Name: Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 배우세요 zWEDGI 장치를 사용하여 Danio rerio 애벌레의 상처 치유 과정을 실시간으로 고해상도 이미징하는 방법. 이 기술은 조직 재생 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자 기본 프로젝트 자금 광학 및 전산 장비에 대 한 연구 및 실험실을 위한 Morgridge 학회에서 인정 하 고 싶습니다. 우리는 또한 NIH # R01GM102924에서 자금 인정 (아와 KWE). KH, JMS, RS, 아 KWE 잉태와 설계 연구. KH와 JMS DL, KP와 RS에서 지 원하는 모든 실험을 수행. KH, JS, RS, 아와 KWE 원고 쓰기에 공헌 했다.

참고: 기본 zWEDGI 디자인 2 ~ 4 일 후 수정 (dpf)와 매디슨 위스콘신 대학 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 zebrafish 애벌레에 대 한 공식화 했다.
 1. 디자인 및 3D 인쇄의 금형 원하는 형상 및 3d 모델링 소프트웨어 5 특성 장치 <ol><li>모델은 PDMS 구성 요소. 빈 형과 PDMS 부품의 어셈블리를 만들고 PDSM 부분에 해당 하는 금형에는 구멍을 만들어 PDMS 부분에 대 한 부정적인 형을 생성 합니다. 금형 ( 그림 2, 단계 1.1) 3D 인쇄는.stl 파일로 저장. 
	참고: 금형 디자인 여기에 제시 된 ( 그림 1) 스테레오 리소 그래피 형식 (.stl) 파일은 https://morgridge.org/designs/에서 다운로드할 수.</li>
	<li>인쇄 금형 photopolymer 3D 프린터 ( 그림 2, 단계 1.2)을 사용 하 여. 여러 개의 금형을 만들어 단일 인쇄에 가능 하다 면, 그래서 더 이상의 장치 주조 될 수 있다 PDMS의 단일 일괄 처리로. 
	참고: 예제는 0.075 m m 빔 직경 및 0.05 m m 층 두께, photopolymer 수 지 5를 사용 하 여 고해상도 모드에서 인쇄 했다.
	<ol><li>깨끗 한 금형을 부드럽게 문질러 제거 uncured 수 지 좋은 브러시, 스프레이 병, 그리고 압축 공기에서 변성 된 알콜을 사용 하 여. 아닌 지역에서 모든 자료를 제거.</li>
		<li>Uncured 사임 zebrafish 애벌레 10 독성으로 양쪽에 60 분 동안 UV 게시물 치료 장치에 금형을 치료 후.</li>
	</ol></li> <li>모든 씰링 표면을 사 포 (채널 형상 및 금형 경계 로드) 접촉까지 평평한 표면에 200 그 릿 샌드 페이퍼로 금형의 캐비티 쪽 모래. 가볍게 모래 종이로 400 및 600 모래 모래, 점차적으로, 부드러운 플러시 표면 ( 그림 2, 1.3 단계) 모든 형상 향함에 걸쳐 생산 하. 설계 깊이 가까이 있는지 확인 하는 다이얼 표시기와 사 포 후 구멍의 깊이 측정 합니다.
	<ol><li>금형을 청소 하 고 또는 실행 물 아래 홍 조는 초음파 청소기 30 분 물으로 채워진에 배치 하 여 디스크 (¼ 인치 두께 붕 규 산 유리 또는 아크릴 x 1 ¾ 인치 직경, 한 유리 형 당 커버) 커버.</li>
		<li>압축 공기 건조 날 려 두 금형을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 필터링 된 압축 공기 커버. 공 수 파편에서 오염을 최소화 하기 위해 장치를 조작 하는 곳으로 깨끗 한 벤치를 사용 합니다. 두고 청소 금형과 유리 커버 깨끗 한 벤치 또는 필요할 때까지 덮여 페 트리 접시.</li>
	</ol></li></ol> 2. ZWEDGI 장치의 PDMS 제조 <ol><li>붓는 184에 의해 확인 된 PDMS 실리콘 탄성 중합체입니다 (PDMS) 5:1 (기본 활성기를) 플라스틱 컵으로 비율에서. 빵 반죽 처럼, 자체에 이상 젤 감동 나무 공예 막대기로 2 분 동안 잘 혼합. 5 금형 기지의 고 활성의 2 세대 10 g 사용 하 여.
