Name: Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 배우세요 칩 기반 perfused 마이크로 bioreactor를 이용한 입체 세포 배양 기법. 콜라겐 코팅과 무균 순환 시스템으로 최대 1,000만 개 세포를 정밀 제어하며 배양할 수 있습니다.

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우리는 우수 기술 지원 Mechthild Herschbach 및 Anke Dech 감사하고 싶습니다.

본 논문은 세포 라인뿐만 아니라 기본 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼 (그림 1)의 사용을 설명합니다. 많은 세포는 3D - 환경에서 표현 organotypic 기능을 할 때문에, 우리는 세포가 모든 공간 방향으로 준수 수있는 발판을 제공하는 폴리머 칩을 개발, 그것은 유체 흐름의 제어를위한 생물 반응기의 주택에 설치할 수 있습니다 , 실험 설계에 따라 산소 장력 등은 고분자의 표면은 다양한 기법, 예를 들어, UV - 조사, PECVD, γ - 접목 또는 전통적인 서부 유럽 표준시 화학에 의해 수정할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="564_Figure - 01.png" width="546" height="386" /> 그림 01 1. 데 - 폭기와 칩의 hydrophilisation 사용하기 전에 칩은 deaerated 및 hydrophilized 수 있습니다. 이를 위해, 알코올 시리즈는 수행됩니다. DMPC - 처리된 물 이소프로판올 100 %, 70 %, 50 %, 30 %로 구성된 이소프로판올 해결책이 준비되고 칩이 100 % 솔루션으로 시작, 각 농도에 담근이며, 30까지를 위해. 시리즈의 마지막 단계는 순수 디메틸 pyrocarbonate (DMPC) 처리 물로 구성되어 있습니다. 이 시점부터, 그것은 칩 젖어도 유지하는 것이 중요합니다. 2. 콜라겐 I 코팅 알코올 시리즈 후,이 칩은 일반적으로 쥐의 꼬리에서 콜라겐 전 솔루션으로 코팅됩니다. 0.2 % 초산 2 MG / ML의 콜라겐 주식 솔루션에서 30 μg의 콜라겐 단백질에 해당하는 나누어지는 150 μl의 최종 볼륨 DMPC - 처리된 물로 희석합니다. 10 μg의 콜라겐 I 당 cm 2 면적의 밀도 칩 표면의 콜라겐 코팅이 발생합니다. 3. 간세포암 세포의 접종 라인 형 간염 G2의 간세포암 세포는 trypsinized와 계산됩니다. 단기 실험 (1~6일) 5 * 10 6 세포는 각 칩 및 해당 컨트롤 6cm 조직 문화를 배양 접시에 주사를하고 있습니다. inoculte하려면 칩 5 * 10 6 세포를 150 μl 문화 매체 resuspended 및 칩의 microstructured 영역 (그림 2)의 상단에 표시됩니다. 나중에, 그것은 2~3시간위한 인큐베이터에 배치됩니다. 마이크로 용기에이 잠복기 동안 세포가 침전물과 콜라겐 I - 코팅 발판을 준수. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="564_Figure - 02.png" width="300" height="225" /> 그림 2 4. 생물 반응기의 주택에 칩 삽입 잠복기 후, 칩은 인큐베이터에서 제거되고 생물 반응기의 주택에 탑재. 이를 위해, 클린 벤치 아래 preassembled 생물 반응기는 멸균 포장에서 제거되고 칩의 삽입을 허용 정도 분해. 이 칩은 신중하게 살균 포셉과 처리 및 칩과 어떤이 생물 반응기의 상단과 하단 구역의 세대 결과 물개 개스가 들어있는 홈에 배치됩니다. 그 다음, 생물 반응기를 다시 조립하고는 펌프에 연결되어있는 보육, 가스 공급 및 산소 분석기로 전송됩니다. 5. 시스템의 필링 즉시 생물 반응기는 중간 저수지에 연결되어로, 펌프 및 가스 폐쇄 순환 루프가 매체로 가득 공급. 이것은 칩의 상단을 통해 매체의 흐름으로 정의됩니다 superfusion가, 달성할 수있는 방법으로 3 방향 - 커넥터 위치에 의해 이루어집니다. 이것은 발판에서 세포를 제거하지 않고 생물 반응기 순환에서 동봉된 공기의 배출로 연결됩니다. 시스템이 완전히 매체 가득 후 3 방향 - 커넥터는 조직을 통해 칩 아래의 흐름으로 정의됩니다 재관류가, 달성할 수있는 방법으로 전환됩니다. 재관류 구성의 흐름은 hepatocytes 일반적으로 60-500 μl / 분 범위에서 세포의 요구에 조정됩니다. 6. 샘플링 실험을 진행하는 동안 매체 샘플 그려져 수 있습니다. 이 경우, 주사기는 매체 저수지 위에 멸균 포트에 연결되어 있습니다. 샘플링 후, 포트는 70% 이소프로판올로 소독하고 있습니다. 7. 하류 애플 리케이션을위한 칩에서 손상 세포의 분리 실험의 끝에서, bioreactors는 클린 벤치에 전송 및 이전 설명된대로 분해, 가스 공급 및 롤러 펌프에서 연결됩니다. 무균 포셉와 칩이 생물 반응기 하우징에서 제거, 배치3.5 cm 배양 접시에와 PBS로 씻어서. 그 후,이 칩은 microstructured 영역에서 세포를 분리하는 인큐베이터에서 5-15 분 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 % / 0.53mM)와 incubated입니다. 수집된 세포 현탁액을 600 G.에서 5 분 centrifuged입니다 세포는 다음 종래의 하류 애플 리케이션, 예를 들어, 총 RNA 또는 단백질 분리에 사용할 수 있습니다. 일상적으로 우리는 microarray 분석 및 실시간 RT - PCR을위한 총 RNA를 (파리 키트, 앰비온 주식 회사, 오스틴, 텍사스, 미국) 분리. 단백질 표정은 레이저 스캔 현미경으로 칩 내부의 세포의 immunohistochemical 얼룩 후 분석이다뿐만 아니라 유동세포계측법에 의해, 예를 들어, 그렇지 않으면 분석하실 수 있습니다.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

