로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 국소 표면 접착성의 나노 단위 제어를 허용하는 대규모 수상드리머 기반 불균일한 나노 패턴을 얻는 것입니다. 설명된 방법은 세포 접착 및 연골 생성 분화 연구에 적용됩니다. Dendrimer raised nanopatterns는 나노 스케일에서 표면 접착력을 국부적으로 제어할 수 있습니다.

세포 접착 RGD 펩타이드로 변형된 1세대 폴리나노머는 나노 패턴을 만드는 데 사용됩니다. 현미경 검사당 스캐닝 기술이 특징이며 세포 접착 및 분화 연구에 사용됩니다. 그런 다음 현미경 검사와 면역염색 기술의 결과를 분석합니다.

첫 번째 단계는 작업 기판을 준비하는 것입니다. 맞춤형 정사각형 유리 슬라이드는 다이아몬드 팁 커터로 현미경 슬라이드를 절단하여 생산됩니다. 1.25 x 1.25cm 크기의 슬라이드를 만듭니다.

슬라이드를 탈이온수로 세척한 다음 96% 에탄올을 넣고 자연 건조시킵니다. 압력 튜브에 PLLA 200mg을 추가하고 다이옥산 10ml를 추가하여 2%PLLA 용액을 준비합니다. 교반 막대를 추가하고 튜브를 단단히 닫습니다.

혼합물을 섭씨 60도의 글리세린 욕조에서 부드럽게 저어 24시간 동안 데웁니다. PLLA 용액이 들어 있는 유리 바이알에 유리 슬라이드를 섭씨 60도의 깨끗한 핫 플레이트에 놓습니다. 필요한 온도에 도달할 때까지 최소 10분 동안 기다립니다.

유리 슬라이드를 스핀 코팅기 스테이지에 놓고 선택한 프로그램을 실행하여 PLLA 솔루션으로 유리 기판을 스핀 코팅합니다. 우리는 3, 1의 가속도를 가진 30 초 동안 000 분당 회전수, 균질한 코팅을 지키기 위하여 초당 300 분당 회전수로 500 분당 회전수에 500 분당 회전수의 전 단계를 가진 초당 500 분당 회전수를 선정한다. 스핀 코팅된 유리잔은 냉장고에 보관할 수 있습니다.

탈이온수에서 RGD-Cys-D1 덴드리머의 밀리리터당 0.77mg 용액인 용액 A를 10분 동안 준비하고 초음파 처리합니다. 그런 다음 탈이온수에서 10에서 2% 및 10에서 5% 용액 B와 C의 수상수액을 각각 준비합니다. 용액 C를 10분 동안 초음파 처리하고 탈이온수에 다음 덴드리머 용액 D, E, F를 준비합니다.

용액 D, 2.5x10에서 8%용액 E, 10에서 8% 및 용액 F, 4 10에서 9%이 용액을 사용할 때까지 냉장고에 보관하십시오. 세포 배양실의 UV 램프로 18 PLLA 코팅 유리를 13분 동안 사용하여 멸균 상태로 만듭니다. 각 수상돌기 용액을 10분 동안 초음파 처리합니다.

세포 배양 캐빈 층류 아래의 12웰 플레이트에 있는 PLLA 코팅 유리 슬라이드의 0.22마이크로미터 직경 필터를 통해 덴드리머 용액을 필터링합니다. 실온에서 16시간 동안 객실 내부에 두었다가 멸균된 탈이온수로 씻으십시오. 양성 대조군 샘플의 경우, PBS에서 멸균 피브로넥틴 용액을 준비하고 세포 배양 캐빈의 실온에서 1시간 동안 용액과 함께 복제본을 배양합니다.

PBS로 씻으십시오. 나머지 3개의 PLLA 코팅 기판은 음성 대조군의 복제본 역할을 합니다. 나노패턴 지형은 공기 중에서 태핑 모드로 작동하는 AFM으로 분석됩니다.

미터당 40뉴턴의 스프링 상수와 300킬로헤르츠의 공진 주파수를 가진 실리콘 캔틸레버를 AFM 팁 홀더에 장착합니다. AFM 스테이지의 나노패턴 기판을 사용하여 접촉할 때까지 표면에 접근하고 표면에 과도한 압력을 가하지 않고 덴드리머 구성을 이미징할 수 있는 진폭 설정점을 선택합니다. 조건별로 3개의 독립적인 기판의 기판당 5x5 마이크로미터의 대표 이미지를 3개 이상 등록합니다.

획득한 이미지를 AFM 처리 소프트웨어로 처리합니다. 처리된 AFM 높이 영상에서 덴드리머를 선택하고 해당 영상 임계값을 구합니다. 입자 정밀도를 얻고 이를 사용하여 최소 입자 간 거리를 구합니다.