	<ol><li>드 가스 혼합물 25-45 분 동안 진공 desiccator에 모든 거품이 사라 때까지.</li>
		<li>PDMS 몰드를 약간 초승달 모양 ( 그림 2, 단계 2.1)와 오버플로 때까지 10 mL 주사기를 사용 하 여의 약 0.75 mL 각 3D 인쇄 된 금형의 캐비티를 채울.</li>
		<li>드 가스 채울 때 형성 수 있습니다 추가 거품 제거 45 분 채워진된 금형.</li>
	</ol></li> <li>PDMS 가득 금형 위에 유리 커버 디스크 적용, ( 그림 2, 단계 2.2) 갇혀 각도 거품을 방지 하기 위해 디스크를 누르고. 디스크 커버 유리 적용 되어 퇴 학 초과 PDMS 허용.</li>
	<li>사용 금형에 단단히 커버 디스크를 작은 래치 드 클램프. 
	참고:이 PDMS은 치료 하 고 3D 인쇄 형상 유리 커버 슬립을 플러시는 구멍을 통해 생산 평평한 표면을 만듭니다. 또는 한 번에 완 치 될 수 있는 장치 수를 늘리려면, 구축 멀티 클램프 장치 (예를 들어. 그림 2, 단계 2.3).</li>
	<li>는 PDMS 장치 100 o C 오븐에서에 클램핑 된 금형에 90 분 ( 그림 2, 단계 2.4)에 대 한 치료. 금형을 오븐에서 제거 하 고 쉽게 처리할 수 있습니다 때까지 시원한를. 클램핑 장치 금속 인 경우에, 금속 치료 PDMS 잔여 열 때문에 계속 하지 않도록 클램프에서 형과 커버 디스크 어셈블리 제거. 
	참고: 장치는 아직도 약간 따뜻하고 완벽 하 게 치료 하는 동안 금형에서 제거 하는 가장 쉬운. 그러나, 일단 금형 오븐에서 제거 하 고 커버 디스크 제거, 장치 demolding를 진행 하기 전에 며칠에 앉을 수 있습니다. 경우 장치는 경화 오븐에서 제거 직후 demolded는, 그것을 완벽 하 게 치료를 하면서 오염 물질을 최소화 하기 위해 덮여 페 트리 접시에 배치.</li>
</ol> 3. 유리 접시 플라즈마 결합 zWEDGI <ol><li>클램프 형 벤치 악에서 PDMS 장치를 포함 하 되도록 금형 &#39; s 형상 직면 하 고, 병렬 작업 역 벤치에.
	<ol><li>시작 평면 밀고 핀셋을 사용 하 여 금형에서 PDMS 당김 탭을 해제 하 여 PDMS 장치를 제거 하려면. (( 그림 2, 단계 3.1) 팬에서 케이크를 제거) 처럼 핀셋으로 금형의 둘레의 주위에 일.</li>
		<li>사용 압축 공기 및 핀셋 부드럽게 당김 탭을 잡고 장치에서 공기를 불어 하는 금형 장치를 필터링. 작업 천천히, 수 있도록 공기 별도 금형에서 PDMS, 얇은 터널 섹션 주위는 핀셋의 끝으로 특별 한 돌.</li>
	</ol></li> <li>금지 터널 웨지 ( 2 그림, 3.2 단계) 플라스틱 만지고 있다 그래야 유리 바닥된 접시의 커버의 안쪽에 거꾸로 PDMS 장치 장소.</li>
	<li>는 거꾸로 zWEDGI와 해당 유리 바닥된 접시 접시 커버에 자리는 플라즈마 청소기 내부 유리 위 ( 그림 2, 단계 3.3).
	<ol><li>플라즈마 챔버 압력 500 mTorr에 도달할 때까지 청소를 철수.</li>
		<li>세트 높은 무선 주파수 (RF) 전력. 장치를 노출 하 고 약 2 분에 대 한 RF 주파수로 접시 천천히 드 챔버 압력에 그리고 반환 장치 및 접시는 클린 룸 후드.</li>
	</ol></li> <li>접시 커버에서 PDMS 장치를 제거. 족집게의 백 엔드를 사용 하 여 신중 하 게 <ol><li>유리 하단 접시 ( 그림 2, 3.4 단계)의 센터에 그것을 배치 하 여 유리에 올바른 방향 PDMS zWEDGI 이상의 플립, 가볍게는 PDMS에 눌러 공기 방울 되도록 장치 하지 아래 갇혀 있다. 마이크로 채널의 분 형상 주위 압력을 적용 하 고 ( 그림 5C) 가장자리에는 PDMS 부드럽게. 
		참고:는 PDMS와 유리 사이의 완벽 한 접촉 플라즈마 결합에서 더 좋은 준수를 보장합니다. ZWEDGI 장치는 플라즈마 유리 바닥 6 잘 같은 다른 바닥 유리 접시 형식에 보 세 수 있습니다.e ( 그림 2C).</li>
		<li>클린 룸 후드에서 제거 하기 전에 장치 접시 커버 장소. 
