Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

안녕하세요, 저는 웨어 공과대학교(Ware Institute of Technology) 생물학적 인터페이스 연구소의 연구원 에릭 고트발트(Eric Gottwald)입니다. 오늘은 저희의 칩 기반 관류 마이크로 생체활성 시스템을 소개해 드리고자 합니다. 세포 배양 응용 분야에 칩을 사용하기 전에, 먼저 폴리머를 가수분해하고 미세 구조 영역의 탈가스 처리를 해야 합니다.

이는 칩을 100%부터 시작하여 서로 다른 농도의 isopropanol에 담그는 방식으로 수행됩니다. 각 농도에 칩을 단 몇 초 동안만 담그며, 마지막 단계는 물을 사용하는 것입니다. 그 후 칩을 건조시키고, 최종적으로 폴리머에 세포 부착을 용이하게 하기 위해 collagen type I 용액으로 칩을 코팅해야 합니다. 이는 마이크로 구조 영역 위에 collagen type I 용액을 몇 방울 떨어뜨려 수행하며, 이 상태로 칩을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

콜라젠 원 솔루션(collagen one solution)으로 하룻밤 동안 배양한 후, 솔루션을 제거하고 칩을 멸균된 PBS로 세척합니다. 그 후 PBS를 제거하면 칩에 세포를 접종할 준비가 됩니다. 이제 단일 세포 현탁액을 사용하여 세포 칩에 접종하는데, 이는 마이크로 구조 영역 위에 세포 현탁액 150 µL를 올리는 방식으로 진행됩니다. 세포를 도포한 후, 칩을 배양기에서 37 °C로 3시간 동안 배양합니다.

3시간의 배양 기간이 지난 후, 칩을 인큐베이터에서 꺼내어 이제 ector에 삽입할 준비를 합니다. 이를 위해 ector를 멸균 포장에서 꺼내는데, 이 투명 포일의 멸균 상태는 감마선 조사를 통해 유지됩니다. 따라서 패키지를 열고 ector를 꺼내기만 하면 됩니다.

다음으로 진행할 단계는 칩을 삽입하기 위해 바이오리액터 하우징을 분해할 수 있도록, 병의 윗부분을 이 배지 저장조에 삽입하는 것입니다. 바이오리액터 하우징을 연 후, 칩을 하우징의 홈에 배치하여 삽입하며, 이제 바이오리액터를 다시 조립할 수 있습니다. 마지막으로 배지 저장조에 두 개의 멸균 필터와 하나의 멸균 샘플링 포트를 연결해야 합니다.

폐쇄 순환 루프 내의 실제 산소 분압을 측정하기 위해, 두 개의 커넥터 사이에 두 개의 산소 센서를 장착하여 삽입합니다. 이제 bactor에 배양액을 채울 준비가 되었습니다. bactor 시스템에 세포 배양액을 채울 준비가 완료되었으며, 이는 폐쇄 순환 루프를 롤러 펌프에 연결함으로써 간단히 수행할 수 있습니다.

이를 통해 전체 벅터(bactor) 순환계를 동시에 감압합니다. 여기 엑터(Ector) 창에서 볼 수 있듯이, 배지가 아래에서부터 점점 차올라 상단의 벅터를 빠져나가는 것을 확인할 수 있습니다. 벅터 시스템을 인큐베이터에 넣기 전에, 순환 루프에 기포 없이 채워졌는지 확인합니다.

이제 시스템이 세포 배양 배지로 완전히 채워졌으므로 바이오리액터를 인큐베이터로 옮길 수 있습니다. 이제 바이오리액터를 배양 챔버 안에 배치하겠습니다. 이를 위해 먼저, 앞서 보신 것처럼 바이오리액터를 롤러 펌프에 연결하고, 이제 병에 든 배지가 바이오리액터로 활발하게 관류됩니다.

또한 주변 산소 농도를 유지하기 위해 배지 저장소를 가스 공급 장치에 연결합니다. 마지막으로, 시스템 내 산소 분압을 온라인으로 모니터링하기 위해 두 개의 산소 센서를 순환 경로에 연결합니다. 이제 설정이 완료되었으며, 설계한 실험 기간만큼 작동시킬 수 있습니다.

MicroCon 컨테이너 내부 세포의 기관형성 기능 분석 시 가장 강력한 도구 중 하나는 여기 보이는 레이저 스캐닝 현미경입니다. 레이저 스캐닝 현미경을 이용하면 각 MicroCon 컨테이너를 파괴하지 않고 내부를 관찰할 수 있습니다. 또한 MicroCon 컨테이너 또는 칩은 일반적인 면역 염색 및 면역 형광법에 사용할 수 있으므로, 마이크로 컨테이너 내부의 모든 종류의 마커와 기관형성 기능을 검출할 수 있습니다.

여기 칩의 애니메이션에서 볼 수 있듯이, 바닥면뿐만 아니라 MicroCon 컨테이너 벽면까지 세포로 완전히 채워져 있습니다. 활성이 매우 높은 세포가 충분히 확보되었으며, 죽은 세포는 매우 적은 상태입니다. 다음 사진은 MicroCon 컨테이너 내부에서 모든 종류의 장기 유사 기능을 검출할 수 있음을 보여줍니다.

예를 들어, 간세포의 경우 albumin 생성 또는 세포 내 E-cadherin 발현을 확인할 수 있으며, 이는 여기 오버레이 이미지에서 명확하게 보입니다. 핵은 파란색으로 염색되었습니다. E-cadherin은 녹색으로 염색되었으며, albumin은 붉은색으로 발현 또는 염색되었습니다.

여기서 잘 보시는 바와 같이, 간세포에서 기대하는 모든 장기형성 기능이 이러한 방식의 3D 배양에서 잘 발현됩니다. 또한, 또 다른 간세포 마커인 cytokeratin 18을 살펴보았으며, 이 사진은 이러한 배양에서도 Cytokeratin 18이 잘 발현됨을 보여줍니다. 이를 통해 이러한 장기형성 기능이 다른 장기형성 배양에서도 유용하게 활용될 수 있음을 확인하실 수 있을 것입니다.

Biore 실험이 종료된 후, 이 칩은 총 RNA와 같은 모든 종류의 세포 성분을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 바이오리액터 시스템에서 분리한 총 RNA를 보여드리겠습니다. 이 총 RNA는 실시간 PCR 또는 여기에서 보시는 마이크로어레이 분석과 같은 후속 응용 분석에 사용할 수 있습니다.

또한, 시스템에서 온전한 세포를 분리할 수 있으며, 분리된 세포는 기존의 유세포 분석(flow cytometry analysis)에 사용할 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 본 시스템이 장기 유사 반응(organotypic reactions)이 필요한 모든 종류의 응용 분야에 유용할 수 있으며, 줄기세포 응용 분야와 같이 지금까지 고려하지 않았던 모든 종류의 응용 분야에도 유용하게 활용될 수 있음을 보여드리고자 합니다.