관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

이 방법의 전반적인 목표는 바이러스 게놈 관련 단백질의 단백체 분석을 위해 감염된 세포에서 단순 헤르페스 바이러스 1형 DNA를 정제하는 것입니다. 이 방법은 세포 요인과 헤르페스 바이러스 감염의 관여에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 감염된 세포에서 다양한 바이러스 DNA 집단을 직접 정제하도록 조정할 수 있어 감염의 여러 측면을 분석할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MRC 5개 세포를 배양하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 HSV-1을 콜드 트리스 완충 식염수 또는 TBS에 희석합니다. 다음 단계에서는 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 송풍기와 조직 배양 후드를 끄는 것이 중요합니다.

피펫을 사용하여 MRC 5 세포의 성장 배지를 멸균 병으로 옮겨 감염 후 세포에 다시 추가합니다. 7ml의 희석된 바이러스를 세포에 첨가하여 세포를 감염시킵니다. 실온에서 1시간 동안 10분마다 세포를 흔듭니다.

흡수 후 innoculum을 흡인하고 실온 TBS 50ml로 세포를 헹구고 원래 성장 배지를 교체하십시오. 그런 다음 5%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 바이러스 DNA 복제가 시작된 후, 감염 후 약 4시간 후에 바이러스 DNA 복제에 라벨을 붙입니다.

이를 위해 EdC를 1ml의 성장 배지에 희석하고 감염된 세포의 세포 배양 배지에 2-4시간 동안 첨가합니다. 핵을 채취하려면 성장 배지를 20ml의 핵 추출 완충액으로 교체하고 섭씨 4도에서 20분 동안 간헐적으로 흔들면서 배양합니다. 배양 후 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 핵을 긁어내고 얼음 위의 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

핵을 펠릿화하기 위해 2, 500 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기를 사용합니다. 원심분리 후 상층액을 폐기합니다. 10ml의 인산염 완충액 식염수 또는 PBS에 담긴 핵 펠릿을 부드럽게 제거하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 이전과 같이 샘플을 원심분리합니다. PBS를 완전히 제거한 후 10ml 피펫으로 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅하여 10ml의 클릭 반응 혼합물에 핵 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이전과 같이 핵을 펠릿화하기 전에 섭씨 4도에서 1시간 동안 샘플을 회전시킵니다.

빠른 반응 혼합물을 완전히 제거한 다음 10ml의 PBS에 부드럽게 다시 현탁시키고 다시 원심분리하여 펠릿을 세척합니다. 이제 핵 펠릿을 1 밀리리터 PBS에 조심스럽게 다시 현탁시키고 용액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 PBS를 완전히 제거하고 펠릿을 액체 질소에서 급속 동결합니다.

이 시점에서 펠릿을 섭씨 80도에서 보관하거나 절차를 계속할 수 있습니다. 핵을 용해하고 DNA를 절편화하려면 위아래로 피펫팅하여 500마이크로리터의 Buffer B1에 해동된 핵을 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.

그런 다음 3mm 마이크로팁 프로브를 사용하여 40% 진폭으로 각각 30초 동안 샘플을 6회 초음파 처리합니다. 펄스 사이에 최소 30초 동안 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 초음파 처리 후 샘플은 흐리지 않고 선명하게 보여야 합니다.

섭씨 4도에서 10분 동안 14, 000 x G에서 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 펠릿 크기는 크게 감소해야 하며, 100미크론 셀 스트레이너를 통해 상등액을 여과하고 흐름을 유지해야 합니다. 그런 다음 여과된 상층액에 500마이크로리터의 버퍼 B2를 추가합니다.

비오틴화된 DNA를 스트렙타비딘 코팅 비드에 결합하기 위해 300마이크로리터의 비드 슬러리를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 옮겨 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 준비합니다. 샘플당 하나의 비드 튜브를 준비합니다. 볼텍싱하여 다시 현탁하여 비드를 1밀리리터로 세척하고, 자석에 적용하여 비드를 분리하고, 세척 버퍼를 흡인하여 비드를 세척합니다.

그런 다음 세척된 비드에 샘플 900마이크로리터를 추가합니다. 샘플의 나머지 부분은 입력 DNA 및 단백질 분리에 사용됩니다. 서스펜션을 섭씨 4도에서 밤새 회전시킵니다.

다음 날, 샘플을 마그네틱 마이크로퓨지 튜브 랙에 넣고 상층액을 제거합니다. 1ml의 버퍼 B2에 비드를 부드럽게 다시 매달아 놓은 후 섭씨 4도에서 5분 동안 회전합니다. 마그네틱 마이크로퓨지 튜브 랙을 사용하여 상층액을 다시 제거합니다.

이번에는 1ml 버퍼 B3에 비드를 부드럽게 다시 매달아 놓고 섭씨 4도에서 5분 동안 회전합니다. 자석을 사용하여 비드 혼합물에서 상등액을 제거한 후 50마이크로리터의 2x Laemmli 샘플 버퍼에 비드를 다시 현탁시켜 DNA 단백질 복합체를 암시합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 15분 동안 끓입니다.

마이크로퓨지에서 샘플을 빠르게 회전시키기 전에 혼합물을 소용돌이치십시오. 샘플을 자석에 적용하고 할당을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 샘플을 급속 냉동하여 섭씨 80도에서 보관하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 분석을 수행합니다. EdC 라벨링은 0분, 20분, 40분 또는 60분 동안 수행된 후 바이러스 DNA 및 관련 단백질을 정제했습니다. 용출된 단백질은 바이러스 DNA 결합 단백질인 ICP4 및 UL42에 특이적인 항체와 함께 coomassie blue 염색 및 웨스턴 블로팅을 거쳤습니다.

화살표는 용리 중에 비드에서 벗겨진 스트렙타비딘(streptavidin)을 나타내며, 이는 모든 조건에서 존재합니다. 이 방법으로 분리된 단백질은 질량 분석법의 대상이 됩니다. 파이 차트는 감염 후 6시간 동안 게놈에서 단순 포진 바이러스 유형과 관련이 있는 것으로 밝혀진 각 기능 범주의 단백질 수를 보여줍니다.

확인된 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용에 대한 자세한 조사는 문자열 기능 단백질 협회 네트워크 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다. 그 결과 동일한 생물학적 과정에서 함께 기능하는 단백질의 하위 복합체가 드러났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바이러스 게놈 관련 단백질의 단백질체학 조사를 위해 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술은 3-4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플의 DNAse 또는 프로테아제 오염을 방지하기 위한 예방 조치를 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 외에도 면역형광과 같은 다른 방법을 수행하여 EdC 표지된 바이러스 DNA의 특성을 확인할 수 있습니다.

이 기술은 헤르페스 바이러스학 분야의 연구자들이 숙주 단백질과 바이러스 감염의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.