		참고: 장치 유리 수정 되었습니다, 일단 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 그들은 사용 하기 위해 준비가 될 때까지.</li>
	</ol></li></ol> 4. 채널 준비 및 로드 애벌레 참고: 일반 zebrafish 축산은 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html에서 온라인 Zebrafish 책, 사용할 수 당 실시 했다. 성인 제 브라와 배아 1 위에서 설명한 대로 유지 되었다. 야생 타입 AB 변형 사용 되었다. 기관에 따라 &#8217; 라이브 애벌레 이미징에 대 한 요구 사항에 관한 구체적인 동물 관리 프로토콜 s.
<ol><li>린스는 micropipette는 접근 금지를 통해 린스를 사용 하 여 채널당 100 µ L 70% 에탄올의 최소 채널 터널. 에탄올과 2 또는 3 배 두 배 증류수 린스를 제거 합니다. 건조 공기에 있습니다.</li>
	<li>접시의 유리 coverslip 애벌레의 준수를 최소화 하기 위해 실 온에서 10 분 (물에 희석 하는 1%의 농도)에 탈지 우유와 함께 채널을 채우기. 그런 다음, 부드럽게 여러 번을 씻어 두 배 증류수에 장치 잠수함. 수 있게 공기 건조 거꾸로. 
	참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. ZWEDGI 장치의이 준비는 사용 하기 몇 일 전에 할 수 있습니다. 스토어 실 온에서 커버.</li>
	<li>준비 1% 낮은 녹는 포인트 100 µ L 2와 100 µ L 2% 녹아 LMP agarose를 결합 하 여 (LMP) agarose E3 버퍼 11에 x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine-에틸 3-aminobenzoate) 미리 예 열을 38 o c. 1% 유지 38 o C 고 방지 하기 위해 뜨거운 블록에서에서 agarose/tricaine 솔루션. 
	참고: multiphoton 현미경 11 (예: 캐스퍼 12) 취소 안료 zebrafish 변종 중 하나를 사용 하 여 또는 0.2 m m N-phenylthiourea 색소 형성을 방지를 포함 하는 e 3에서 애벌레를 유지 가까운 적외선 파장의 색소에 의해 흡수를 최소화 하기 위해 11. 
	주의: N-phenylthiourea 독성이 있다. 기관에 따라 &#39; 처리에 대 한 s 규칙.</li>
	<li>Anesthetize 애벌레 E3에서 버퍼 포함 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) 11. 애벌레는 움직이지 않는 비 접촉 자극에 응답 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>사전 Tricaine/e 3의 약간 microliters와 채널 젖은.
	<li>선택 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 하나의 유 충을 <ol>. 로드 채널 ( 그림 3A)에 애벌레를 입금. 지 면 로드 챔버와 금지 터널 ( 그림 3B)으로 꼬리 얼굴 똑바로 가장자리는 로드 챔버에 유 충을 동양 피 펫 팁 또는 유사한 도구를 사용 하 여.</li>
		<li>신중 하 게 접근 금지 터널 ( 그림 3C) 흘러 유 충을 허용 부상 약 실에서 액체를 철회. 유 충 ( 그림 3D) 주위 수 분을 유지 하면서 액체의 대부분을 제거 합니다. 이 프로세스는 부상 챔버 쪽으로 약간 접시를 기울이기로 지원 수.</li>
	</ol></li> <li>Tricaine/E3에 1% LMP agarose를 배치 (~ 38 o C) 유 충을 통해 &#39; s 머리, 로드 챔버 ( 그림 3E) 작성. 적절 한 위치에 있는 애벌레를 공고히 agarose를 허용 합니다. 수 분을 유지 하기 위해 필요에 따라 Tricaine/E3 부상 챔버를 추가 합니다. 이 로드 나머지 2 채널에 대 한 프로세스를 반복.</li>
	<li>금지 터널을 통해 부상 챔버 ( 그림 3 층)로 새 어 모든 agarose를 조심 스럽게 제거 주사기 바늘을 사용 하 여. 추가적인 tricaine/E3 이상 (대 한 부상, 단기 영상, 또는 상처 치료 격리) agarose 중 추가 또는 (장기 영상)에 대 한 문화 접시를 채우기 위해. 증발을 방지 하기 위해 문화 접시 뚜껑을 교체 합니다. 애벌레는 (unwounded)이이 시점에서 몇 군데 수 있습니다 또는 부상.</li>
</ol> 5. 부상 및 이미징 애벌레 <ol><li>는 꼬리 지 느 러 미 ( 그림 3 G, H) 부상 챔버에서 notochord 11 후부 transect 살 균 메스 블레이드를 사용 하 여. 필요한 경우 추가 tricaine/e 3를 추가 하 고 문화 접시 뚜껑 교체. 
