Name: Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 학습하세요 Qa-1 단백질 epitope 매핑을 위한 겹치는 펩타이드 라이브러리 설계 방법을. 이 기술은 Qa-1 제한 CD8 T 세포를 자극하여 면역 조절 및 자가면역 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 그녀의 기술 지원 및이 원고 준비에 대 한 페넬로페 가르시아를 감사합니다. 이 작품은 Loma Linda 대학 (681205-2967)에서 약 학과에서 연구 혁신 그랜트 (RIG)와 XT에 국가 다 발성 경화 증 사회 (PP1685)에서 파일럿 그랜트에 의해 지원 되었다.

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 동물 관리 및 사용 텍사스 대학교 엘 파소 그리고 Loma Linda 대학에 위원회에 의해 승인에 따라 수행 되었다.
1. 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 생성
<ol>
	<li>설계는 OLP 라이브러리는 모든 펩 티 드, 길이 15-메 르 이며 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 참고: MOG OLP 연구에 MOG 전조 [생쥐]의 시퀀스 검색 NCBI 단백질 데이터베이스에서이 링크를 수행 하 여: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. 집 고 양이 전조 (247 아미노산), 신호 및 성숙한 펩 티 드를 포함, 보고 된 Qa-1 (HLA-E) epitopes의 대부분은 신호 펩 티 드 (예: Qdm1)에 위치 해 있기 때문에 사용 되었다. 그것의 N-말단에서 시작, 15-메 르 펩 티 드의 시퀀스를 두 개의 인접 한 펩 티 드 11 아미노산 (그림 1)에 의해 중첩 확인 되었다. 따라서, 정확 하 게 59 OLPs 247 아미노산 MOG 전조에서 확인 되었다. 그러나, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택 하는 또한,+ T14,15 세포 CD8 epitopes 인식으로 처리 .</li>
	<li>상업적으로 각 개별 펩 티 드를 구입. 펩 티 드 당 5 mg 심사에 대 한 충분 해야 합니다. 잘린된 펩 티 드 (단계 6.1) OLPs desalted 펩 티 드 (순도 약 50-70%)를 하실 수 있습니다. 최적의 펩 티 드 (단계 6.2) tetramer의 세대와 미래 생물학 분석 사용 될의 순도 이어야 한다 &#62; 90%. 무 균 조건 하에서 펩 티 드 reconstitute</li>
	<li>100 %DMSO 50 mg/mL 개별 펩 티 드 주식을 확인 합니다. 각 펩 티 드의 5 mg 추가 각 튜브에 DMSO의 100 μ 혼합, 그리고-20 ° c.에 펩 티 드 저장 이러한 주식 CD8의 세대에 대 한 OLP_pool 재고를 확인 하는 데 사용 됩니다+ T 셀 라인 반응 하는 OLP_pool. 또한, 이러한 주식은 또한 만들기 위하여 이용 될 10 mg/mL OLP_pool 반응 CD8에서 Qa 1 제한 반응을 자극 하는 각 개별 펩 티 드의 능력을 결정 하기 위한 개별 펩 티 드 주식+ T 세포 라인.</li>
	<li>신선한 관으로 각 펩 티 드의 동일한 볼륨을 추가 하 여 확인 OLP_pool 주식. 이 OLP_pool 주식 100 %DMSO 포함합니다. 집 고 양이 OLP 연구에서 59 OLPs12했다. 따라서, 농도 OLP_pool에서 각 펩 티 드의 847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) 이었다.</li>
	<li>희석 (5 x) 10 mg/mL 개별 펩 티 드 주식 하 게 살 균 H2O (이 주식 포함 20 %DMSO) V 하단 96 잘 접시에서 50 mg/mL 주식. 각 개별 펩 티 드의 Qa 1 제한 응답의 결정 96 잘 접시 8 또는 12 채널 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다 때문에이 주식 96 잘 접시에 확인 합니다. 참고: 모든 펩 티 드, OLPs 및 잘린된 펩 티 드를 포함 하 여 V-하단 96 잘 접시에 희석 해야 합니다 또는 96-잘 샘플 랙 가득 1 mL 튜브 때문에 펩 티 드 라이브러리 심사 96 잘 접시 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다. 경우에 희석 한 펩 티 드, 펩 티 드를 분해 수 있도록 현명한 1 N NaOH 방울을 추가 하는 것이 어렵습니다.</li>
</ol>
2. 못쓰게 K의b-/- Db-/- CD8+ OLP_pool 펄스 k T 세포b-/- Db-/- 모 수석 세포 (DCs).
참고: 두 개의 주요 Qa 1 대립 유전자에 있다: 하나는 Qa-1는, 그리고 다른 Qa-1b. 학술 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 동물, 이후 예 C57BL/6, Balb/c 마우스, Qa-1b,이 프로토콜 매핑 Qa-1b epitopes는 단백질에 대 한 절차를 설명 합니다. CD8+ T이이 프로토콜에 사용 되는 세포에서에서 순화 된다b-/-Db-/- 는 CD8에 마우스 (C57BL/6 배경)+ T 세포 Qa-1 등 아닌 클래식 Ib MHC 분자에 의해 주로 제한 됩니다.