우리는 적극적으로 perfused bioreactors의 마이크로 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반 플랫폼을 개발했습니다. 칩은 마이크로 사출 성형, 핫 엠보싱뿐만 아니라 마이크로 thermoforming 기술 3 생분해성 고분자 비 생분해성에서뿐만 아니라 제작하실 수 있습니다. 실험 설계에 따라 고분자의 표면은 UV - 방사선 사에 의해 수정할 수 있습니다. 표현 몇 가지 간 특정 유전자의 분석뿐만 아니라 간 특정 단백질 5,6의 분석에 의해 표시 수로 Hepatocyte 세포 라인뿐만 아니라 기본 쥐 hepatocytes가 성공적으로 이러한 장치에 재배하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>세포</td><td>기타</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>rat tail 유래 Collagen I</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>PARIS 키트</td><td>시약</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anti cytokeratin 18</td><td>항체</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>1차 항체, Mouse monoclonal, PBS에서 1/100로 사용</td></tr><tr><td>Anti E-cadherin</td><td>항체</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>1차 항체, Mouse monoclonal, PBS에서 1/50로 사용</td></tr><tr><td>Goat anti-albumin</td><td>시약</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>1차 항체, goat anti-human Albumin, PBS에서 1/200로 사용</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse IgG1</td><td>항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>2차 항체, Alexa Flour 488 결합, PBS + 0.5 % BSA에서 1/100로 사용</td></tr><tr><td>Cy3 anti-goat IgG</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG 항체, PBS + 0.5% BSA에서 1/700로 사용</td></tr></tbody></table>

perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

우리는 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 세포 배양 시스템을 개발했습니다. 이 칩은 일반적으로 비 생분해성 고분자, 예를 들어, 폴리 카보 네이트 또는 마이크로 사출 성형에 의해 polymethyl 메타 크릴 레이트, 마이크로 핫 엠보싱 또는 thermoforming 마이크로에서 제조됩니다. 그러나, 그것은 또한 바이오 분해 고분자로부터 제조된 수 있습니다. 그 전체 크기는 0.7 일아르 X 20 X 20 X 0.7 1mm (hxwxl). 사용 칩의 주요 특징 중 하나 1,156 입방 마이크로 용기 (CF - 칩)을 최대 격자 각 120-300의 크기 X 300 X 300 μ (hxwxl) 또는 300 μ의 직경과 원형 recesses와 깊이 300 μ (R - 칩). 발판 10 미오를 집 수 있습니다. 3 차원 구성에 세포. 최적의 영양 및 가스 공급,이 칩은 생물 반응기의 주택에 삽입됩니다. 생물 반응기는 가장 간단한 구성에서, additionaly 롤러 펌프 및 가스 공급 중간 저수지 구성되어 있습니다, 폐쇄 steril 순환 루프의 일부입니다. 생물 반응기는 재관류, superfusion, 또는 혼합 작동 모드에서 실행할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 몇 주간의 기간 동안 세포 라인뿐만 아니라 기본 세포를 재배했습니다. 쥐의 주 간 세포에 대한 우리는 이상의 2 주 동안 organotypic 기능의 보존을 보여줄 수 있어요. 간세포암 세포 라인을 위해하거나 약간 표준 monolayer 문화에서 표현하지 간 특정 유전자의 유도를 보여 수 있습니다. 줄기 세포 라인 첫번째 차별화 실험 이후 줄기 세포 배양 시스템은 유망 것처럼 또한이 시스템은 유용할 수 있습니다.

