Name: 비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 학습하세요 비강 및 기관지 점막 체액 샘플링을 위한 합성 흡수 매트릭스(SAM)를 이용한 비강흡수 및 기관지흡수 기법을. 이 비침습적 방법은 호흡기 질환 연구와 임상 진단에 활용됩니다.

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이 작품 여 제휴에서 건강 연구 (NIHR) 생물 의학 연구 센터 (BRC) 대 한 제국 국가 연구소, NIHR 건강 보호 연구 단위 (HPRU)에 제국 대학 런던에서 호흡기 감염에서 자금 지원 자금: 공중 보건 영국 (PHE)와 NIHR 제국 환자 안전 변환 연구 센터. 표현 그 저자와 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건 또는 공중 보건 영국 있습니다.

다음 프로토콜에 사용 되는 기법 있다 서쪽 런던 연구 윤리 위원회 (참조 번호 15/소호/0444)에 의해 승인 되었습니다.
1. 비 흡수 (없음)
<ol><li>
나 샘플링 이전 준비
	<ol>
<li>나를 들고 먼저 손을 씻고 고 장갑, 가급적 환자 앞에 넣어.</li>
		<li>머리 토치를 사용 하 여 비 강 검사 그리고 그들의 비 지배적인 엄지를 사용 하 여 코 구멍을 시각화 하는 환자의 코를 철회 하는 임상. 참고: 비 강 검 경 일반적으로 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>비 강 및 샘플링 이전 비 등을 시각화. 참고: 네어스 (콧구멍) 횡단면에서 라운드 하지 않습니다 그리고 그들은 바로 뒤로 서. 일반적으로, 비 열 등 돌출 또는 측면 벽에는 콧구멍의 들여쓰기로 볼 수 있습니다 비 강 심장으로 형성 매끄러운, 평면 내측 벽. 우리가 하려는 열 등에서 샘플 비, 기본 상피 이기 때문에 호흡기44의 간단한 ciliated 상피.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나 샘플링
	<ol>
<li>샘플링, 비 열 등에 대 한 평면 그것을 orientating는 콧구멍의 루멘을 부드럽게 나 샘을 전달.</li>
		<li>비 강 점 막에 샘을 집게 손가락을 사용 하는 기증자를 요구 하십시오. 나는 약간 격 이네요, 가능한 눈 급수와 MLF 흡수 될 수 있습니다. 참고: 성인, 우리 일반적으로 성능이 나 60 s.</li>
		<li>MLF의 흡수, 후는 콧구멍에서 나 장치를 제거 하 고 다시 원래 튜브에 넣어.</li>
		<li>실험실에서 즉시 샘플을 처리 하거나이 프로토콜의 뒷부분에 설명한 대로, 그들을 동결. 참고: 나는 다양 한 비 강 점 막 도전 모델, 그리고 다른 기도 질병 공부 되는. 그러나, 각 연구와 환자 인구에 대 한 다른 호흡기 샘플링 방법에 대 한 유효성 검사를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 기관지 흡수 (BA)
<ol><li>
바 샘플링 이전 준비 참고: 바 전문된 인력 상계 제품군에 의해 수행 됩니다.<ol>
<li>테 내려 바 장치를 배치 하기 전에 SAM은 압출 하 고 카 테 터로 다시 철수를 확인 합니다.</li>
		<li>바 환자에 실시, 사전 모의 바 상계 시뮬레이터에 실시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바 샘플링
	<ol>
<li>기도와 오른쪽 주 기관지 bronchoscope는 기관지 intermedius, 그냥 오른쪽 하단 및 오른쪽 중간 엽으로 사단을 인접의 수준에 전달 합니다. 참고: 우리가 일반적으로 샘플 기관지 intermedius에서 비록 기도 내의 다른 사이트를 샘플링할 수 있다. 카 테 터와 샘 관찰, 하나 bronchoscope 팁을 볼 수 없습니다. 우리는 bronchoscope 원하는 샘플링 사이트에 도달 했습니다 일단 바에 대 한 다음과 같은 간단한 단계를 관찰 합니다.</li>