<ol>
	<li>앞에서 설명한12골 파생 된 Dc를 생성 합니다.
	<ol>
		<li>간단히, RPMI-10 매체 (RPMI 1640 10% 태아 둔감 한 혈 청, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 골 수 단일 셀 정지 (1 x 106 셀/mL)를 문화 10 U/mL IL-4를 포함 하는 6-잘 접시 (4 mL/잘) 37 ° C, 5% CO2에서 100 U/mL GM-CSF.</li>
		<li>2 일 후, 신중 하 게 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 미디어와 cytokines를 추가 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 동안 세포를 배양 한 후 신선한 미디어와 cytokines 새로운 6 잘 플레이트에 포함 된 비 부착 한 세포를 전송 합니다.</li>
		<li>또 다른 2 일 셀 문화 및 신선한 미디어와 LPS를 포함 하는 cytokines 보충 (0.1 µ g/mL)는 Dc를 활성화.</li>
		<li>24 시간 후, 실험에 대 한 Dc를 수집 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 Dc 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 Dc (5 x 107 셀/mL)을 치료 (50 μ g/mL) 20 분에 대 한 37 ° C에서 PBS에 추가할 RPMI-0 (혈 청 없이 RPMI 1640) (~ 12 mL) 튜브를 g. 삭제 supernatants repea x 300에 탁상 원심 분리기에서 10 분에 대 한 셀을 회전 t 세척 절차 두 번 더입니다. 이러한 세 가지 세척은 중요 한 어떤 추적 미토마이신 C 양의 CD8의 응답을 억제 수 있습니다 때문에+ T DC-T 세포 공동 배양 중 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체 (목표-V 세럼 무료 매체 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 DC 농도 조정 합니다.</li>
	<li>최종 DMSO 농도 0.5% (200 x) 일 것 이다 그런 Dc에 100 %DMSO 포함 하는 OLP_pool 재고 솔루션을 추가 합니다. 집 고 양이 OLP 연구에는 OLP_pool에서 각 OLP의 농도 847.46 μ g/mL; 따라서 DC 문화에 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) 이었다.</li></ol>그러나,이 농도 세포 배양에서 DMSO 농도 남아 1% 미만으로 100 μ g/mL까지 확장할 수 있습니다.
	<li>3 시간 실 온에서 Dc를 품 어 고 흔들어 셀 부드럽게 매 15 분.</li>
	<li>이 잠복기 동안 CD8 정화+ T 세포 수확된 비장 또는 K의 림프절에서b-/-Db-/- 상업 CD8를 사용 하 여 마우스+ T 세포 정화 키트, 10 x 106 셀/ml에 셀 농도 조정 50 U/mL 인터 루 킨 2 (일리노이-2)와 일리노이-7의 100 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체.</li>
	<li>자, 추가 CD8 0.5 mL/잘으로 48-잘 접시로+ T 세포 (0.5 mL/OLP_pool 펄스 Dc 단계 2.8는 CD8의 최종 농도에서 추가 후에+ T 세포는 5 x 106 셀/mL을 될 것입니다). 참고: CD8+ T 마우스 비장 및 림프절에서 셀 제조업체에서 제공한 지시를 따라 CD8 긍정적인 격리 키트를 사용 하 여 순화 될 수 있다. CD8+ T 세포 얻은 구슬의 자유롭다.</li>
	<li>2 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체에서 OLP_pool 펄스 Dc OLP_pool 펄스 Dc (300 x g, 10 분) 실시간 Reconstitute에 아래로 회전 하 고는 CD8 포함 48-잘 접시에 0.5 mL/잘 추가+ T 세포 (최종 농도 OLP의 _pool 펄스 Dc 1 x 106 셀/mL, CD8의 최종 농도+ T 세포는 5 x 106 셀/mL, 일리노이-2의 최종 농도 25 U/mL 이며 일리노이-7의 최종 농도 50 U/mL). 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>4 일에 제거 하 고 문화 매체의 약 400 μ를 삭제 한 추가 100 U/mL 일리노이-2와 각 잘 일리노이-7의 100U/mL를 포함 하는 신선한 혈 청 자유로운 매체의 500 μ. 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어.</li>
	<li>당일 7 또는 8, 다시 OLP_pool 액 CD8 자극은 OLP_pool와+ T 세포.</li>