우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

당사는 세포의 3차원 배양을 위한 칩 기반 세포 배양 시스템을 개발하였습니다. 이 칩은 일반적으로 ...로 제조됩니다.

안녕하세요, 저는 웨어 공과대학교(Ware Institute of Technology) 생물학적 인터페이스 연구소의 연구원 에릭 고트발트(Eric Gottwald)입니다. 오늘은 저희의 칩 기반 관류 마이크로 생체활성 시스템을 소개해 드리고자 합니다. 세포 배양 응용 분야에 칩을 사용하기 전에, 먼저 폴리머를 가수분해하고 미세 구조 영역의 탈가스 처리를 해야 합니다.이는 칩을 100%부터 시작하여 서로 다른 농도의 isopropanol에 담그는 방식으로 수행됩니다. 각 농도에 칩을 단 몇 초 동안만 담그며, 마지막 단계는 물을 사용하는 것입니다. 그 후 칩을 건조시키고, 최종적으로 폴리머에 세포 부착을 용이하게 하기 위해 collagen type I 용액으로 칩을 코팅해야 합니다. 이는 마이크로 구조 영역 위에 collagen type I 용액을 몇 방울 떨어뜨려 수행하며, 이 상태로 칩을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.콜라젠 원 솔루션(collagen one solution)으로 하룻밤 동안 배양한 후, 솔루션을 제거하고 칩을 멸균된 PBS로 세척합니다. 그 후 PBS를 제거하면 칩에 세포를 접종할 준비가 됩니다. 이제 단일 세포 현탁액을 사용하여 세포 칩에 접종하는데, 이는 마이크로 구조 영역 위에 세포 현탁액 150 µL를 올리는 방식으로 진행됩니다. 세포를 도포한 후, 칩을 배양기에서 37 °C로 3시간 동안 배양합니다.3시간의 배양 기간이 지난 후, 칩을 인큐베이터에서 꺼내어 이제 ector에 삽입할 준비를 합니다. 이를 위해 ector를 멸균 포장에서 꺼내는데, 이 투명 포일의 멸균 상태는 감마선 조사를 통해 유지됩니다. 따라서 패키지를 열고 ector를 꺼내기만 하면 됩니다.다음으로 진행할 단계는 칩을 삽입하기 위해 바이오리액터 하우징을 분해할 수 있도록, 병의 윗부분을 이 배지 저장조에 삽입하는 것입니다. 바이오리액터 하우징을 연 후, 칩을 하우징의 홈에 배치하여 삽입하며, 이제 바이오리액터를 다시 조립할 수 있습니다. 마지막으로 배지 저장조에 두 개의 멸균 필터와 하나의 멸균 샘플링 포트를 연결해야 합니다.폐쇄 순환 루프 내의 실제 산소 분압을 측정하기 위해, 두 개의 커넥터 사이에 두 개의 산소 센서를 장착하여 삽입합니다. 이제 bactor에 배양액을 채울 준비가 되었습니다. bactor 시스템에 세포 배양액을 채울 준비가 완료되었으며, 이는 폐쇄 순환 루프를 롤러 펌프에 연결함으로써 간단히 수행할 수 있습니다.이를 통해 전체 벅터(bactor) 순환계를 동시에 감압합니다. 여기 엑터(Ector) 창에서 볼 수 있듯이, 배지가 아래에서부터 점점 차올라 상단의 벅터를 빠져나가는 것을 확인할 수 있습니다. 벅터 시스템을 인큐베이터에 넣기 전에, 순환 루프에 기포 없이 채워졌는지 확인합니다.이제 시스템이 세포 배양 배지로 완전히 채워졌으므로 바이오리액터를 인큐베이터로 옮길 수 있습니다. 이제 바이오리액터를 배양 챔버 안에 배치하겠습니다. 이를 위해 먼저, 앞서 보신 것처럼 바이오리액터를 롤러 펌프에 연결하고, 이제 병에 든 배지가 바이오리액터로 활발하게 관류됩니다.또한 주변 산소 농도를 유지하기 위해 배지 저장소를 가스 공급 장치에 연결합니다. 마지막으로, 시스템 내 산소 분압을 온라인으로 모니터링하기 위해 두 개의 산소 센서를 순환 경로에 연결합니다. 이제 설정이 완료되었으며, 설계한 실험 기간만큼 작동시킬 수 있습니다.MicroCon 컨테이너 내부 세포의 기관형성 기능 분석 시 가장 강력한 도구 중 하나는 여기 보이는 레이저 스캐닝 현미경입니다. 레이저 스캐닝 현미경을 이용하면 각 MicroCon 컨테이너를 파괴하지 않고 내부를 관찰할 수 있습니다. 