		<li>화이트 팁 그냥 최대 1cm는 bronchoscope의 끝에 말 초 기도에 표시 될 때까지 아래로 카 테 터: 바 테는 bronchoscope의 동작 채널을 통해 삽입 합니다. 기도의 루멘의 중심에서 bronchoscope 및 카 테 터 팁을 유지. 카 테 터 팁과 마모는 점 막 하의 위험을 줄이기 위해 기관지 점 막의 접촉을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
		<li>샘 아웃: SAM 오른쪽 중간 또는 오른쪽 하단 엽 기도의 루멘으로 돌출 되도록 핸들 바 장치의 우울. 직접 비전 않도록 하는 샘은 기도 벽에 MLF 접촉 bronchoscope의 끝을 구 부. 30 점 막 벽에 평면 기도, 내 샘을 두고 s.</li>
		<li>샘에: 습 한 샘 프로브는 되도록 직선과 하지 구부러진 카 테 터의 끝에 다시 bronchoscope을 통해 봐. 필요한 경우, 카 테 터와 bronchoscope 팁 SAM을 다시를 주어질 수 있다. 직접 비전, 카 테 터에 다시 직선 샘을 부드럽게 철회. 참고: 경우에 카 테 터에 다시 샘을 제거 하는 어려움, 샘과 전체 장치 철수 기도에서 다시 내밀 었 다.</li>
		<li>카 테 터:는 bronchoscope의 동작 채널에서 전체 카 테 터를 철수.</li>
		<li>샘을 잘라: SAM 멸 균가 위로 잘라 고 얼음에는 cryotube에 넣어. 이 샘플은 다양 한 방법으로,이 프로토콜에 나중으로 처리할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 나 및 바 샘플 처리
참고: 나와 바에서 발생 하는 샘플의 실험실 처리에 대 한 다양 한 옵션을 확인 하 고 있습니다. 이러한 프로토콜은 나중에 사용 하기 위해 샘플을 저장 하 고 SAM에서 MLF 샘플 elute 추구 합니다.
<ol><li>
NA, BA 샘플의 즉각적인 처리에 대 한 옵션
	<ol>
<li>옵션 1: 추가 처리 전에 몇 시간 동안 얼음에 습 한 샘을 저장 합니다.</li>
		<li>옵션 2: 즉시 딥 프리즈 나 SAMs 컬렉션에 관. 마찬가지로,가 위, 샘플링 장치에서 제거 후, 극저온 튜브에 바 SAMs 동결.</li>
		<li>옵션 3: 직접 또는 깊은 동결 처리 이전 차입 버퍼 (300 µ L)에서 분리 된 샘을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA, BA 샘플에 대 한 차입 버퍼의 옵션 참고: MLF 샘플에서 분석 하는 것에 따라 차입 버퍼 선택 하 고 우리는 4 개의 주요 대안을 제안:<ol>
<li>미리 준비 된 분석 결과 버퍼 immunoassay 절차에 대 한 적합 한 사용. 이러한 버퍼 뿐만 아니라 단백질, 예를 들어, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1% 적은 양의 세제 (0.05%)를 포함 해야 합니다.</li>
		<li>또는 사용 하 여 세제의 큰 금액을 포함 하는 버퍼 세포 세포의 용 해 발생 합니다. 참고: 우리는 1% 농도에서 트리톤 X 또는 NP40를 포함 하는 버퍼를 사용 합니다. 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 SAM에서 eluted 수 cytokines와 발산에에서 일반적으로 결과 세포내와 세포 외 cytokines. 이러한 버퍼 단백질, 포함 되어야 하 고 1 %BSA 함께 만들어집니다.</li>
		<li>바이러스 성 RNA 또는 측정 호스트 RNA의 양이 많은 PCR 같은 RNA 측정에 대 한 습 한 샘에 직접 RNA 추출 버퍼를 추가 합니다. 참고: Chaotropic RNA 추출 버퍼 guanidinium 변성 단백질을 포함. 대안은은 immunoassay 또는 세포 세포의 용 해 버퍼에 포함 된 eluted MLF 액체에 RNA 추출 버퍼를 추가 하는 것 이다.</li>
		<li>Trifluoroacetic 산 등의 유기 용 매를 사용 하 여 지질과 대사 산물, 질량 분석 평가 대 한의 추출. 참고: 이러한 모든 시이 약의 세부 자료 섹션에 포함 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차입 기법
	<ol>
<li>위의 차입 기법 중 하나에 대 한 원하는 추출 버퍼 함께 2 mL 마이크로 원심 튜브에 SAM를 삽입 합니다.</li>