3. 끝났다 CD8 restimulation+ T 세포와 대 식 세포는 OLP_pool와 펄스
<ol>
	<li>OLP_pool 액 CD8의 다시 자극 하기 전에 4 일+ T 세포, 2% (v/v) polyacrylamide 비드 솔루션 준비: 20 mL에 두 번 polyacrylamide 구슬의 2 세대를 세척 하 여도 무료 H2O 또는 PBS. 5 분 동안 원심 분리 (400 x g)에 의해 작은 공의 polyacrylamide 구슬 고 100 mL PBS의에서 resuspend. 압력솥에서 15 파운드/m 실 온에서 20 분이 게에 대 한.</li>
	<li>Intraperitoneally 살 균 2 %polyacrylamide 비드 솔루션의 복 막 구멍16에 monocytes/대 식 세포의 마이그레이션 유치 1 mL/마우스와 함께 쥐를 주사.</li>
	<li>4 일 후, CO2 과다 하 여 동물을 희생.
	<ol>
		<li>무 균 조건 하에서 잘라는 작은 여 복 부의 중심에는 오프닝은 충분히 5 mL 전송 피 펫을 전달. 전송 피 펫 RPMI-0와 개방을 통해 복 부 캐비티에 피펫으로 삽입.</li>
		<li>Pipetting으로 복 부 구멍을 씻어. (이들은 복 막 대 식 세포) 무 균 튜브에 복 부 구멍에서 가능한 많은 액체 밖으로 플라스틱. 린스 단계 4-5 회 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3000 래 드와 복 막 대 식 세포 비추는
	<ol>
		<li>또는, 미토마이신 C와 복 막 세포 (2.2 단계에에서 설명 된 절차를 따르십시오.) 취급 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5 x 106 셀/ml 혈 청 자유로운 매체에 복 막 대 식 세포의 농도 조정 합니다. OLP_pool 재고 (최종 DMSO 농도 1% 미만)와 M-CSF를 추가 (최종 농도 = 100 U/mL). 참고:이 집 고 양이 OLP 연구에서 0.5 %DMSO 사용 우리. 따라서, 집 고 양이 OLP_pool 주식 MOG OLP_Pool 재고 복 막 대 식 세포의 199 μ에 추가 되었습니다 (예: 1 μ) x 희석된 200 했다. 따라서, 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL) 했다.</li>
	<li>48-잘 조직 문화 접시에서 200 μ/잘 (1 x 106 셀/잘)을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 접시를 품 어.</li>
	<li>비 부착 한 세포는과 polyacrylamide 구슬 200 μ/잘 미리 따뜻하게 RPMI-0의 부드러운 세척 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>수집 및 수영장은 OLP_pool 액 CD8 단계 2.10에서+ T 세포. 조정 하는 OLP_pool 액 CD8+ 1 x 106 셀/ml 25 U/mL 일리노이-2와 일리노이-7의 50 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 T 세포 농도. OLP_pool 펄스 복 막 대 식 세포를 포함 하는 48-잘 접시를 1 mL/음을 추가 합니다.</li>
	<li>4 일 후, 48-잘 접시에 매체를 보충. 제거 하 고 약 400 μ 48-잘 배양 배지에서 배양의 삭제. 각 우물에 신선한 혈 청 무료 중간 포함 100 U/mL의 일리노이-2 500 μ와 일리노이-7의 100 U/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2셀 문화.</li>
	<li>3 ~ 4 일 후, 검사 OLP_pool restimulated CD8 효소 연결 된 immunospot 분석 결과 (ELISPOT)에 의해 OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답+ T 세포. 이 시점 후 다시 자극 하는 CD8+ T 세포 모든 7-10 일. 참고: 대 식 세포는 OLP_pool 액 CD8의 다시 자극에 대 한 선호+ T 세포. 우리가 나타났습니다 CD8+ T 세포 대 식 세포에 의해 다시 자극된 Dc 시험관보다 더 성장 했다.</li>
</ol>
4. OLP_pool-특정의 결정, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8 T 세포 라인+
