 장치를 두세 번 헹구고 자연 건조시킵니다.

채널을 탈지유로 채우고 실온에서 10분 동안 장치를 배양하여 접시의 유리 덮개 슬립에 유충이 달라붙는 것을 최소화합니다. 그런 다음 장치를 이중 증류수에 여러 번 부드럽게 담그어 헹구고 거꾸로 자연 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 마취한 후 몇 마이크로리터의 트리카인 E3를 사용하여 장치의 채널을 미리 적십니다.

넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 유충 한 마리를 집어 로딩 채널에 넣습니다. 그런 다음 피펫 팁 또는 유사한 도구를 사용하여 등쪽이 적재실의 직선 가장자리를 향하고 꼬리가 구속 터널을 향하도록 적재실에서 유충의 방향을 지정합니다. 상처 입음실에서 액체를 조심스럽게 빼내어 유충이 구속 터널로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다.

유충 주변의 수분을 유지하면서 대부분의 액체를 제거하십시오. 유충은 대부분의 액체가 제거되므로 구속 터널 안으로 적절하게 방향을 잡아야 합니다. 그러나 유충 주변에 충분한 액체가 남아 있어야 합니다.

방향은 아가로스를 첨가한 후에 조정할 수 있지만 아가로스가 응고되기 전에 수행해야 합니다. 트리카인 E3에 1%LMP 아가로스를 피펫으로 주입하여 적재실을 채우고 아가로스가 적절한 위치에서 유충과 함께 응고되도록 합니다. 수분 유지를 위해 필요에 따라 상처 챔버에 트리카인 E3를 추가합니다.

그런 다음 나머지 두 채널에 대해 이 로딩 프로세스를 반복합니다. 주사기 바늘을 사용하여 구속 터널을 통해 상처 입혀진 방으로 스며든 아가로스를 조심스럽게 제거합니다. 상처 부위, 단기 이미징 또는 상처 치료 격리를 위해 아가로스 위에 트리카인 E3를 더 첨가하십시오.

상처 입는 방에 있는 유충을 감으려면 멸균 메스 칼날을 사용하여 꼬리 지느러미를 노토코드 뒤쪽으로 절단합니다. 필요한 경우 트리카인 E3를 추가하고 배양 접시 뚜껑을 교체합니다. 마취된 유충이 있는 zWEDGI 장치를 60mm 유리 바닥 접시를 수용할 수 있는 스테이지 인서트의 도립 현미경에 설치합니다.

가장 위쪽 채널에서 유충의 꼬리를 찾고 꼬리가 원하는 위치에 놓이도록 필요에 따라 접시를 회전시킵니다. 특정 실험에 필요한 유충을 이미지화합니다. 실험이 끝나면 현미경에서 zWEDGI 접시를 제거합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 유충과 한천을 제거한 후 앞에서 설명한 대로 에탄올과 증류수를 사용하여 zWEDGI를 청소하고 거꾸로 세워 자연 건조합니다. 덮개가 있는 장치를 서늘하고 건조한 곳에 보관하십시오. 다음은 2차 고조파를 위한 다광자 현미경 또는 꼬리 지느러미의 콜라겐 섬유에 대한 SHG 이미징을 사용하여 zWEDGI의 이미징 기능을 보여주는 이미지입니다.

상처를 입기 전에 SHG는 노토코드에서 지느러미 끝까지 바깥쪽으로 방사되는 콜라겐 섬유를 감지했습니다. 상처를 입은 직후, 수축된 지느러미의 끝과 지느러미의 중심 사이의 거리는 상처 이완과 함께 증가합니다. zWEDGI는 시간이 지남에 따라 3차원 데이터를 수집할 수 있도록 하여 세포외 기질의 구조에서 발생하는 동적 변화에 대한 보다 완전한 보기를 제공합니다.

데이터 수집의 3D 특성으로 인해 렌더링 소프트웨어를 사용하여 공간을 재구성할 수 있습니다. 이러한 재구성과 후속 회전 옵션은 핀의 수축 및 이완이 이미지 컬렉션의 XY 평면뿐만 아니라 수축된 상태의 위쪽 말림에서 꼬리가 평평해지기 때문에 Z축에서도 발생한다는 것을 보여줍니다. 재사용 가능한 금형이 인쇄되면 제작 기술을 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 경화하기 전에 PDMS에 기포가 갇히지 않았는지 확인하고 금형에서 장치를 제거하기 전에 장치를 충분히 경화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약물 또는 억제제의 존재가 상처 치유에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 국소 약물 적용, 항체 라벨링 또는 RNA 및 단백질 정제와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 상처 치유 분야의 연구자들이 제브라피시 유충의 콜라겐 역학, 면역 세포 반응 및 조직 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 zWEDGI를 제작하고 제브라피시 유충의 상처 및 라이브 이미징에 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포토폴리머 3D 프린팅 수지는 인간에게 유해하고 제브라피시에게는 유독하다는 사실을 잊지 마십시오. 경화되지 않은 3D 프린팅 부품을 취급하는 동안 장갑을 착용하고 안면 마스크를 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 하며, PDMS로 금형을 채우기 전에 프린트에 남아 있는 모든 수지가 경화되었는지 확인해야 합니다.