		<li>소용돌이 혼합 30에 대 한 샘플을 느슨하게 연결 된 체액 및 생체의 샘을 씻어 s.</li>
		<li>전체 샘플 복구를 보장 하기 위해, 습 한 샘 열을 추가 스핀 필터 미니에 사용 된 동일한 2 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 삽입 하 여 원심 차입을 수행 합니다. 참고: 두 가지 유형의 회전 필터 미니 열을 사용할 수 있습니다. 첫 번째 장소에서 SAM을 보유만 플라스틱 메쉬를 체액의 전체 차입을 허용 포함 되어 있습니다. 또는, 전염 성 재료를 사용 하는 경우 0.22 μ m 기 공 크기와 회전 필터를 사용 합니다. 이러한 필터 샘플을 소독 하 고 의심 Mycobacterial 감염 샘플에 적합. 그러나, 이러한 필터 버퍼, 일반적인 상호 작용을 통해 필터에 중재자의 바인딩을 최소화 하 미리 incubated 이어야 한다.</li>
		<li>소독된 집게를 사용 하 여 회전 필터에 습 한 샘을 전송. 집게를 오염을 방지 하기 위해 샘플 사이 변경 합니다.</li>
		<li>4 ° c 원심 분리기 샘플 미니 원심 분리기에서 16000 x g에서 20 분 동안 냉각</li>
	</ol>
</li>
	<li>
요약 예제 프로토콜
	<ol>
<li>실험실에서 라벨 2 mL 샘플 컬렉션에 대 한 마이크로 원심 튜브 및 차입 버퍼의 원하는 볼륨을 추가 (NA;에 대 한 일반적으로 300 µ L 바에 대 한 100 µ L). 뚜껑을 밀봉 하 고 얼음에 놓습니다.</li>
		<li>샘플링 (즉시 또는 실험실에서) SAM 다음 집게를 사용 하 여 핸들에서 제거 하 고 컬렉션 튜브 (이전 단계에서 생성)를 포함 하는 버퍼에 배치 됩니다. Microcentrifuge 튜브의 뚜껑은 안전 하 게 닫히고 얼음, 추가 처리를 위해 실험실에 샘플을 전송 확인 하십시오.</li>
		<li>30에 대 한 그들의 전송 컨테이너와 소용돌이 믹스에서 샘과 차입 버퍼를 포함 하는 튜브를 제거 s.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 샘을 제거 하 고 (또는 0.22 μ m 셀 루 로스 아세테이트 필터 없이) 스핀 열에 배치.</li>
		<li>컬렉션 튜브에서 차입 버퍼를 수집 하 고 유지.</li>
		<li>스핀 열, 샘, 원래 컬렉션 튜브 (또는 살 균 필터링 하는 경우 새로운 한 샘플링) 열 회전 컬렉션 버퍼를 추가. 이러한 방식으로 세척 액체 elute SAM에서 샘플을 수집 관으로 다시 회전 열을 통해 전달 합니다.</li>
		<li>뚜껑 봉인 (16000 x g, 20 분, 4 ° C) 샘플을 원심.</li>
		<li>원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 선반에 장소.</li>
		<li>튜브의 밀폐 뚜껑 열고 SAM를 포함 하는 스핀 열을 제거 합니다. 샘과 스핀 열에 적절 한 폐기물 컨테이너를 삭제 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 약 수로 튜브 내에 포함 된 eluate 이라는 극저온 튜브 합니다. 각 약 수에 eluate의 총 볼륨 및 볼륨을 기록 합니다.</li>
		<li>-80 ° C 냉장고에 밀봉된 저온 관 전송 및 사용까지 똑바로 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

기존 기도 샘플링 기법에서 결과 높은 변수;로 간주 다른 샘플링 기법 표준화 연구5이 분야 내에서 필요 합니다. NA, BA 비-침략 적 방식으로 MLF의 샘플링을 허가 있고 흥미로운 가능성이 건강 하 고 병 항공에 면역 반응 측정. 이 제공 하는 수많은 잠재적인 이점이 큰 내성, 샘플링의 속도, 샘플링, 자주 반복 하는 기능을 포함 하 여 기존 기술, 낮은 간 사용자 가변성, 기술과 면역 중재자5의 희석을 감소 . 기간 흡수 및 사용 처리 기술을 각 연구에 대 한 최적화와 샘플링 이벤트 사이 엄격 하 게 유지 있어야 합니다. 또한, 학사, 경우 기도 내에서 샘플링의 사이트 복제 되어야 합니다 신중 하 게 개인 사이.