참고: OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8에서+ T 셀 라인 IFNγ 분 비 자극 C1R 또는 C1R 있을 때 OLP_pool에 의해 다음에 의해 결정 됩니다. Qa-1b 세포 IFNγ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. C1R 셀 상업적으로 얻어질 수 있다. C1R입니다. Qa-1 lentiviral 벡터와 C1R 셀 시험으로 Qa-1b 세포를 생성할 수 있습니다.
<ol>
	<li>추가 캡처 안티-IFN-γ 항 체의 100 μ/잘 ELISPOT 격판덮개의 우물에 코팅 버퍼 (PBS)에 희석 합니다.</li></ol>봉인 하 고 하룻밤 4 ° C에서 접시를 품 어.
	<li>두 번째 날, 캡처 안티-IFN-γ 항 체를 포함 하는 코팅 버퍼를 삭제 하 고 솔루션을 추가 200 μ/잘 blocking (혈 청 무료 매체) 실 온에서 2 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>C1R와 C1R 비추는. 9600 래 드와 Qa-1b 세포.
	<ol>
		<li>또는, C1R와 C1R 취급 합니다. 미토마이신 C 제외 하 고 치료 시간이 30 분 일 것 이다 단계 2.2에 설명 된 대로와 Qa-1b 세포.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C1R와 C1R 조정 합니다. 4 x 106 셀/mL 혈 청 자유로운 매체에서 Qa-1b 세포.</li>
	<li>접시에 차단 솔루션을 삭제 하 고 C1R와 C1R 추가. Qa-1b 세포 50 μ/잘 (200, 000 셀/잘)와 혼합.</li>
	<li>100 x 50 μ/잘 희석 OLP_pool 주식 (혈 청 무료 매체)에 추가 하 고 제대로 혼합. 2-3 시간 실 온에서 접시를 품 어.</li>
	<li>OLP_pool restimulated CD8 조정+ T 1-일리노이-7의 150 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 106 셀/mL x 2 세포와 50 μ/잘 (50000-100000 셀/잘) 접시에 추가. 5 분 동안 접시 (58 x g) 원심</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 접시를 밤새 품 어.</li>
	<li>세포 현 탁 액 발음 2 번 이온된 (DI) 수 (250 μ/잘)와 웰 스 워시. 웰 스 각 세척 단계에 5 분 동안 담가 수 있습니다.</li>
	<li>세척 우물 3 번 씻어 버퍼 나 (PBS 0.05 %Tween20 포함). 웰 스 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 있습니다. 워시 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>탐지 항 체 희석 버퍼 (PBS 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함)에 희석의 100 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>2 시간에 대 한 실 온에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>삭제 탐지 항 체 솔루션. 워시 3 번으로 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 I. 허용 우물 우물.</li>
	<li>1: 100 희석 시 희석 버퍼에 희석 효소 공액 (Streptavidin-HRP)의 100 μ/잘 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>효소 어원이 솔루션을 삭제 합니다. 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 나 수 스와 4 번 웰 스 워시.</li>
	<li>2 번 250 µ L/잘 씻어 버퍼 II (PBS)와 웰 스 워시.</li>
	<li>각 우물에 기판 솔루션 (혼합 1 방울 = 20 µ L의 AEC Chromogen AEC 기판의 1 mL와 함께) 100 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 60 분 별색 개발을 모니터링 합니다.</li>
	<li>원하는 결과 표시 시작, 웰 스 증류수로 세척 하 여 기판 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>2 h에 대 한 실 온에서 접시를 건조 나 완전히 건조 될 때까지 밤새. 접시 아래 플라스틱 트레이 제거 건조 촉진 한다. 분석 되 고 때까지 어둠 속에 봉인된 된 비닐 봉투에 접시를 저장 합니다.</li>
	<li>수동으로 해 현미경으로 검사 하거나 ELISPOT 플레이트 리더를 사용 하 여 명소를 열거 합니다. 그림 2에 대표적인 결과 참조 하십시오.</li>