또한 MicroCon 컨테이너 또는 칩은 일반적인 면역 염색 및 면역 형광법에 사용할 수 있으므로, 마이크로 컨테이너 내부의 모든 종류의 마커와 기관형성 기능을 검출할 수 있습니다.여기 칩의 애니메이션에서 볼 수 있듯이, 바닥면뿐만 아니라 MicroCon 컨테이너 벽면까지 세포로 완전히 채워져 있습니다. 활성이 매우 높은 세포가 충분히 확보되었으며, 죽은 세포는 매우 적은 상태입니다. 다음 사진은 MicroCon 컨테이너 내부에서 모든 종류의 장기 유사 기능을 검출할 수 있음을 보여줍니다.예를 들어, 간세포의 경우 albumin 생성 또는 세포 내 E-cadherin 발현을 확인할 수 있으며, 이는 여기 오버레이 이미지에서 명확하게 보입니다. 핵은 파란색으로 염색되었습니다. E-cadherin은 녹색으로 염색되었으며, albumin은 붉은색으로 발현 또는 염색되었습니다.여기서 잘 보시는 바와 같이, 간세포에서 기대하는 모든 장기형성 기능이 이러한 방식의 3D 배양에서 잘 발현됩니다. 또한, 또 다른 간세포 마커인 cytokeratin 18을 살펴보았으며, 이 사진은 이러한 배양에서도 Cytokeratin 18이 잘 발현됨을 보여줍니다. 이를 통해 이러한 장기형성 기능이 다른 장기형성 배양에서도 유용하게 활용될 수 있음을 확인하실 수 있을 것입니다.Biore 실험이 종료된 후, 이 칩은 총 RNA와 같은 모든 종류의 세포 성분을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 바이오리액터 시스템에서 분리한 총 RNA를 보여드리겠습니다. 이 총 RNA는 실시간 PCR 또는 여기에서 보시는 마이크로어레이 분석과 같은 후속 응용 분석에 사용할 수 있습니다.또한, 시스템에서 온전한 세포를 분리할 수 있으며, 분리된 세포는 기존의 유세포 분석(flow cytometry analysis)에 사용할 수 있습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 본 시스템이 장기 유사 반응(organotypic reactions)이 필요한 모든 종류의 응용 분야에 유용할 수 있으며, 줄기세포 응용 분야와 같이 지금까지 고려하지 않았던 모든 종류의 응용 분야에도 유용하게 활용될 수 있음을 보여드리고자 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

주로 monolayer 문화 - - 종종 차별화된 기본 세포가 상대적으로 짧은 수명을했고 문화 중에 드 차별되는 단점을 앓고 체외 배양 시스템에서 과거 많은에서. 그 결과, 그들의 장기 특정 기능의 대부분은 급속하게 손실되었다. 따라서 체외에서 이러한 세포에 대한 더 나은 조건을 재현하기 위해, 수정 및 adaptations는 기존 monolayer의 문화되었습니다.

인터뷰 : 줄기 세포 연구에 대한 Bioreactors와 분수 - 수정된 3D - 공사장 공중 발판

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기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

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장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

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신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

배우세요 칩 기반 perfused 마이크로 bioreactor를 이용한 입체 세포 배양 기법. 콜라겐 코팅과 무균 순환 시스템으로 최대 1,000만 개 세포를 정밀 제어하며 배양할 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

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