Name: 관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 HSV-1 DNA 정제 및 바이러스 게놈 관련 단백질 프로테오믹스 분석 방법을. MRC-5 세포 배양과 EdC 라벨링을 활용하여 세포 요소가 헤르페스 바이러스 감염에 미치는 영향을 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는이 원고 준비에 대 한 도움 한 나 폭스를 인정합니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01AI030612를 부여.

1. 세포 배양, 바이러스 성 감염 및 EdC 라벨 ( 그림 1) 다음 프로토콜 작업 바이러스를 포함. 학교를 참조 하십시오 &#39; 바이러스 및 다른 생물 학적 에이전트의 안전한 취급에 관한 s 바이오 안전 프로토콜. 이 프로토콜의 피츠버그 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
<ol><li>MRC-5 셀 confluent 150 cm 2 조직 배양 플라스 크를 trypsinize 하 고 600 cm 2 조직 문화 접시 100ml DMEM 플러스 10%를 포함 하는 셀 전송 FBS. Confluency 및 고정 단계를 도달 하기 위하여 3-4 일의 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. Confluent 600 cm 2 접시 7을 ~ 10 7 셀에 포함 되어 있습니다. 각 조건에 대해 1 접시와 각 해당 부정적인 컨트롤 1 접시 준비. 
	참고: 셀 그 유일한 vDNA를 분류 하 고 이후 단계에서 정화 되도록 세포 DNA 복제를 억제 하는 고정 단계에 도달 해야 합니다. 
	참고: 각 샘플 필요 합니다 무료로 동일한 감염 조건 및 EdC의 추가 없이 시간 포인트를 사용 하 여 준비 하는 부정적인 컨트롤 레이블 없음. 
	참고:이 실험의 버전을 축소 하는 A 실행 되어야 한다 유사한 세포 성장, 감염, EdC 조건, 라벨을 사용 하 여 이미징에 의해 세포 DNA의 라벨에 대 한 테스트 및 포인트를 시간에 (단계 2 참조).</li>
	<li>7 x 10 8 PFU HSV-1 7 mL에 희석 찬 Tris-Buffered 염 분 (TBS). 성장 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 저장 감염, MRC-5 셀을 실 온에서 1 h 바위 7 mL 희석된 바이러스를 추가 합니다. 흡착, 다음 inoculum을 제거 하 고 50 mL 실내 온도 TBS, 린스 원래 성장 매체를 대체. 5% CO 2의 37 ° C에서 품 어. 각 실험 조건 및 부정적인 제어를 위해이 단계를 실시 한다. 
	참고: 증가 EdC 라벨 얻을 수 바이러스 성 dUTPase (UL50 유전자) uracil glycosylase (UL2 유전자)의 표현에 대 한 결함이 HSV-1 돌연변이 사용 하 여. HSV-1 dUTPase는 낮은 기질 특이성 및 여러 nucleoside 아날로그 25 , 27의 활성화를 줄일 수 있다.</li>
	<li>레이블 EdC와 바이러스 성 게놈입니다. 들어오는 게놈 (1.3.1.), 유전자 (1.3.2.), 또는 바이러스 성 복제 포크 (1.3.3) 복제를 지시를 따릅니다. 
	참고: 유일한 단계 1.3.1, 1.3.2, 또는 1.3.3 실행 되어야 한다 있는지 여부에 따라 들어오는 게놈, 복제 된 유전자, 또는 복제 포크 후속 단계에 각각 분석. 
	참고: 듀 또는 f-아 듀 EdC에 교체하실 수 있습니다. Nucleoside 아날로그의 독성 모니터링 하 고 최소화 해야 합니다.
	<li>사용 <ol>prelabeled 감염 단계 1.2에서 수행 하 고 2 단계로 진행 하는 주식 또는 3 4 h 이내 게시물 감염 (hpi) 복제 되지 않은 vDNA ( 그림 1A)를 조사 하. 
		참고: 앞에서 설명한 프로토콜 25를 사용 하 여 주식 prelabeled 바이러스를 준비 합니다. 바이러스 주식 어떤 잔여 EdC를 제거 하려면 G-25 열을 통과 해야 합니다.</li>
		<li>5-25 µ M를 추가 하 여 복제 vDNA 라벨 2-4 h ( 그림 1B)에 감염 된 세포의 세포 배양에 EdC. 추가 하기 전에, 성장 매체의 1 mL에 EdC 희석.</li>
		<li>VDNA 복제의 발병 후 바이러스 성 복제 포크를 (&#8805; 4 hpi), 5-25 µ M와 vDNA 복제 펄스 레이블 EdC 5-20 분. 추격, 체이스 매체 포함 하는 25-100 µ M 2´deoxycytidine와 3 배를 씻어 (deoxyC), 및 다음 추가 20-40 분 ( 그림 1C) 체이스 매체의 품 어. 
		참고: 펄스와 체이스 매체를 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO 2 equilibrated 한다. 
		참고: 펄스 추적 실험, 그것은 입력 하는 셀 고 DNA 복제에 포함 될 수 있습니다 전에 phosphorylated nucleosides 하는 데 걸리는 시간을 고려 하는 것이 중요. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다. 