	참고: 또는, 관심의 발달 시간대에 따라, 애벌레 부상, E3에서 복구 수 고 수 원하는 영상 시간, 어떤 시점에서 그들은으로 채널에 로드 될 수 있습니다 때까지 인큐베이터 (28.5 o C)에서 유지 위에서 설명한.</li>
	<li>60 m m 유리 하단 접시를 수용할 것 이다 단계 삽입에는 거꾸로 한 현미경에 애벌레를 마 취를 zWEDGI 장치를 설치 합니다. 원하는 위치에 꼬리를 얻을 하는 데 필요한 접시를 회전 위 대부분 채널에서 유 충의 꼬리를 찾습니다. 특정 실험에 필요한 이미지. 
	참고:는 zWEDGI widefield 형광과 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 포함 하 여 고해상도 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 광범위 하 게 적용 됩니다. Zebrafish 애벌레, 이미징 때 매개 변수 고려 수 있다 하지만 특정 매개 변수를 이미징 악기, 샘플 및 종속 실험. 여기, 애벌레 꼬리는 다음 매개 변수를 활용 하 여 사용자 지정 빌드 multiphoton 현미경 5 , 11에 몇 군데: 긴 작업 거리 물 침수 목표, 890 nm 레이저 여기, X 40 445/20 nm 방출 필터 및 512 x 512 해상도.</li>
</ol> 6. 실험의 끝 <ol><li>제거 현미경에서 zWEDGI 접시. 얼음 물 목욕 또는 4 o C 적어도 20 분 동안에 zWEDGI를 배치 하 여 애벌레를 안락사 하 고 하트 비트 및 순환의 부재에 대 한 평가. 
	참고: 애벌레 별도 구획에 유지 되므로, 애벌레 복구할 수 있습니다 개별적으로 겸 자 또는 피 펫으로는 agar를 살짝 당겨. 한 머리 및 유 충 항 체 얼룩이 지기에 대 한 고정 등 추가 절차에 대 한 사용 또는 RNA 또는 단백질 추출에 대 한 처리에서 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>애벌레와 agar의 제거, 다음 에탄올 zWEDGI 청소와 증류수, 4.1 단계에서 설명한 대로 설정 거꾸로 공기 건조. 스토어 건조 위치에 덮여. 다음 사용 하기 전에 필요에 따라 다시 코트 탈지 우유 (4.2 단계)로. 
	참고: zWEDGIs 다시 사용할 수 있는 여러 번은 PDMS 유리 떨어져 올 때까지.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

ZWEDGI 장치의 목적은 안정화와 고해상도 현미경 목표의 작은 작업 거리 물고기 방향을 이미징 3D 시간 경과 잡으려고. 이러한 설계 사양을 충족 하는 동안 그것은 또한 개선 라이브 이미징에 대 한 전통적인 천 기반 준비 에입니다. 제대로 하지 발생할 수 있습니다 결함이 있는 장치는, zWEDGI의 제작에는 3 개의 중요 한 단계 (아래 참조) 있습니다.
PDMS 준비 (그림 5A)
거품 방지, PDMS 추가 된 후 금형을 드. 모든 거품 기체 제거 후 제거 되었습니다 확인 하는 유리 디스크의 응용 프로그램에 주의 지불 합니다. 유리 디스크 공기는 되지 트랩 되 고 있음을 아래와 PDMS 되도록 경사에 적용 되어야 합니다. 먼지 과정의 대부분 단계 중 문제가 될 수 있습니다. 먼지를 방지 하려면 철저 하 게 청소 각 단계를 완료 하 고 단계 사이의 깨끗 한 후드 부분을 저장 ...

Zebrafish 애벌레 Danio rerio 의 재생 용량 그들에 대 한 응답 상처 치유와 자라나1,2,,34검토 이상적인 모델 유기 체를 확인 합니다. 유전자 변형 zebrafish 라인과 zebrafish의 해부학 투명도 추가의 배열에 대 한 액세스 향상 장기 재생 프로세스4상처 응답 이벤트의 vivo에서 학문에 대 한 그들의 유틸리티. 따라서 고해상도 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이러한 생물 학적 과정의 연구는 생존 능력을 유지 하면서 높은 안정성과 제 브라 유 충의 최소한의 움직임을 허용 하는 라이브 이미징 zebrafish 장치를 요구 한다. 그것은 키 장치 허용 효과적인 부상 치유 하는 동안 재생 발생 장치에 의해 영향을 받지 않습니다.