5. 결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에는 OLP_pool 전용 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는+ T 셀 라인
<ol>
	<li>결정 개별 펩 티 드 OLP_pool 전용, OLP_pool 전용 CD8에서 Qa-1-restrictred IFN-γ 분 비를 자극 하는+ 위의 사용 하 여 T 세포 선 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (최종 농도 사용 각 개별 펩 티 드의 설명 ELISOPT에 대 한 분석 결과가 이다 10 μ g/mL). 그림 3에 대표적인 결과 참조 하십시오. 참고: OLP-특정, Qa-1-restircted 응답 C1R 존재 응답의 적어도 세 번은 응답으로 정의 됩니다. Qa-1b 세포는 OLP 없이. 집 고 양이 OLP 연구, OLP68, OLP96, 및 OLP105에서 모두이 기준을 만났다. 따라서, 모든 3 개의 OLPs는 잠재적으로 Qa 1 epitopes12 (그림 3)를 포함합니다. 그러나, OLP105는 일관 되 게 강한 응답; 준 따라서 우리는 OLP105의 상세한 분석을 수행 (그림 4 및 그림 5)12.</li>
</ol>
6. 신분증 OLP_pool 전용 CD8에 피토 프 전용, Qa 1 제한 응답을 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 Epitope의+ T 셀 라인
<ol>
	<li>C-와 N-말기 잘린 그림 4와 같이 15-메 르 OLP의 펩 티 드를 음성 합성.</li>
	<li>OLP 특정 CD8에서 IFN-γ 분 비 검사+ 자극 하는 CD8 T 세포 라인+ T C1R 또는 C1R 있을 때 부모의 15-메 르 OLP 잘린된 펩 티 드의 각 세포. 위의 사용 하 여 Qa-1b 셀 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 설명 합니다. 각 개별 펩 티 드 ELISPOT 분석 결과 대 한 사용의 최종 농도 10 μ g/mL 이다. 펩 티 드 경우 최적의 Qa 1 epitope로 정의 된다 펩 티 드: 1) 일관 되 게 원래 15 메 펩타이드, C1R 존재에 비해 비슷하거나 더 강한 IFN-γ 응답을 제공. Qa-1b 세포; 2)는 8-10 메 르 (9-메 르 펩타이드 선호) 사이 MHC에 바인딩된 펩 티 드 길이-나 분자15,17. 대표 결과 그림5에서를 참조 하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