		참고: 펄스 체이스 실험의 해상도 확인 하려면 사용 하는 실험 조건 하에서 바이러스 성 복제 속도 계산 합니다. 이는 한 단계 성장 시간 코스 26 동안 바이러스 성 게놈의 양이 많은 PCR에 의해 결정 될 수 있다. 
		참고: 바이러스 성 게놈을 이미징에 대 한 2 단계를 진행 하 고 바이러스 성 게놈의 정화에 대 한 3 단계를 진행.</li>
	</ol></li></ol> 2. EdC의 영상 DNA ( 그림 2A) 라는 참고: 그것은 영상에에서 세포질 DNA 실험에 표시 되지 않는 확인 하려면 바이러스 성 게놈 정화 방법으로 수행 하는 데 유용. 영상 또한 레이블된 vDNA의 특성을 시각화 하 고 proteomics 데이터 유효성 검사를 사용할 수 있습니다. 패턴을 얼룩이 지는 세포와 바이러스 성 DNA의 예는 그림 3에 나와 있습니다.
<ol><li>감염 수행 및 성장 매체의 1 mL를 포함 하는 12 음 조직 문화 접시에 coverslips에 조건 EdC 라벨을 사용 하 여 제외 하 고 1 단계에서에서 표시 된 대로 축소.</li>
	<li>1 mL 3.7%와 수정 셀 paraformaldehyde 실시간에 15 분 동안 1 x PBS에서 고정, 후 린스 세포를 PBS에서 1 mL 3 %BSA 2 x. 
	주의: Paraformaldehyde 심각한 또는 영구적인 부상을 일으킬 수 있습니다. 안전 예방 조치를 따르십시오. 
	참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 coverslips 두 번째 세척에 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1 mL permeabilization 버퍼와 세포를 permeabilize [참조 테이블의 자료] 락을 하는 동안 실 온에서 20 분.</li>
	<li>흔들어 3 %BSA 한 다음 실 온에서 30 분 PBS에 1 mL 3 %BSA 블록 1 mL로 씻어.</li>
	<li>칵테일 클릭 반응의 1 개 mL를 추가 [참조 테이블의 자료] covalently 알 렉 사 Fluor 488 켤레를 coverslips에 EdC에 아 지 드 라는 DNA. 락을 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>락을 하는 동안 실 온에서 30 분 PBS에 Hoechst의 1:2,000 희석의 1 mL와 함께 얼룩 세포질 DNA. 발음 및 1 mL의 PBS로 두 번 씻어.</li>
	<li>얼룩 표준 차 및 2 차 항 체와 간접 면역 형광 검사 프로토콜 25. 
	참고: 레이블된 vDNA colocalizes ICP8, ICP4, 또는 UL42 및 세포 라는 DNA Hoechst 얼룩과 colocalizes.</li>
	<li>슬라이드에 coverslips를 탑재 하 고 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지. 
	참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol> 3. VDNA와 관련 된 단백질의 정화 참고:이 프로토콜의 몇 가지 측면에서 양조위 외 적응 되었습니다 22 참고: 모든 버퍼 및 시 약은 사용 하기 전에 얼음에 냉장 해야 하 고 모든 단계 실행 되어야 한다 얼음에 달리 명시 하지 않는 한.
<ol><li>핵 수확. 
	참고: 핵의 격리, 하기 전에 포름알데히드 crosslink 단백질 DNA 사용할 수 있습니다. 더 엄격한 세척 조건 다음 streptavidin 입히는 구슬에 DNA 정화 하는 동안 사용할 수 있습니다. Cr에 대 한osslinking와 세척 조건 참조 Sirbu 외. 21. <ol><li>20 mL 핵 추출 버퍼 (코)와 성장 매체를 대체 하 고 가끔 락 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 핵 현미경에 표시 될 것입니다.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에서 핵을 긁 고 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 작은 핵, 삭제는 상쾌한 하 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 원심 분리기. 
		참고: Trypan 푸른 얼룩 세포에서 핵의 절연을 확인을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>부드럽게 10 ml PBS, 15 mL 원뿔 튜브에 핵 펠 릿을 꺼내 려 하 고 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 의해 펠 렛. 
		참고: 핵 얼 수 있다 고 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다. 이렇게 하려면 부드럽게 500에서 핵 펠 릿을 resuspend µ L 고정 버퍼 및 에탄올/드라이 아이스 목욕 튜브를 품 어. -80 ° c.에 언된 핵 저장 사용 하기 전에, 핵 실 온에서 해 동 하 고 신속 하 게 얼음, 10 mL PBS, 혼합, 4 ° C에서 2500 x g에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛을 부드럽게 록 추가 전송 완전히 PBS를 제거 합니다. 감소 된 수확량 귀 착될 지도 모른다 핵 동결.</li>
	</ol></li> <li>아 지 biotin-covalently 어원이 드 EdC 표시 vDNA.
	<li>10 mL 클릭 반응에서 핵 펠 릿 혼합 [참조 테이블의 자료] 부드럽게 위아래로 pipetting으로 5 번 10ml 피펫으로 resuspend <ol>. 