라이브 영상 중 agarose에서 유 충을 포함의 표준 라이브 영상 안정화 방법 성장 제한 및 재생5 상처와 애벌레 4 후 심장 스트레스와 조직 괴 사의 기호를 표시 하기 시작 이후 사망률을 증가 시킬 수 있습니다. 시간4. 따라서, 관심 영역에서 agarose의 제거는 종종 정상적인 개발을 허용 하는 데 필요한 및 재생6, 애벌레는 agarose로 잠재적인 손상에 노출 버려야. 또한, 기술을 포함 하는 agarose와 사용자 해야 합니다 동양 짧은 시간에 애벌레는 agarose5,,67고형화 하기 전에. 신속 하 게 사용자의 요구 뿐만 아니라 유 충을 조작, 그것은 또한 유 충에 손상을 위험. 라이브 영상에 대 한 유 충을 안정화 하는 방법 등이 천 우물3 또는 divets8, 등 이러한 단점을 우회 하 설명 되었습니다 있지만 실리콘 진공의 사용 PVC 파이프 또는 기타 이미징 챔버를 만드는 그리스 자료6, 그리고 회전 튜브9를 이러한 방법의 많은 집중, 더러 워, 자주 재사용 노동 환경 조작에 대 한 허용 하지 않습니다 (약물 치료, 부상 등.) 물고기를 탑재.
따라서, zWEDGI 장치 (그림 1) 일부는 시료의 조작을 허용 하는 동안 zebrafish 애벌레의 장기 라이브 이미징 장착 한의 단점을 극복 하기 위해 설계 되었습니다. 로드, 구속, 부상 및 2 ~ 4 일 후 수정 zebrafish 애벌레의 이미징에 대 한 세 반 오픈 compartmentalized 챔버 (그림 1A) 허용 하는 zWEDGI에 의하여 이루어져 있었다. 장치입니다 (PDMS)에서 조작 이며 60 m m 유리 하단 이미징 접시의 커버 슬립에 배치. 그러나 여기에 제시 했다 위한 상처 치유 연구, 모듈형 설계 및 표준 제조 기술을 사용 하 여 만들 zWEDGI 디자인 수정 가능 하 고 다양 한 실험 절차, 특히 절차에 대 한 의무가 있는 실험적인 조작 및 장기적인 이미지와 최소한의 자제를 요구 한다.

<table><tbody><tr><td>Fabricate 금형</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solidworks Professional Accedemic Research 3D 모델링 소프트웨어</td><td>Dassault Systemes</td><td>SPX0117-01</td><td>Fisher Unitech</td></tr><tr><td>Viper Si2 SLA 3D 프린터</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23200-902</td><td>3D 시스템즈 Inc.</td></tr><tr><td>Accura 60 포토폴리머 수지</td><td>3D Systems Inc.</td><td>24075-902</td><td>3D 시스템즈 Inc.</td></tr><tr><td>변성 알코올</td><td>Sunnyside</td><td>5613735</td><td>Menards</td></tr><tr><td>UV 경화 후 장치</td><td>3D Systems Inc.</td><td>23363-101-00</td><td>3D 시스템즈 Inc.</td></tr><tr><td>TouchNTuff 니트릴 장갑</td><td>Ansell</td><td>92-600</td><td>McMaster Carr</td></tr><tr><td>220B, 400B, 600 그릿 T414 블루-백 사포&nbsp;</td><td>Norton</td><td>66261139359, 54, 52</td><td>MSC</td></tr><tr><td>붕규산 유리 디스크, 직경 2인치</td><td>McMaster-Carr</td><td>MIL-G-47033</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Branson</td><td>1510R-MTH</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 소독용 알코올 70%</td><td>Hydrox</td><td>54845T43</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>10oz 투명 플라스틱 컵</td><td>WNA 걸작</td><td>557405</td><td>아마존</td></tr><tr><td>6"공예 스틱</td><td>Perfect Stix</td><td>Craft WTD-500</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fabricate zWEDGI PDMS 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트&nbsp;</td><td>Dow-Corning</td><td>4019862</td><td>Ellworth 접착제&nbsp;</td></tr><tr><td>10mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>Vitality Medical Inc</td></tr><tr><td>데시케이터</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>F42027-0000</td><td>Amazon</td></tr><tr><td>4 in 래칫 바 클램프</td><td>Pittsburgh</td><td>68974</td><td>Harbor Freight</td></tr><tr><td>lab oven</td><td>Quincy Lab Inc.