Z의 최소 입자 간 거리를 해당 입자 정밀도로 설정하여 최소 입자 간 거리에 대한 확률 제어 플러그를 얻습니다. 플롯의 색 스케일을 조정하여 국소 RGD 표면 밀도가 70나노미터 미만인 영역을 시각화합니다. 이미지에서 이러한 영역을 선택하고 임계값을 생성하여 이러한 영역의 영역을 정량화합니다.

초기 계대에서 중간엽 줄기 세포에서 유래한 상업용 인간 지방을 사용하며, 가급적이면 5 미만을 사용합니다. 줄기 세포 성장 배지에서 37도 및 4.6 % CO2 분위기에서 70 또는 80 % 합류점에 도달 할 때까지 배양합니다. 3의 세포 조밀도에 세포를 씨를 뿌린다, chondrogenesis 유도 매체에 있는 기질에 평방 센티미터 당 000의 세포.

3일마다 매체를 교체하십시오. 응축 단계는 배양 첫날부터 관찰할 수 있으며, 모든 배양 실험실에서 광학 위상차 현미경을 사용하여 그 진화를 이룰 수 있습니다. 실온에서 10% 포르말린 용액으로 세포를 20분 동안 고정한 후 PBS로 세척합니다.

PBS에 염화암모늄의 50밀리몰 용액을 추가하여 푸알데히드 그룹을 잠급니다. 실온에서 20분 동안 그대로 두십시오. PBS로 세척하십시오.

PBS에 있는 1%알부민의 막는 해결책에 있는 사포닌의 0.1%해결책으로 실온에 10분 동안 세포를 투과하십시오. 차단 용액의 1차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 세척하십시오.

차단 용액에 있는 2차 항체와 함께 실온에서 한 시간 동안 배양하여 빛 노출을 피하십시오. PBS로 씻고 말리십시오. 샘플에 현미경 장착 매체를 바르고 커버 슬립으로 부드럽게 덮습니다.

연골형성 유도 1일 후 국소 접착 단백질 paxillin에 대한 면역염색 샘플과 정립 컨포칼 현미경을 사용하여 연골형성 유도 5일 후 조기 연골형성 마커인 collagen II alpha I에 대한 면역염색 샘플을 이미지화합니다. 예를 들어 0.5 또는 1마이크로미터와 같은 대표 간격으로 단면을 수집합니다. 세포 응축물의 기저 영역에서 paxillin으로 염색된 이미지를 필터링합니다.

배경을 제거하고 매끄럽게 한 다음 8비트 파일로 변환합니다. 경험적으로 선택된 임계값을 설정하여 이진으로 만듭니다. 3개의 독립적인 샘플의 조건당 최소 3개의 세포 응축수를 처리합니다.

선택한 영역을 정량화하고 이를 이미지의 세포핵 수로 나눈 해당 면적 백분율로 표현합니다. collagen II alpha I 염색을 정량화하려면 컨포칼 Z 투영을 생성합니다. 결과 이미지를 필터링하고, 배경을 제거하고, 매끄럽게 하고, 임계값을 설정합니다.

해당 세포 응축수 면적에 대해 샘플당 투영 면적 최대 collagen II, alpha I 면적의 합을 정량화합니다. 용액의 초기 덴드리머 농도를 수정하여 다양한 나노 패턴 구성을 얻을 수 있습니다. 나노 패턴은 구성된 최소 입자 간 거리에 대한 AFM 분석 및 확률 윤곽 플롯으로 시각화할 수 있습니다.

그들은 가장 높은 국부 RGD 표면 밀도를 가진 표면의 영역을 강조합니다. Dendrimer 나노 패턴은 세포 접착 연구에 사용됩니다. 국소 RGD 표면 밀도에 따라 접착력이 증가합니다.

positive control 및 dendrimer 응집체를 포함하는 표면의 경우 이 상관 관계가 손실됩니다. 국소 RGD 표면 밀도의 영향은 연골 형성에서 테스트되었으며, 세포 응축과 분화는 모두 중간 접착성을 나타내는 나노 패턴에 의해 선호됩니다. 결론적으로, 세포 반응에 대한 국소 RGD 밀도의 영향을 해결하기 위한 3개의 테이블 방법에서 덴드리머 기반 나노패턴.

나노패턴은 세포 배양에 일반적으로 사용되는 해당 균질한 표면에서 세포 접착력을 보다 효율적으로 유지합니다. 분화 실험에서, 기질에 대한 세포의 중간 접착성은 중간엽 세포 응축과 조기 만성 분화를 선호했습니다. 덴드리머 말초 성장의 용이한 변형으로 인해, 여기에 설명된 방법은 세포에 밀도 영향을 미치는 모든 과도한 류마티스층으로 더욱 확장될 수 있습니다.