여기, 우리는 Qa-1 단백질에 epitopes를 분석 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 프로토콜에 관하여 여러 가지 다른 전략 또한 이전 보고 했다. 첫째, 수용자 CD8+ T 세포와 클론 Qdm1의 식별을 위해 사용 되었다. 둘째, Qdm의 분석에서 상 상속 Qa 1 바인딩 모티브 HSP60p216-224와 TCRBV8.1 epitope9,18의 식별을 위해 사용 되었다. 단백질에서 셋째, 개별 겹치는 펩 티 드 면역 동물을 사용 했다. 그 후, CD8+ T 세포 면역된 동물에서 분리 된 TCRBV8.2 펩 티 드 p42-50 Qa-16,,1019바인딩 확인 이후에 식...

Qa-1 쥐에서 (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 그것의 인간 상 동 기관이 이다 HLA. 이전 증거 Qa 1 분자는 중요 한 생물 학적 기능을 시연 하고있다. 첫째, Qa-1 분자 셀 구조 및 기능적 무결성에 대 한 조사에서 중요 한 역할을 한다. 이와 관련, Qa-1 분자는 세포의 정상적인 기능을 모니터링 하는 몇 가지 전략을 진화 했다. 이러한 전략 중 하나는 Qa-1 분자를와 처리 지도자 펩 티 드 (epitope), 즉 Qa-1 결정 한정자 (Qdm) 바인딩과 그물1에 고아 한 MHC i a 분자에서 처리 되는 양식 단지를 수 있습니다. Qa-1/Qdm 단지 나중 세포의 표면에 표시 하 고 바인딩합니다 NK 세포에 금지 NKG2A 수용 체를 억제 하는 활동2를 죽이 NK. Ia MHC 분자의 표현을 손실 됩니다, 셀 (예: 악성 셀)2를 죽이 NK에 민감한 됩니다. 다른 전략 Qa 1 분자를 탭 (항 원 처리와 관련 된 전송)의 결핍은 세포의 표면에 새로운 Qa-1/epitope 복합물을 형성 수 있습니다3 또는 ERAAP (바인딩과 그물 aminopeptidase와 관련 된 항 원 처리)4 (둘 다 결핍이 자주 악성 세포에 발생). 표현 하는 이러한 새로운 Qa-1/epitope 단지 셀 수 다음 인식 하 고 피토 프 전용 CD8 Qa 1 제한에 의해 제거+ T 세포. 둘째, Qa-1 분자 면역 규칙5유도. 이와 관련, Qa-1/epitope 단지 표시 되었습니다 CD8 자극+ 자체 조직6,,78 의 면역 중재 손상의 예방에 대 한 중요 한 규제 T (Treg) 셀 ,910. 셋째, Qa 1 제한 CD8+ Treg 세포 바이러스 감염11에 대 한 면역 반응 제한 표시 되었습니다.
따라서, 특정 확대 epitope 관련 Qa-1-restrictred CD8의+ T 세포는 비정상적인 세포의 제거, 면역 조절의 향상 및의 크기의 제어 잠재적으로 유망한 전략 바이러스-유도 된 면역 응답입니다. 동안 여부 결정 되지 않은 확대 epitope 관련 Qa 1 제한 CD8의+ T 셀 수 면역 감시를 강화 하 고 면역 반응을 유도 하는 바이러스를 제한, 우리의 실험실과 다른 사람 명확 하 게 증명 하는 Qa 1 epitopes와 예방접종 CD8 Qa 1 제한의 기능을 강화할 수 있습니다+ Treg 세포 병원 성 면역 CD4에 대 한 특정+ T 세포, CD4의 효율적인 제어를 선도+ T 세포 중재 면역 질환에는 실험적인 알레르기 성 뇌 (인간 다 발성 경화 증 동물 모델)6,10, 콜라겐 유도 관절염 (인간 류 마티스 관절염 동물 모델)7, 등 다양 한 동물 모델 및 비만 아닌 당뇨병 (인간 타입-1 당뇨병의 동물성 모형)8. 또한, 우리는 면역 조직 관련 Qa 1 epitope와 CD8의 확대를 통해 그 조직에 염증 면역 중재의 특정 컨트롤에 리드 발견+ Treg 세포12. 전 임상 연구의 위의 성공을 나타내는 Qa 1 epitope 접종 및 잠재적으로 수돗물에 결핍과 관련 된 다른 질병의 치료에 대 한 조직의 특정 면역 중재 질병의 치료에 대 한 완전 한 평가 대 한 필요와 ERAAP입니다.
따라서, 안정적이 고 신속 하 게 Qa-1 단백질에 epitopes 분석할 수 있는 기술에 대 한 수요가 있다. 이와 관련, 제한 된 수의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes 설명 하고있다. 대부분 이러한 Qa 1 epitopes의 CD8의 연구 기간 동안 serendipitously 발견 했다+ T 세포 박테리아13, 셀 탭3결핍, 셀 ERAAP4, 결핍 및 EAE6, 발생 하는 셀에 대 한 응답 9. 따라서, 높은 처리량 기술 정의 된 단백질의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 바람직합니다. 다음, 우리를 사용 하 여 Qa-1-resrticted CD8 단백질에서 기능 Qa 1 epitopes는 겹치는 펩 티 드 (OLP) 라이브러리 전략 설명+ T 세포 단백질의 OLP 풀 (OLP_pool)에 대 한 특정 라인.