		참고: 그것은 중요 한 클릭 반응 혼합에 포함 시 약 표시 된 순서로 추가 됩니다.</li>
		<li>1 h 4 ° c.에 대 한 회전 회전 하는 동안 준비 하 고 버퍼 B1, B2 및 B3 [재료의 표 참조] 진정.</li>
		<li>4 ° C. 완전히 제거에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 여 펠 릿 핵 반응 혼합을 클릭 하 고 부드럽게 10 mL PBS에에서 resuspending 및 4에서 2500 x g에서 10 분 동안 centrifuging 펠 릿을 세척 ° c.</li>
		<li>부드럽게 1 mL PBS에서에서 핵 펠 릿과 큰 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 1.5 mL microfuge 관에 resuspend. 2500 x 4 ° C. 완전히 제거 PBS에서 g와 플래시 동결 액체 질소에에서 10 분 동안 centrifuging 여 핵을 펠 렛. 
		참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 하 고 얼어붙은 핵 핵 될 플래시 단계 3.3 같은 날에 진행 하는 경우에 동결 하는 것이 좋습니다 그래서-80 ° c. 동결 해 동 수 후속 세포에 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>Lyse 핵과 DNA 조각.
	<ol><li>얼음에 핵을 녹여 고 아래로 pipetting으로 버퍼 B1 500 µ L에서 resuspend. 45 분에 대 한 얼음에 품 어</li>
		<li>Sonicate 샘플 6 회 30 s 각 40% 진폭 3mm microtip 프로브를 사용 하 여. 30 대 한 얼음에 견본을 두 펄스 사이 s. 쥡니다, 샘플 표시 명확 하 고, 아니 흐린. 
		참고: 쥡니다 조건 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다. 쥡니다 조건을 최적화 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 참조 렁 외. 22.</li> <li>centrifuging 14000 x g 4 ° c.에서 10 분에 의해 세포 파편을 펠 렛 펠 릿 크기는 크게 감소 한다. 100 µ M 셀 스 트레이너를 통해는 상쾌한을 필터링 하 고 유지를 통해 흐름.</li>
		<li>추가 500 µ L이이 샘플의 필터링 된 상쾌한. 900 µ L 버퍼 B2 단계 3.4.2에서에서 사용 됩니다.</li>
		<li>DNA 절연 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 고 추가 SDS-중 탄산 솔루션 x 50 µ L 2 [재료의 표 참조]. DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>입력된 단백질 (50 µ L 또는 1/20 볼륨)에 대 한 각 상태의 약 수 Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2를 추가, 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 ° C. 사용 단계 3.5.6에서에서.</li>
	</ol></li> <li>Streptavidin 바인딩 biotinylated DNA 코팅 구슬.
	<li>1.5 mL microfuge 관에 구슬 슬러리의 300 µ L를 전송 하 여 준비 Streptavidin T1 자석 구슬 <ol>. 샘플 당 구슬의 1 개의 관을 준비 합니다. 워시 비즈 1 mL 버퍼 B2 resuspend에 vortexing, 자석 구슬, 분리를 적용 하 고 발음 워시 버퍼와 함께 3 x. 
		참고: 최적화 조건 결과 최대화 항복에 최소한의 배경 바인딩 바인딩. 그것은 실험적으로 Streptavidin T1 자석 구슬 agarose 구슬, 뿐만 아니라 다른 Streptavidin 구슬 보다 갈수록 배경 바인딩 Streptavidin C1 비즈 보다 상당히 큰 바인딩 능력을가지고 결정 했다 ( 그림 4A ).</li>
		<li>단계 3.3.4에서에서 샘플의 추가 900 µ L. 씻어 구슬 하 고 회전 4에서 하룻밤 ° c. 
		참고: 샘플은 그들에 게 추가 되 면 소용돌이 구슬 하지 마십시오. 
		참고: 경우 상당한 양의 DNA 또는 단백질 레이블이 없는 부정적인 제어에 격리 되어,이 단계에서에서 줄일 수 있습니다 하룻밤을 줄이기 위해 배경 바인딩 4 h.</li>
	</ol></li> <li>구슬 세척 하 고 vDNA와 관련 된 단백질을 elute. 
	참고:이 좋습니다 나머지 단계에 대 한 필터 팁을 사용 하 여.
	<li>마그네틱 microfuge 관 랙, 제거 상쾌한 장소 샘플 부드럽게 1 ml 버퍼 B2, 회전 4 ° C에서 5 분에 대 한 resuspend</li> <ol>
		<li>반복 단계 3.5.1 세 번.</li>
		<li>마그네틱 microfuge 관 랙 샘플, 상쾌한 제거, 부드럽게 1 ml 버퍼 B3, resuspend 놓고 5 분의 4 ° C에서 회전</li>
		<li>전송 100 µ L 혼합물 (1/10 번째 볼륨) 바인딩된 DNA 분리에 대 한 새로운 튜브 구슬. 자석에이 튜브를 적용, 상쾌한 제거, SDS-중 탄산 솔루션 x 100 µ L 1에에서 구슬 resuspend 및 DNA 격리 프로토콜 (단계 3.6) 진행.</li>
		<li>단계 3.5.3에서에서 나머지 900 µ L 비드 혼합물을 포함 하는 튜브 적용. 자석, 상쾌한, 제거 및 단백질 및 DNA 단백질 복합물을 elute Laemmli 샘플 버퍼 x 50 µ L 2에에서 구슬 resuspend.</li>
		<li>종 샘플에서 95 ° C 15 분, 소용돌이, 빠르고 microfuge에 회전 자석 적용. 새로운 튜브, 플래시 동결, 그리고-80에 게 eluate 전송 ° c. 