</td><td>20GC</td><td>글로벌 산업용</td></tr><tr><td>핀셋 세트</td><td>Aven</td><td>549825</td><td>McMaster-Carr</td></tr><tr><td>압축 공기 여과 노즐</td><td>Innotech</td><td>TA-N2-2000FT</td><td>클린룸 공급</td></tr><tr><td>진공 벤치 바이스</td><td>Wilton Tool Group</td><td>63500</td><td>MSC 산업용</td></tr><tr><td>55mm 유리 바닥 접시; 30mm 마이크로 웰 #1.5 커버 유리</td><td>Cellvis</td><td>D60-30-1.5-N</td><td>Cellvis</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Loading Larvae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetteman, P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올 (사용 전 물로 70%까지 희석)</td><td>Pharmco-aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-5A</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>탈지유 분유</td><td></td><td>2902887</td><td>MP Biomedicals</td></tr><tr><td>이중 증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-phenylthiorurea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>트리카인 (에틸 3-아미노벤조에이트)</td><td></td><td>C-FINQ-UE</td><td>웨스턴 케미컬</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>열 블록 (건식 목욕 인큐베이터)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-2</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>E3 버퍼&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>대형 오리피스 피펫 팁, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-134</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>일반 목적 피펫 팁, 200 uL</td><td>Fisherbrand</td><td>21-197-8E</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>#15 메스 블레이드&nbsp;</td><td>Feather</td><td>2976</td><td>아마존</td></tr><tr><td>25G 주사기 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD305122</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 이미징 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Zebrafish 애벌레 발달 생물학 및 상처 치유에 대 한 중요 한 모형 유기 체 이다. 또한, zebrafish 애벌레 셀룰러 해상도 시간과 공간에 동적 생물 현상의 라이브 고해상도 현미경 이미징에 대 한 중요 한 시스템 이다. 그러나, 애벌레의 개발 및 조직 regrowth 라이브 이미징 agarose 캡슐화의 전통적인 방법 방해 수 있습니다. 따라서,이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치),이 설계 하 고 허용 하는 동안 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 애벌레 하 기능 compartmentalized 장치 조작 꼬리 지 느 러 미 transection 장치 및 후속 억제 꼬리 개발 시간과 다시 성장. 이 장치는 부상 및 생존 능력을 유지 하면서 장기적인 이미징에 대 한 수 있습니다. ZWEDGI 형 3D 인쇄는, 그 형상의 customizability 하기가 쉽게 다양 한 zebrafish 이미징 응용 프로그램에 대 한 수정. 또한,는 zWEDGI 실험 동안 유 충에 부상 또는 시 약의 응용 프로그램에 대 한 액세스와 같은 다양 한 혜택 paralleled 유선형된 이미징에 대 한 여러 애벌레의 방향 및 장치의 재사용성을 제공 합니다.

ZWEDGI PDMS 미세 장치 관련 된 부상 치유 그리고 zebrafish 애벌레에서 자라나는 꼬리 지 느 러 미의 라이브 영상 (아래)의 주요 기능 4 개를 수용 하도록 설계 된 기능 compartmentalized 장치가 이다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있기 때문에 그리고 업계 표준 금형에서 잘 작동 뿐만 아니라 생체 적합성, PDMS zWEDGI 제작을 위해 선택 되었다. 또한, PDMS 만드는 장치 재사용 가능한 하드 또는 날카로운 모서리의 무효 장치 형성 되 면. zWEDGI 특별히 이미징, 3)의 꼬리 지 느 러 미, 그리고 4) 현미경 이미징, 부상에 대 한 적절 한 방향에서 1) 장치에 애벌레, 2) 자제의 로드를 허용 아래에서 상세히 설명.
로드