<table><tbody><tr>단백질의 <td>N/A</td> N<td>/A</td><td>염기서</td>열을 <td>분석할 단백질</td>은 NCBI</tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: D2650 SIGMA</td><td>DMSO에서 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Kb-/-Db-/- 마우스</td><td>The Lackson Laboratory</td><td>Stock#: 019995</td><td>우리는 더 이상 사용할 수 없는 Taconic H2-Kb<>H2-Db doube 녹아웃 마우스(Cat#: 4215-F 및 4215-M)를 사용했습니다.</td></tr><tr><td>AIM V 무혈청 배지</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 12055091</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>Trasfer 피펫</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: 137238</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48웰 조직 배양 플레이트</td><td>USA Scientific</td><td>Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC 처리 다중 웰 플레이트, 96웰, V자형 바닥</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml 딥 06웰 PP 플레이트, 멸균</td><td>USA Scientific</td><td>Item#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L: 217-17</td><td></td></tr><tr><td>안티-IFN-&감마 캡처; 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>Cat#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R. Qa-1b</td><td></td><td></td><td>맞춤형(GenBank 액세스#: NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Qa-1 렌티바이러스 벡터</td><td>GeneCopoeia</td><td>제품#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>검출 anti-IFN-&gamma; 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>AEC substrate</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoSpot 분석기</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>모든 immunoSpot 분석기는 이러한 목적으로 작동해야 합니다.</td></tr></tbody></table>

qa-1 단백질에 epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E 인간) (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 최근 데이터 품질-1 분자 구조 및 기능적 무결성에 대 한 셀과 유도 하는 면역 조절, 제한 하는 바이러스 감염에 면역 반응에 중요 한 역할 놀이 것이 좋습니다. 또한, Qa 1 제한 CD8의 기능 확대 epitope를 통해+ T 세포 면역 여러 자가 면역 질환 동물 모델, 예를 들면 실험적인 알레르기 성 뇌에에서 치료 효과 보이고 있다 콜라겐 유도 관절염, 그리고 비 뚱뚱한 당뇨병. 따라서, 효율적이 고 신속 하 게 단백질의 기능적인 Qa 1 epitopes 식별할 수 있는 방법에 대 한 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리가 Qa 1 제한 CD8 사용 프로토콜 설명+ T 셀 라인 Qa-1 단백질에 epitopes를 결정 하기 위한 중복 펩 티 드 (OLP) 라이브러리에 대 한 특정. 이 OLP 라이브러리 포함 15-메 르 겹치는 펩 티 드, 단백질의 전체 길이 커버 하 고 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 이 프로토콜을 사용 하 여, 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)에서 9-메 르 Qa 1 epitope 파악. 이 새로 매핑된 MOG Qa-1 epitope epitope 관련, Qa 1 제한 CD8 유도 표시 했다+ T 세포는 향상 된 myelin 특정 면역 규칙. 따라서,이 프로토콜은 소설 대상의 미래 조사 및 Qa 1 제한 CD8의 기능을 위한 유용한+ T 세포.

