실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과

실시간 떨림 유도 변환 분석을 위한 이 프로토콜의 전반적인 목표는 자궁경부 분변 샘플에서 만성 소모성 질병 프리온을 민감하게 검출할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 대변에서 자궁경부 CWD 프리온이 언제 감염되는지와 같은 CWD 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특이적이고 민감하며 샘플의 높은 처리량을 가능하게 한다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 실험실 기술자인 Ginny Cheng이 맡을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 10ml의 대변 추출물 완충액이 들어 있는 튜브에 1g의 배설물을 추가합니다. 단백질에 대해 사전 설정된 프로그램이 있는 해리기를 사용하여 실온에서 1분 동안 배설물 펠릿을 균질화합니다.

배설물 샘플이 완전히 균질화될 때까지 이 작업을 2-3회 반복합니다. 그런 다음 파라필름을 사용하여 튜브를 밀봉하고 흔들 플랫폼이나 회전식 셰이커에 올려 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 실온에서 18, 000g에서 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 모아 1.5ml 튜브에 분취합니다. 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 인산나트륨 침전법을 시작하려면 분변 단백질 추출물 1ml에 사르코실(sarkosyl) 250

파라필름을 사용하여 튜브를 밀봉합니다. 튜브를 써멀 믹서에 넣고 섭씨 37도에서 1, 400rpm으로 계속 흔들면서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 10 % 포스 포 텅스텐 산 나트륨과 170 밀리 몰 염화 마그네슘을 함유 한 원액을 첨가하여 샘플에서 포스 포 텅스텐 산의 최종 농도가 3 %가되도록 샘플을 열 믹서로 옮기고 400 rpm에서 일정한 쉐이킹으로 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.

다음으로, 섭씨 14도에서 30분 동안 15, 800g에서 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 세척 버퍼에 다시 현탁시켜 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 14도에서 15분 동안 15, 800g에서 원심분리합니다.

상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 100마이크로리터의 RT-QuIC 희석 완충액에 재현탁합니다. RT-QuIC 분석을 수행할 준비가 될 때까지 처리된 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 먼저 0.032g의 티오플라빈 T를 10ml의 이중 증류수에 첨가하여 새로운 10밀리몰의 티오플라빈 T 원액을 준비합니다.

다음으로, 이중 증류수를 사용하여 1 밀리 몰 티오플라빈 T.0.2 마이크로 미터 디스크 필터가 장착 된 주사기를 사용하여 1 밀리 몰 티오플라빈 T 용액의 최종 농도를 1-10 희석합니다. 그런 다음 가장 재조합적인 프리온 단백질 기질을 해동합니다. 한 번에 500마이크로리터의 재조합 프리온 단백질 기질을 100kg Dalton 크기 배제 필터 마이크로튜브에 로드합니다.

14, 000g에서 실온에서 5분 동안 원심분리기. 그런 다음 용출된 기판을 멸균 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

다음으로, 저장된 RT-QuIC 희석 버퍼를 해동합니다. seed를 희석하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원액과 RT-QuIC 반응 혼합물을 준비합니다. 필터 팁이 있는 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 반응 혼합물을 혼합합니다.

혼합물을 50ml 처리 피펫팅 저장통에 붓습니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 98마이크로리터의 RT-QuIC 반응 혼합물을 96웰 광학 바닥 플레이트의 각 웰에 로드합니다. 각 반응에 2마이크로리터의 희석되지 않은 또는 10배 연속 희석된 대변 단백질 추출물을 추가합니다.

그런 다음 밀봉 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 섭씨 42도의 플레이트 리더에서 25시간 동안 배양하며, 700rpm에서 1분간 이중 궤도 흔들기와 배양 내내 1분 동안 휴식을 취하는 반복 주기로 합니다. 한편, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형광 측정 설정을 정의합니다.

25시간 후 플레이트 리더에서 플레이트를 제거합니다. 3, 000g에서 3분 동안 플레이트를 회전시켜 웰 사이의 잠재적인 오염을 방지합니다. 그런 다음 플레이트에서 씰을 제거합니다.

새로운 기질과 새로운 티오플라빈 T 형광 염료를 포함하는 90마이크로리터의 RT-QuIC 반응 혼합물을 첨가하여 새 플레이트를 준비합니다. 첫 번째 플레이트의 각 웰에서 새로 준비된 10웰 플레이트로 96마이크로리터를 옮깁니다. 밀봉 테이프를 사용하여 새 플레이트를 밀봉합니다.

형광 측정 설정을 정의한 후 추가로 50시간 동안 분석을 계속합니다. 15분마다 각 웰에 대한 Thioflavin T 형광 신호를 읽고 문서화합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 수집하고 플로팅합니다.

이 연구에서는 감염되지 않은 엘크 또는 노새 사슴의 배설물을 배설물 추출물 완충액에서 균질화하여 10%의 최종 샘플 농도를 얻은 다음 일부 균질산염을 처리하고 인산화텅스텐산나트륨 침전에 의해 10배 농축합니다. 정제된 샘플에서 자발적 전환의 감소가 보이지만, 모든 샘플은 CWD 양성 분변 샘플에서 낮은 형광 신호를 보였습니다. 프리온의 증폭을 개선하고 검출 감도를 향상시키기 위해 기질 교체 단계가 통합되었습니다.

RT-QuIC 프로토콜의 일부로 기질 교체를 거친 샘플은 18개 샘플 중 14개가 양성이고 음성 대조군 중 어느 것도 위양성으로 등록되지 않아 검출의 민감도와 특이도가 증가한 것으로 나타났습니다. 마스터링이 완료되면 분변 추출물 준비 및 PRP/SCRP 농도는 약 4시간 내에 완료할 수 있으며 RT-QuIC 분석은 적절하게 수행되면 약 1/1-2시간 내에 설정할 수 있습니다. 절차를 시도하는 동안 기판을 필터링하는 것을 기억하는 것이 중요하지만 절대 와류를 일으키지 않는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 다른 방법을 사용하여 프로테아제의 내성이 얼마나 우수한 생성물인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 프리온 연구 분야의 과학자들이 배설물 샘플을 테스트하여 살아있는 동물에서 프리온의 존재를 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 분변 추출물에서 PRP/SCRP를 준비하고 농축하는 방법과 민감하고 특이적인 프리온 검출을 얻기 위해 수정된 RT-QuIC 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

프리온으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 절차를 수행하는 동안 적절한 PPE를 착용하고 생물 안전 캐비닛 아래에서 작업하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오.