		참고: 사용 모자 자물쇠 튜브 팝업 하지 않습니다 보장 하기 위해 끓는 동안 열. 
		참고: 프로토콜은이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>Coomassie 파란 얼룩, 부 럽, 또는 표준 절차 25 질량 분석 분석 단백질 견본. 대표 결과 그림 4 및 그림 5에 표시 됩니다. 
		참고: 단백질 수율 질량 분석에 대 한 충분 한 인지를 확인 하려면 각 샘플의 7.5 µ L은 분석 Coomassie 블루 얼룩 및 사용 대표적인 바이러스 성 게놈의 서 부 럽 대 7.5 µ L 관련 단백질 (ICP4, ICP8, 또는 UL42). 단계의 3.3.6 lysates의 같은 볼륨. 입력된 단백질 수준에 대 한 제어와 함께 실행 됩니다. 나머지 샘플 (35 µ L) 질량 분석 후 분석 앞에서 설명한 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA 격리 <ol><li>단계 3.3.5에서에서 샘플을 품 어. 및 3.5.4. 필요한 경우 4-16 h. 제거 65 ° C에서 자석 구슬에서 샘플.</li>
		<li>150 µ L 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI)와 샘플을 추출 하 고 새 튜브를 수성 단계 전송.</li>
		<li>100 µ L와 나머지 PCI 추출 트리 스-EDTA (테) 새로운 튜브에 수성 단계 추가.</li>
		<li>200 µ L 클로 프롬: isoamyl 알콜 (24:1)와 샘플 추출.</li>
		<li>정화 수성 단계 제조 업체에 따라 PCR 정화 키트를 사용 하 여 &#39; s 프로토콜. 
		참고: 버퍼 샌드위치에 pH 표시기 샘플에 추가 될 때 자주색 돌 것 이다. 추가 10 & #181. L 3 M NaOAc pH 5.0 샘플의 pH 감소.</li>
		<li>결정 DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여. 
		참고:이 프로토콜은 일반적으로 100-400 ng 비드 바인딩된 DNA 생성합니다. 아니 DNA는 EdC 1.3 단계에서에서 추가 되지 않은 부정적인 컨트롤의 eluate에서 감지 해야 합니다.</li>
		<li>DNA 낮은 DNA 바인딩에 저장할 수 있습니다 4 또는-20 ° C에서 튜브와 실시간 PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).</li>
<li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li>
<li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242(2013).</li>
<li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments%3A+association+of+cellular+DNA+replication%2C+repair%2C+recombination%2C+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li>
<li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27%3A+association+with+translation+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li>
<li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li>
<li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li>
<li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease%2C+UL12%2C+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li>
<li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+ICP4%2C+TATA-binding+protein%2C+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early%2C+early%2C+and+late+promoters+in+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li>
<li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li>
<li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li>
<li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li>
<li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li>
<li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li>
<li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).</li>
<li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+periphery+of+nuclear+domain+10+%28ND10%29+as+site+of+DNA+virus+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li>
<li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li>
<li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li>
<li>Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li>
<li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G%281%29+into+S+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li>
<li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).</li>
<li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).</li>
<li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li>
<li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li>
<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
<li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING%3A+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 여러 단계를 신중 하 게 따르지 않으면 크게 감소 단백질 수확량 또는 세포질 DNA로 오염 될 수 있습니다 포함 되어 있습니다. 그것은 중요 한 세포질 DNA는 하지 표시 하 고 정화 고정 셀 모든 실험을 위해 사용 됩니다. 이것은 단백질 견본에 세포질 DNA polymerases의 부재에 의해 HSV-1 게놈 종합을 위한 세포질 DNA 중 합 효소를 사용 하지 않습니다 때문에 확인할 수 있습니다. EdC 라벨 및 수확 단계 핵, 샘플은 각각 동등 하 게 처리 되도록 정열 한다. 정화 단계 하지 너무 많이 pipetting으로 핵을 조작에 배려를가지고 한다. 이 핵, 피펫으로 팁의 측면에 집착으로 샘플 손실의 조 lysis로 이어질 수 있습니다. 또한, 쥡니다 단계 개별 sonicators에 대 한 최적화 되어야 합니다 및 biotin 바인딩에 사용 되는 streptavidin 입히는 구슬의 양을 최적의 단백질 생산량에 대 한 적정 한다.
몇 가지 수정이이 프로토...