단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인
단백질의 N-말단에서 시작, 각 펩 티 드 15 아미노산 (15-메 르)입니다. 따라서, 첫 번째 펩 티 드 15 위치로 1 위치에 걸쳐. 두 번째 펩 티 드의 N-말단 겹치면 11 아미노산에 의해 첫 번째 펩 티 드의 C-터미널. 따라서, 두 번째 펩 티 드에 걸쳐 위치 19에 위치 5. (그림 1) 단백질의 C-말단의 끝에는 펩 티 드의 나머지 부분을 디자인 합니다. 우리는 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택+ T14,<sup class="xr...

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

이 절차의 전반적인 목표는 단백질에서 Qa-1 에피토프를 식별하는 것입니다. 이 방법은 면역 조절 및 면역 요법 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매핑된 펩타이드가 Qa-1 제한 CD8 T 세포를 자극하는 것으로 알려져 있고 절차를 수행하기 쉽다는 것입니다.이 기술의 의미는 다발성 경화증과 같은 면역 매개 질병에 대한 치료 설계로 확장됩니다. 이 방법은 동물의 Qa-1 매개 면역 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 인간의 HLA-E 매개 면역 조절에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 인접한 펩타이드가 11개의 아미노산에서 겹치는 15-mer 펩타이드 라이브러리를 설계합니다.멸균 조건에서 펩타이드를 획득하고 재구성합니다. 각 펩타이드에 대해 5mg의 펩타이드와 100마이크로리터의 디메틸설폭사이드를 결합하십시오. 각 펩타이드 스톡의 10마이크로리터를 깨끗한 1ml 극저온 튜브에 결합하여 OLP 풀 스톡을 준비합니다.그런 다음 각 펩타이드 스톡을 20마이크로리터의 V-바닥 96웰 플레이트에 로드하고 각 스톡을 80마이크로리터의 멸균수로 희석합니다. 나머지 50밀리리터 펩타이드 스톡과 밀리리터 펩타이드 스톡당 10밀리그램 플레이트를 모두 섭씨 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 무혈청 배지에 2밀리리터의 방사선 조사된 수지상 세포가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 10마이크로리터의 OLP 풀 스톡 용액을 추가하여 DMSO를 200배 희석합니다.나머지 OLP 풀 재고는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 3시간 동안 실온에서 OLP 풀을 사용하여 DC를 배양합니다. 15분마다 손으로 세포를 부드럽게 흔듭니다.배양 중에는 키트를 사용하여 수확된 마우스의 비장 또는 림프절에서 CD8+T 세포를 정제합니다. 무혈청 배지 1밀리리터당 1,000만 개의 T 세포와 50 단위의 인터루킨 2 및 100 밀리리터의 인터루킨 7 100 단위가 포함된 용액 5ml를 준비합니다. 정제된 CD8 T 세포는 비드가 없거나 손대지 않아야 합니다.0.5ml의 T 세포 용액을 48웰 플레이트의 10웰 각각에 놓습니다. OLP 풀 펄스 DC 용액의 배양이 완료되면 10ml의 무혈청 배지를 DC에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 300배 G로 세포를 원심분리합니다.그런 다음 5ml의 무혈청 배지에서 세포를 재구성합니다. 10개의 웰 각각에 0.5ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 섭씨 37도의 이산화탄소

overlapping-peptide-library-to-map-qa-1-epitopes-in-a-protein

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

여기에 우리가 현재 proteogenomic 도구 포고와 빠른, 양적, 포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 프로토콜 사용 참조 게놈에 질량 분석을 통해 식별 하는 펩 티 드의 매핑. 이 도구는 사용 하 여 통합 및 proteogenomic 및 개인 proteomic 연구와 직교 게놈 데이터 시각화의.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

학습하세요 Qa-1 단백질 epitope 매핑을 위한 겹치는 펩타이드 라이브러리 설계 방법을. 이 기술은 Qa-1 제한 CD8 T 세포를 자극하여 면역 조절 및 자가면역 질환 치료 연구에 활용됩니다.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

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