Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

이 절차의 전반적인 목표는 단백질에서 Qa-1 에피토프를 식별하는 것입니다. 이 방법은 면역 조절 및 면역 요법 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매핑된 펩타이드가 Qa-1 제한 CD8 T 세포를 자극하는 것으로 알려져 있고 절차를 수행하기 쉽다는 것입니다.

이 기술의 의미는 다발성 경화증과 같은 면역 매개 질병에 대한 치료 설계로 확장됩니다. 이 방법은 동물의 Qa-1 매개 면역 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 인간의 HLA-E 매개 면역 조절에도 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 인접한 펩타이드가 11개의 아미노산에서 겹치는 15-mer 펩타이드 라이브러리를 설계합니다.

멸균 조건에서 펩타이드를 획득하고 재구성합니다. 각 펩타이드에 대해 5mg의 펩타이드와 100마이크로리터의 디메틸설폭사이드를 결합하십시오. 각 펩타이드 스톡의 10마이크로리터를 깨끗한 1ml 극저온 튜브에 결합하여 OLP 풀 스톡을 준비합니다.

그런 다음 각 펩타이드 스톡을 20마이크로리터의 V-바닥 96웰 플레이트에 로드하고 각 스톡을 80마이크로리터의 멸균수로 희석합니다. 나머지 50밀리리터 펩타이드 스톡과 밀리리터 펩타이드 스톡당 10밀리그램 플레이트를 모두 섭씨 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 무혈청 배지에 2밀리리터의 방사선 조사된 수지상 세포가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 10마이크로리터의 OLP 풀 스톡 용액을 추가하여 DMSO를 200배 희석합니다.

나머지 OLP 풀 재고는 섭씨 20도에서 보관하십시오. 3시간 동안 실온에서 OLP 풀을 사용하여 DC를 배양합니다. 15분마다 손으로 세포를 부드럽게 흔듭니다.

배양 중에는 키트를 사용하여 수확된 마우스의 비장 또는 림프절에서 CD8+T 세포를 정제합니다. 무혈청 배지 1밀리리터당 1,000만 개의 T 세포와 50 단위의 인터루킨 2 및 100 밀리리터의 인터루킨 7 100 단위가 포함된 용액 5ml를 준비합니다. 정제된 CD8 T 세포는 비드가 없거나 손대지 않아야 합니다.

0.5ml의 T 세포 용액을 48웰 플레이트의 10웰 각각에 놓습니다. OLP 풀 펄스 DC 용액의 배양이 완료되면 10ml의 무혈청 배지를 DC에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 300배 G로 세포를 원심분리합니다.

그런 다음 5ml의 무혈청 배지에서 세포를 재구성합니다. 10개의 웰 각각에 0.5ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 섭씨 37도의 이산화탄소 농도 5% 대기에서 4일 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 각 웰에서 400마이크로리터의 배양 배지를 제거합니다. IL-2 및 IL-7 각각 100단위를 함유한 500마이크로리터의 신선한 무혈청 배지를 각 웰에 추가합니다. OLP 풀 프라이밍된 세포를 다시 자극하기 전에 2-3일 동안 세포를 더 배양합니다.

재자극 전에 마우스 복막 대식세포를 확보하여 조사합니다. 대식세포 농도를 무혈청 배지 1밀리리터당 500만 세포로 조정합니다. 10마이크로리터의 OLP 풀 스톡과 2밀리리터의 방사선 조사된 복막 대식세포를 결합하여 0.5%부피의 최종 DMSO 농도를 얻습니다.

이 용액에 1밀리리터당 100단위의 쥐 대식세포 집락 자극 인자를 보충합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 OLP-pool 대식세포 용액으로 48웰 플레이트를 채웁니다. 접시를 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다.

그런 다음 예열된 RPMI-0 배지 200마이크로리터로 각 웰을 부드럽게 씻습니다. 대식 세포 용액에는 많은 구슬이 포함되어 있습니다. OLP 풀 프라이밍된 CD8 T 세포를 추가하기 전에 현미경으로 플레이트를 검사하여 모든 웰에 비드가 없는지 확인해야 합니다.

다음으로, 재자극 준비가 된 OLP 풀 프라임 CD8+T 세포를 수집하고 풀링합니다. IL-2는 밀리리터당 25단위, IL-7은 밀리리터당 50단위를 포함하는 무혈청 배지에서 T 세포 농도를 밀리리터당 100만 개의 세포로 조정합니다. 1ml의 풀링된 T-세포 용액을 OLP 풀-펄스 대식세포를 포함하는 각 웰에 추가합니다.

섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 4일 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 각 웰에서 약 400마이크로리터의 매체를 제거합니다. 각 웰에 IL-2 및 IL-7 각각 100단위를 함유한 500마이크로리터의 신선한 무혈청 배지를 추가합니다.

동일한 조건에서 배양을 재개합니다. 3-4일 후, 인터페론-감마 효소 결합 면역 스폿 분석을 통해 OLP 풀 특이적 Qa-1 제한 반응에 대해 재자극된 세포를 검사합니다. 결과를 기다리는 동안 3-4일마다 CD8+T 세포 배지를 새로 고칩니다.

어떤 펩타이드가 OLP 풀 특이적 Qa-1 제한 인터페론-감마 분비를 생성하는지 확인하기 위해 희석된 펩타이드 스톡으로 ELISPOT 분석을 수행합니다. 마지막으로, 최적의 Qa-1 에피토프를 식별하기 위해 ELISPOT으로 절단된 펩타이드 시리즈를 평가합니다. 인터페론-감마 ELISPOT 분석은 풀링된 MOG 중첩 펩타이드 라이브러리에 의해 자극된 CD8+T 세포가 C1R과 결합되었을 때 반점 형성 세포의 상당한 증가를 보여주었습니다.

Qa-1b 세포. 이는 T세포가 Qa-1 결합 펩타이드에 반응하고, MOG_pool세포가 하나 이상의 Qa-1 결합 에피토프를 함유하고 있음을 시사합니다. 풀에서 개별 펩타이드를 스크리닝하기 위해 또 다른 분석이 수행되었습니다.

3개의 펩타이드는 C1R이 있는 곳에서 반응보다 최소 3배 더 큰 반응을 보였습니다. 펩타이드가 없는 Qa-1b 세포. 이 중 반응이 가장 큰 펩타이드를 선택하여 추가 평가를 진행했습니다.

최적의 Qa-1 에피토프를 식별하기 위해 관심 있는 15-mer 펩타이드를 기반으로 절단된 펩타이드 라이브러리를 평가했습니다. 항원결정기는 이상적으로는 8-10메르이며 9메르가 선호됩니다. 또한, 최적의 에피토프는 15-mer 펩타이드와 유사하거나 더 강한 인터페론-감마 반응을 보일 것입니다.

nine mer N-말단 절단 펩타이드는 이러한 기준에 가장 적합하여 최적의 Qa-1 에피토프가 되었습니다. 개발 후 이 기술은 면역 조절 분야의 연구자들이 췌장과 같은 다른 조직의 면역 조절 연구를 위한 새로운 Qa-1 에피토프를 발견할 수 있는 길을 열었습니다. 방사선을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

연구자는 기관의 정책을 엄격히 준수하고 적절한 교육을 받아야 합니다.