바이러스는 필수적인 기능을 수행 하 고 따라서 감염 바이러스 성 유전자 발현, 복제, 복구, 재결합, 전송 등의 중요 한 측면을 촉진 하기 위하여 호스트 요소에 따라 제한 된 용량을가지고. 이러한 호스트 요인의 활동은 종종 virally 인코딩된 단백질에 의해 증강 된다. 또한, 바이러스 성 감염에 세포질 응답에 의해 바이러스 탐지 및 방해를 피해 야 한다. 따라서, 바이러스 호스트 상호 작용은 감염의 결과 지정합니다. 파라마운트의 중요성 이해 어떻게 바이러스 바이러스 성 프로세스를 촉진 하기 위하여 세포질 기계에 맞게 셀룰러 환경 변경. 특히 관심의 어떤 요소와 프로세스 행동 전염 성 주기에 걸쳐 바이러스 성 게놈에 식별 됩니다.
헤 르 페 스의 단순 바이러스 타입 1 (HSV-1)는 더블 좌초 인간의 인구의 상당한 비율을 감염 하는 DNA 바이러스입니다. 감염의 첫 번째 시간, 바이러스 성 게놈은 핵, 바이러스 성 유전자 발현의 순서 캐스케이드 바이러스 DNA (vDNA) 복제1조정에서 ensues 들어간다. 핵에서 게놈 epigenetic 규정이 적용, 수리 및 재결합, 받을 있으며 첫 번째 자손 virions 6 시간 미만 생산 되도록 capsids,으로 패키징 됩니다. 감염의 과정을 통해 관련 된 바이러스 성 게놈 단백질의 종합 평가 하는 바이러스 성 게놈에 행동 하 고 있는 바이러스 및 세포질 요인에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다. 프로세스의 분자 세부 조사를 기초 누워 것입니다. 감염의 다양 한 단계에 포함 된다입니다.
바이러스 성 감염에 관련 된 호스트 요인의 조사에 대 한 이전 방법 포함 관련된 세포 단백질2,3,,45 의 분석에 대 한 바이러스 성 단백질의 친 화력 정화 , 6 , 7 , 8 , 9. 이러한 분석 수단이 포함 된 세포질 요인의 식별에 대 한 호스트 항 바이러스 응답 뿐만 아니라 바이러스 chromatin 수정, 유전자 발현 및 DNA 복구. 그러나, 그것은 상호 작용 vDNA, 연관에 따라 달라 집니다 그리고 proteomics 특정 바이러스 성 요인의 기능으로 발생 하는 상호 작용에 대 한 통찰력을 제공 여부를 확인 하기가 어렵습니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 특정 바이러스 및 세포질 단백질 바이러스 성 게놈10,11,12,,1314 바인딩할 식별 하는 데 사용 되었습니다. , 15 그리고 형광 성 제자리 교 잡 (물고기) immunocytochemistry와 함께 vDNA16,,1718, 와 colocalize 세포 요소의 시각화 수 있게 되었습니다. 19 , 20.이 분석 실험 공간 및 시간 분석에 대 한 허용. 그러나, 한계는 매우 구체적인 항 체, 제한 된 감도 및 이전 통찰력 바이러스 호스트 상호 작용에 대 한 필요성에 대 한 필요성을 포함합니다. 우리는 따라서 iPOND (초기 DNA에 단백질의 격리)21 에 따라 방법을 개발 및 선택적으로 레이블을 지정 하 고 정화에서 vDNA aniPOND (가속된 네이티브 iPOND)22 감염 바이러스 성 게놈의 편견된 식별에 대 한 셀 관련된 단백질 질량 분석에 의해입니다. iPOND 세포 복제 포크 역학 조사에 대 한 수단이 되었습니다.
감염 된 세포에서 바이러스 성 게놈의 선택적 정화에 대 한 수정 ethynyl nucleosides, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (듀) 또는 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (그림 1), 다음 화학식으로 표시 됩니다 vDNA 복제 통해 biotin 아 지 드를 활용 한 단계 바이러스 성 게놈 및 streptavidin 입히는 구슬 (그림 2B)에 관련 된 단백질의 정화를 촉진 하기 위하여 화학을 클릭 합니다. 중요 한 것은, 감염 vDNA의 특정 라벨 수 있도록 세포 DNA 복제에 종사 하지 않습니다 고정 된 셀에서 수행 됩니다. 또한, HSV-1 감염 세포 주기 검거 원인과 세포 DNA 복제23,24를 억제 합니다. 바이러스를 들어오는 바이러스 성 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 감염 전에 prelabeled 또는 새로 합성된 vDNA (그림 1B)와 관련 된 단백질의 분석에 대 한 DNA 복제 하는 동안 표시 수 있습니다. 25. 또한, 펄스 체이스 분석 바이러스 성 복제 포크 (그림 1C)26와 관련 된 단백질의 특성을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, ethynyl 수정 vDNA 단백질 역동성 (그림 2A 및 그림 3)의 공간을 위해 fluorophore를 covalently 활용 될 수 있습니다. 이미징은 vDNA의 직접적인 시각화에 대 한 허용 및 vDNA-단백질 상호 작용의 유효성 검사에 대 한 무료 접근 이며 감염을 통해 바이러스 성 게놈을 추적 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리 예상 대기 시간 및 재 조직를 포함 하 여 herpesviral 감염의 어떤 양상 든 지 공부 하 고 다른 DNA 바이러스 연구를 이러한 접근 더 수정 될 수 있습니다. 또한, 5-ethynyl uridine로 (EU) RNA 바이러스 성 게놈의 분석에 대 한 허용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MRC-5 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM&nbsp로 대체; (플라스크 내 성장용) 또는 30mM(접시 내 성장용) 나트륨-중카르비네이</td></tr>트 <tr><td>600cm2 조직 배양 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수(TBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td>137mM NaCl, 5mM KCl, 491mM MgCl, 680mM CaCl, 25.1mM Tricine</td></tr><tr><td>HSV-1 스톡</td><td></td><td></td><td>역가가 1x109 PFU/mL보다 큰 스톡이 가장 적합합니다</td></tr><tr><td>.세파덱스 G-25&nbsp; 컬럼 (PD-10 탈염 컬럼)</td><td>GE 헬스케어</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&acute;-Ethynyl-2&acute;-deoxycytidine (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>DMSO에 용해하여 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>2&acute;-deoxycytidine (deoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>물에 용해시켜 40mM 재고, 분취 및 -20°C에 보관합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>핵 추출 완충액(NEB)</td><td></td><td></td><td>신선한(20mM Hepes pH 7.2, 50mM NaCl, 3mM MgCl2, 300mM Sucrose, 0.5% Igepal)</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>Trypan blue solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (사용 전에 멸균수에서 1x로 희석)</td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물(CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>100mM 재고를 준비하고 4°C에서 보관합니다. C 최대 1개월</td></tr> <tr><td>동안(+) 나트륨 L-아스코르브산</td><td>염 