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이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

이 이미징 장치 제작의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유충의 상처 치유에 대한 현미경 분석을 위한 수정 가능한 플랫폼을 만드는 것입니다. 이 방법은 콜라겐 섬유 재편성의 기여도 및 손상 후 후속 조직 재생에 대한 세포 반응과 같은 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상처 입히기와 이미징이 단일 장치 내에서 발생하는 반면 꼬리 재성장은 장치에 의해 방해받지 않는다는 것입니다.또한 zWEDGI의 여러 기능 구획은 다양한 유충 단계와 일련의 실험 프로토콜을 수용하기 위해 독립적으로 수정할 수 있습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 원하는 형상과 속성으로 장치의 PDMS 구성 요소를 모델링합니다. 포토폴리머 3D 프린터를 사용하여 금형을 인쇄한 후 미세한 브러시, 스프레이 병의 변성 알코올 및 압축 공기를 사용하여 금형을 청소합니다.경화되지 않은 수지, 특히 마이크로 채널 영역의 모든 재료를 부드럽게 문질러 제거합니다. 그런 다음 경화되지 않은 수지는 제브라 피시 유충에 독성이 있으므로 UV 후경화 장치에서 각 측면에서 60분 동안 금형을 후경화합니다. 200방 사포를 사용하여 모든 천장 표면이 사포와 접촉할 때까지 평평한 표면에 금형의 캐비티 면을 샌딩합니다.400 및 600 그릿 사포로 가볍게 사포질을 점진적으로 하여 금형의 모든 형상 면에 걸쳐 매끄럽고 평평한 표면을 생성합니다. 그런 다음 다이얼 표시기를 사용하여 샌딩 후 캐비티의 깊이를 측정하여 설계 깊이에 가까운지 확인합니다. 금형과 유리 커버 디스크를 물을 채운 초음파 세척기에 30분 동안 넣거나 흐르는 물에 씻어내어 청소합니다.이소프로필 알코올과 여과된 압축 공기를 사용하여 금형과 덮개를 청소하고 건조시킵니다. 공기 중 파편으로 인한 오염을 최소화하기 위해 장치를 제작할 장소로 깨끗한 벤치를 준비합니다. 플라스틱 컵에 베이스와 활성제를 5:1의 비율로 부어 PDMS를 만듭니다.나무 공예 스틱으로 2분 동안 잘 섞어 빵을 반죽하듯 젤을 저어줍니다. 모든 거품이 사라질 때까지 25-45분 동안 진공 데시케이터에서 혼합물의 가스를 제거합니다. 그런 다음 10ml 주사기를 사용하여 주형이 반월판으로 약간 넘칠 때까지 각 3D 프린팅 금형의 캐비티에 약 0.75ml의 PDMS를 채웁니다.채워진 곰팡이를 45분 동안 가스를 제거하여 채울 때 형성되었을 수 있는 추가 기포를 제거합니다. PDMS로 채워진 주형 위에 유리 커버 디스크를 적용하고 디스크를 비스듬히 눌러 기포가 갇히지 않도록 합니다. 유리 디스크 커버를 적용할 때 과도한 PDMS를 배출할 수 있습니다.그런 다음 작은 래칫 클램프를 사용하여 커버 디스크를 금형에 단단히 고정합니다. 효율성을 위해 멀티 클램프 장치를 사용할 수 있습니다. PDMS 장치와 클램핑된 금형을 섭씨 100도의 오븐에서 최소 90분 동안 경화합니다.그런 다음 오븐에서 곰팡이를 제거하고 쉽게 다룰 수 있을 때까지 식히십시오. 경화된 PDMS 장치가 포함된 금형을 벤치 바이스에 고정하여 금형의 형상이 작업 스테이션 벤치와 평행하게 위를 향하도록 합니다. 팁이 평평한 핀셋을 사용하여 금형에서 PDMS 당김 탭을 분리하여 PDMS 장치를 제거하기 시작합니다.그런 다음 핀셋으로 금형 둘레를 작업합니다. PDMS는 섭씨 90도에서 최소 100분 동안 경화되어야 하며, 그렇지 않으면 끈적끈적한 상태로 금형에 달라붙습니다. 장치를 충분히 오래 경화했다는 좋은 표시는 금형과 PDMS 장치 사이의 계면에서 실제로 기포가 표시되어 쉽게 제거될 것임을 나타냅니다.여과된 압축 공기와 핀셋을 사용하여 당김 탭을 잡고 장치 아래에 공기를 불어넣어 금형에서 장치를 부드럽게 들어 올립니다. 다음으로, PDMS 장치를 유리 바닥 접시의 덮개 안쪽에 거꾸로 놓아 구속 터널 쐐기가 플라스틱에 닿도록 합니다. 그런 다음 거꾸로 된 zWEDGI가 있는 접시 덮개와 해당 유리 바닥 접시를 내부 유리가 위를 향하도록 플라즈마 클리너에 넣습니다.압력이 500밀리토르에 도달할 때까지 플라즈마 세척실을 비웁니다. 무선 주파수 또는 RF 전력을 높음으로 설정하고 장치와 접시를 약 2분 동안 RF 주파수에 노출시킵니다. 그런 다음 챔버의 압력을 천천히 낮추고 장치와 접시를 클린 룸 후드로 되돌립니다.접시 덮개에서 PDMS 장치를 제거합니다. 그런 다음 PDMS zWEDGI를 유리 바닥 접시의 중앙 웰에 조심스럽게 배치하여 유리의 올바른 방향으로 뒤집습니다. PDMS가 유리에 접착되도록 하려면 핀셋의 뒤쪽 끝을 사용하여 마이크로 채널의 미세한 형상 주위에 압력을 가하여 PDMS를 가장자리 쪽으로 매끄럽게 만듭니다.PDMS 장치를 가볍게 눌러 기포가 장치 아래에 갇히지 않도록 합니다. 접시에 70% 에탄올을 넣고 마이크로피펫을 사용하여 구속 터널을 포함한 채널을 헹굽니다. 그런 다음 에탄올을 제거하고 이중 증류수를 사용하여 장치를 두세 번 헹구고 자연 건조시킵니다.채널을 탈지유로 채우고 실온에서 10분 동안 장치를 배양하여 접시의 유리 덮개 슬립에 유충이 달라붙는 것을 최소화합니다. 그런 다음 장치를 이중 증류수에 여러 번 부드럽게 담그어 헹구고 거꾸로 자연 건조시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 유충을 마취한 후 몇 마이크로리터의 트리카인 E3를 사용하여 장치의 채널을 미리 적십니다.넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 유충 한 마리를 집어 로딩 채널에 넣습니다. 그런 다음 피펫 팁 또는 유사한 도구를 사용하여 등쪽이 적재실의 직선 가장자리를 향하고 꼬리가 구속 터널을 향하도록 적재실에서 유충의 방향을 지정합니다. 상처 입음실에서 액체를 조심스럽게 빼내어 유충이 구속 터널로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다.유충 주변의 수분을 유지하면서 대부분의 액체를 제거하십시오. 유충은 대부분의 액체가 제거되므로 구속 터널 안으로 적절하게 방향을 잡아야 합니다. 그러나 유충 주변에 충분한 액체가 남아 있어야 합니다.방향은 아가로스를 첨가한 후에 조정할 수 있지만 아가로스가 응고되기 전에 수행해야 합니다. 트리카인 E3에 1%LMP 아가로스를 피펫으로 주입하여 적재실을 채우고 아가로스가 적절한 위치에서 유충과 함께 응고되도록 합니다. 수분 유지를 위해 필요에 따라 상처 챔버에 트리카인 E3를 추가합니다.그런 다음 나머지 두 채널에 대해 이 로딩 프로세스를 반복합니다. 주사기 바늘을 사용하여 구속 터널을 통해 상처 입혀진 방으로 스며든 아가로스를 조심스럽게 제거합니다. 상처 부위, 단기 이미징 또는 상처 치료 격리를 위해 아가로스 위에 트리카인 E3를 더 첨가하십시오.상처 입는 방에 있는 유충을 감으려면 멸균 메스 칼날을 사용하여 꼬리 지느러미를 노토코드 뒤쪽으로 절단합니다. 필요한 경우 트리카인 E3를 추가하고 배양 접시 뚜껑을 교체합니다. 마취된 유충이 있는 zWEDGI 장치를 60mm 유리 바닥 접시를 수용할 수 있는 스테이지 인서트의 도립 현미경에 설치합니다.가장 위쪽 채널에서 유충의 꼬리를 찾고 꼬리가 원하는 위치에 놓이도록 필요에 따라 접시를 회전시킵니다. 특정 실험에 필요한 유충을 이미지화합니다. 실험이 끝나면 현미경에서 zWEDGI 접시를 제거합니다.텍스트 프로토콜에 따라 유충과 한천을 제거한 후 앞에서 설명한 대로 에탄올과 증류수를 사용하여 zWEDGI를 청소하고 거꾸로 세워 자연 건조합니다. 덮개가 있는 장치를 서늘하고 건조한 곳에 보관하십시오. 다음은 2차 고조파를 위한 다광자 현미경 또는 꼬리 지느러미의 콜라겐 섬유에 대한 SHG 이미징을 사용하여 zWEDGI의 이미징 기능을 보여주는 이미지입니다.상처를 입기 전에 SHG는 노토코드에서 지느러미 끝까지 바깥쪽으로 방사되는 콜라겐 섬유를 감지했습니다. 상처를 입은 직후, 수축된 지느러미의 끝과 지느러미의 중심 사이의 거리는 상처 이완과 함께 증가합니다. zWEDGI는 시간이 지남에 따라 3차원 데이터를 수집할 수 있도록 하여 세포외 기질의 구조에서 발생하는 동적 변화에 대한 보다 완전한 보기를 제공합니다.데이터 수집의 3D 특성으로 인해 렌더링 소프트웨어를 사용하여 공간을 재구성할 수 있습니다. 이러한 재구성과 후속 회전 옵션은 핀의 수축 및 이완이 이미지 컬렉션의 XY 평면뿐만 아니라 수축된 상태의 위쪽 말림에서 꼬리가 평평해지기 때문에 Z축에서도 발생한다는 것을 보여줍니다. 재사용 가능한 금형이 인쇄되면 제작 기술을 3-4시간 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 경화하기 전에 PDMS에 기포가 갇히지 않았는지 확인하고 금형에서 장치를 제거하기 전에 장치를 충분히 경화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약물 또는 억제제의 존재가 상처 치유에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답하기 위해 국소 약물 적용, 항체 라벨링 또는 RNA 및 단백질 정제와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 상처 치유 분야의 연구자들이 제브라피시 유충의 콜라겐 역학, 면역 세포 반응 및 조직 재생을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 zWEDGI를 제작하고 제브라피시 유충의 상처 및 라이브 이미징에 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 포토폴리머 3D 프린팅 수지는 인간에게 유해하고 제브라피시에게는 유독하다는 사실을 잊지 마십시오. 경화되지 않은 3D 프린팅 부품을 취급하는 동안 장갑을 착용하고 안면 마스크를 사용하는 등의 예방 조치를 취해야 하며, PDMS로 금형을 채우기 전에 프린트에 남아 있는 모든 수지가 경화되었는지 확인해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

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우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

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살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

배우세요 zWEDGI 장치를 사용하여 Danio rerio 애벌레의 상처 치유 과정을 실시간으로 고해상도 이미징하는 방법. 이 기술은 조직 재생 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

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