시그마-알드리치</td><td>A4034</td><td>100 mM 재고를 신선하게 준비하고 얼음에 보관</td></tr>합니다. <tr><td>비오틴 아지드</td><td>인비트로젠</td><td>B10184</td><td>DMSO에 10 mM 재고를 준비하고, 분취량, -20°C에서 보관; C 최대 1년&nbsp;</td></tr><tr>표시된 순서로 시약을 추가하여 사용 직전에 <td>반응 혼합</td><td></td><td></td><td>준비를 클릭하십시오 (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>로슈</td><td>11697498001</td><td>1 mL 물에 용해시켜 50x 재고를 준비하고, 4 &deg에서 저장할 수 있습니다; C 최대 1 주일 동안 또는 직접 50 mL 버퍼에 1 알약을 추가</td></tr><tr><td>동결 버퍼</td><td></td><td></td>는 <td>신선한 준비 (7 mL 100 % 글리세롤, 3 mL NEB, 200 &mu; L 50x 프로테아제 억제제)</td></tr><tr><td>버퍼 B1</td><td></td><td></td><td>신선한 준비 (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)</td></tr><tr><td>버퍼 B2</td><td></td><td></td><td>신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x 프로테아제 억제제)</td></tr><tr><td>버퍼 B3</td><td></td><td></td><td>신선한 준비 (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x 프로테아제 억제제)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer 3mm 마이크로팁 프로브</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 샘플 버퍼</td><td></td><td></td><td>400mL 물에 SDS 400mg, 100% 글리세롤 2mL, 1M 트리스(pH 6.8) 1.25mL 및 브로모페놀 블루 10mg을 혼합합니다. 4&nbsp;에 매장 &데그; C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다. 사용하기 전에 1M DTT를 최종 농도 200mM에 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브용 캡 잠금 장치</td><td>, Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>표준 웨스턴 블로팅 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, NOVEX 콜로이드 블루 염색 키트,</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 접시</td>, <td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립,</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>사용</td></tr> <tr><td>전 오토클레이브현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>사용 전 1x PBS에서 3.7%로 희석</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>투과 완충액(0.5% Triton-X 100</td>)에서 3% 준비 <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>에서 0.5% Triton-X 100 준비클릭 반응 칵테일 - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트</td><td>분자 프로브</td><td>C10337</td><td>제조사 프로토콜에 따라 준비</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>물에 10 mg/mL 준비, 4°C에서 저장 가능; 최대 1년</td></tr><tr><td>동안 마우스 anti-ICP8 1차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>마우스 anti-UL42 1차 항체(2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td>에 <td>1:200 희석 사용 1x</td></tr><tr><td>PBS Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td> 1x PBS Immu-mount Thermo Fisher Scientific 9990402에 <td>1:500 희석 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-bicarb 용액</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올</td><td></td><td></td><td>믹스 25:24:1 사용 최소 1일 전, 4°C에서 보관하십시오. 어두운</td></tr><tr><td>클로로포름의 C : 이소 아밀 알코올</td><td></td><td></td><td>24 : 1 사용 최소 1 일 전에 실온에서 보관하십시오</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8.0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (사용 전 1x로 희석)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>, Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td>, <td>이미징 소프트웨어가</td><td></td> 장착된 Invitrogen Q32856 <td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td>, 1.5mL 튜브용 마이크로 원심분리기, 15mL 및 50mL 튜브용 테이블탑 원심분리기, 세포 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 문화 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 블록</td><td></td><td></td><td>65 &deg; C 및 95 &deg; 씨</td></tr></tbody></table>

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

이 프로토콜의 목표를 포진 심 플렉스 바이러스 타입-1 (HSV-1)의 식별에 감염 된 세포에서 DNA 관련 바이러스 이며 여 세포질 단백질 질량 분석. 바이러스 성 유전자와 상호 작용 하는 단백질 감염의 결과 결정에 있는 주요 역할 비록 바이러스 성 게놈 관련 단백질의 포괄적인 분석 이전 가능 되지 않았습니다. 여기 감염 된 세포에서 HSV-1 유전자의 직접 정화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 DNA 복제 alkyne 기능 그룹을 포함 하는 수정 된 세포핵으로 선택적으로 표시 됩니다. 레이블이 지정 된 DNA는 다음 구체적으로 그리고 돌이킬 수 태그 biotin 통해 구리 (I) 아 지 드의 공유 첨부 파일을 통해-아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 클릭 반응 촉매. Biotin 태그 DNA streptavidin 입히는 구슬에 정화와 관련 된 단백질은 eluted 질량 분석에 의해 확인 된. 이 메서드는 선택적 대상 지정 및 HSV-1 복제 포크 또는 복잡 한 생물 학적 환경에서 전체 게놈의 격리 수 있습니다. 또한,이 방법의 적응은 herpesviral 감염의 다양 한 측면의 다른 DNA 바이러스의 유전자 검사의 수사 허용 하 고 있습니다.

세포에서 DNA의 정화에 대 한 클릭 화학을 사용 하 여 먼저 iPOND 메서드21에 의해 달성 되었다. IPOND의 목적은 정화 관련된 단백질의 id에 대 한 세포 복제 포크입니다. 우리는 특별히 감염 시 vDNA 단백질 상호 작용 연구에이 기술을 적응 시켰다. EdC (그림 1)와 함께 동기화 된 감염, 바이러스 성 게놈을 접근의 조작 선택적 분리와 vDNA의 별도 인구 조사에 대 한 허용 했다. HSV-1 DNA 이미징 fluorophore 또는 biotin 정화 (그림 2)에 대 한 공유 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 EdC (그림 1)으로 표시 됩니다. 바이러스 들어오는 게놈 (그림 1A)와 관련 된 단백질의...

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

이 방법의 전반적인 목표는 바이러스 게놈 관련 단백질의 단백체 분석을 위해 감염된 세포에서 단순 헤르페스 바이러스 1형 DNA를 정제하는 것입니다. 이 방법은 세포 요인과 헤르페스 바이러스 감염의 관여에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 감염된 세포에서 다양한 바이러스 DNA 집단을 직접 정제하도록 조정할 수 있어 감염의 여러 측면을 분석할 수 있다는 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MRC 5개 세포를 배양하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 HSV-1을 콜드 트리스 완충 식염수 또는 TBS에 희석합니다. 다음 단계에서는 세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 송풍기와 조직 배양 후드를 끄는 것이 중요합니다.피펫을 사용하여 MRC 5 세포의 성장 배지를 멸균 병으로 옮겨 감염 후 세포에 다시 추가합니다. 7ml의 희석된 바이러스를 세포에 첨가하여 세포를 감염시킵니다. 실온에서 1시간 동안 10분마다 세포를 흔듭니다.흡수 후 innoculum을 흡인하고 실온 TBS 50ml로 세포를 헹구고 원래 성장 배지를 교체하십시오. 그런 다음 5%의 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 바이러스 DNA 복제가 시작된 후, 감염 후 약 4시간 후에 바이러스 DNA 복제에 라벨을 붙입니다.이를 위해 EdC를 1ml의 성장 배지에 희석하고 감염된 세포의 세포 배양 배지에 2-4시간 동안 첨가합니다. 핵을 채취하려면 성장 배지를 20ml의 핵 추출 완충액으로 교체하고 섭씨 4도에서 20분 동안 간헐적으로 흔들면서 배양합니다. 배양 후 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 핵을 긁어내고 얼음 위의 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.핵을 펠릿화하기 위해 2, 500 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기를 사용합니다. 원심분리 후 상층액을 폐기합니다. 10ml의 인산염 완충액 식염수 또는 PBS에 담긴 핵 펠릿을 부드럽게 제거하고 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 이전과 같이 샘플을 원심분리합니다. PBS를 완전히 제거한 후 10ml 피펫으로 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅하여 10ml의 클릭 반응 혼합물에 핵 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 이전과 같이 핵을 펠릿화하기 전에 섭씨 4도에서 1시간 동안 샘플을 회전시킵니다.빠른 반응 혼합물을 완전히 제거한 다음 10ml의 PBS에 부드럽게 다시 현탁시키고 다시 원심분리하여 펠릿을 세척합니다. 이제 핵 펠릿을 1 밀리리터 PBS에 조심스럽게 다시 현탁시키고 용액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 원심분리 후 PBS를 완전히 제거하고 펠릿을 액체 질소에서 급속 동결합니다.이 시점에서 펠릿을 섭씨 80도에서 보관하거나 절차를 계속할 수 있습니다. 핵을 용해하고 DNA를 절편화하려면 위아래로 피펫팅하여 500마이크로리터의 Buffer B1에 해동된 핵을 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 얼음 위에서 45분 동안 배양합니다.그런 다음 3mm 마이크로팁 프로브를 사용하여 40% 진폭으로 각각 30초 동안 샘플을 6회 초음파 처리합니다. 펄스 사이에 최소 30초 동안 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 초음파 처리 후 샘플은 흐리지 않고 선명하게 보여야 합니다.섭씨 4도에서 10분 동안 14, 000 x G에서 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 펠릿 크기는 크게 감소해야 하며, 100미크론 셀 스트레이너를 통해 상등액을 여과하고 흐름을 유지해야 합니다. 그런 다음 여과된 상층액에 500마이크로리터의 버퍼 B2를 추가합니다.비오틴화된 DNA를 스트렙타비딘 코팅 비드에 결합하기 위해 300마이크로리터의 비드 슬러리를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 옮겨 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 준비합니다. 샘플당 하나의 비드 튜브를 준비합니다. 볼텍싱하여 다시 현탁하여 비드를 1밀리리터로 세척하고, 자석에 적용하여 비드를 분리하고, 세척 버퍼를 흡인하여 비드를 세척합니다.그런 다음 세척된 비드에 샘플 900마이크로리터를 추가합니다. 샘플의 나머지 부분은 입력 DNA 및 단백질 분리에 사용됩니다. 서스펜션을 섭씨 4도에서 밤새 회전시킵니다.다음 날, 샘플을 마그네틱 마이크로퓨지 튜브 랙에 넣고 상층액을 제거합니다. 1ml의 버퍼 B2에 비드를 부드럽게 다시 매달아 놓은 후 섭씨 4도에서 5분 동안 회전합니다. 마그네틱 마이크로퓨지 튜브 랙을 사용하여 상층액을 다시 제거합니다.이번에는 1ml 버퍼 B3에 비드를 부드럽게 다시 매달아 놓고 섭씨 4도에서 5분 동안 회전합니다. 자석을 사용하여 비드 혼합물에서 상등액을 제거한 후 50마이크로리터의 2x Laemmli 샘플 버퍼에 비드를 다시 현탁시켜 DNA 단백질 복합체를 암시합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 15분 동안 끓입니다.마이크로퓨지에서 샘플을 빠르게 회전시키기 전에 혼합물을 소용돌이치십시오. 샘플을 자석에 적용하고 할당을 새 튜브로 옮깁니다. 마지막으로 샘플을 급속 냉동하여 섭씨 80도에서 보관하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 분석을 수행합니다. EdC 라벨링은 0분, 20분, 40분 또는 60분 동안 수행된 후 바이러스 DNA 및 관련 단백질을 정제했습니다. 용출된 단백질은 바이러스 DNA 결합 단백질인 ICP4 및 UL42에 특이적인 항체와 함께 coomassie blue 염색 및 웨스턴 블로팅을 거쳤습니다.화살표는 용리 중에 비드에서 벗겨진 스트렙타비딘(streptavidin)을 나타내며, 이는 모든 조건에서 존재합니다. 이 방법으로 분리된 단백질은 질량 분석법의 대상이 됩니다. 파이 차트는 감염 후 6시간 동안 게놈에서 단순 포진 바이러스 유형과 관련이 있는 것으로 밝혀진 각 기능 범주의 단백질 수를 보여줍니다.확인된 단백질 간의 단백질-단백질 상호 작용에 대한 자세한 조사는 문자열 기능 단백질 협회 네트워크 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다. 그 결과 동일한 생물학적 과정에서 함께 기능하는 단백질의 하위 복합체가 드러났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바이러스 게놈 관련 단백질의 단백질체학 조사를 위해 감염된 세포에서 바이러스 DNA를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 기술은 3-4일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 샘플의 DNAse 또는 프로테아제 오염을 방지하기 위한 예방 조치를 취하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차 외에도 면역형광과 같은 다른 방법을 수행하여 EdC 표지된 바이러스 DNA의 특성을 확인할 수 있습니다.이 기술은 헤르페스 바이러스학 분야의 연구자들이 숙주 단백질과 바이러스 감염의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

인플루엔자 바이러스는 호스트 세포 염색질과 협회들의 RNA 게놈을 복제. 여기서는 감염된 세포의 염색질에서 그대로 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스를 정화하는 방법을 제시한다. 바이러스 단지 투석을하는 것은 각각 서양 얼룩 및 단백질과 RNA 내용의 프라이머 확장명을 모두에 의해 분석할 수 있습니다.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

우리는 아데노바이러스(Ad)에 감염된 인간 세포에서 바이러스 복제 구획(RC)을 분리하는 새로운 전략을 제공합니다. 이 접근법은 바이러스 게놈 복제 및 발현을 조절하는 분자 메커니즘과 RC에서 확립된 바이러스-숙주 상호 작용의 조절을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 무세포 시스템을 나타냅니다.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

학습하세요 HSV-1 DNA 정제 및 바이러스 게놈 관련 단백질 프로테오믹스 분석 방법을. MRC-5 세포 배양과 EdC 라벨링을 활용하여 세포 요소가 헤르페스 바이러스 감염에 미치는 영향을 규명할 수 있습니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

더 많은 동영상 탐색