나, 그리고 특히 바, 임상 연구에 대 한 여전히 비교적 새로운 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술의 장점을 대체 기법5에 대 한 주의 유효성 검사를 포함 하 여 수많은 연구에 그들의 사용에서 이어지고 있다. 이 소자 들은 CE 표시 장치 호흡 연구에서 광범위 한 사용에 대 한 준비로 지금입니다. NA, BA 대체 샘플링 기법 보다 훨씬 작은 샘플 볼륨에서 결과, 반면 높은 획득된 농도 낮은 풍부한 면역 중재자에 대 한 감도 향상 될 수 있습니다.
원하는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 NA, BA 샘플 수 직접 동결 이후 처리, 임상 연구 환경에서 연구 타당성을 강화. 샘플 처리에 대 한 프로토콜 특정 다운스트림 응용 프로그램에 맞게 적용할 수 있습니다. 제안된 처리 기술을 단백질 또는 지질 면역 중재자 또는 핵 산의 컬렉션에 사용할 수 있지만 각 연구에 대 한 최적화 되어야 합니다. 특히, MLF 다른 버퍼가 eluted 될 수 있습니다. 첫째, 점 막 cytokines, 발산, 및 항 체6,45측정 immunoassay 버퍼를 사용할 수 있습니다. 세제 상부와 버퍼 또한 세포내 cytokines의 포함을 허용 하는 세포 세포 발생을 보장 하기 위해 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 감염, 바이러스 성 결정에 대 한 버퍼를 사용 한다 Chaotropic RNA 추출 로드, mRNA과 미생물. 또는, lipidomics 및 질량 분석에 대 한 유기 용 매를 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 점 막 표면에서 직접 흡수 MLF의 호흡, 위장, 비뇨 생식 기, 및 다른 점 막 질환에서 잠재적인 사용 흥미로운 기술입니다. 그러나, 이러한 유망한 흡수 기술을 샘플링 및 개별 분석 (biomarkers) 각 질병에에서 대 한 기술 처리의 정확한 확인이 필요 합니다. 또한, 이러한 소설 정밀 점 막 샘플링 기법 혈액, 호흡, 및가 래와 같은 기존 샘플에 대 한 유효성 검사를 요구할 것 이다. 이러한 기법, MLF 미생물, cytokines, 발산, prostanoids, 및 항 체를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

대부분의 호흡기 질환 염증 반응, 원인과 알레르기 비 염, 바이러스 및 곰 팡이 감염, 결핵, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐에 호흡기 점 막 표면에서 샘플링에 대 한 긴급 한 필요가 있는 섬유 증 및 폐 암 1. 비인 두 aspirate (경찰청), 코 게 고 bronchoalveolar 게 (BAL) 위와 더 낮은 기도 샘플링에 대 한 일반적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 현재 가난한 내성, 염증 성 중재자의 희석 및 샘플링2를 자주 반복 하는 무 능력을 포함 하 여 상당한 문제. 경찰청 샘플링 한 대안 면봉, 몰려들었다 나일론, 면의 사용 이다 또는 레이 온3,4, 하지만이 또한 한계를가지고, 이후 그들은 불편 하 고 비 강 상피, 그리고 일부 경우 돌이킬 수 없는 바인딩의 손상을 일으킬합니다 염증 성 중재자5. 이러한 기술은 일반적으로 한 시간 이상 연속적으로 반복 수 없습니다 그리고 대체 기술을 더 낮은 풍부 cytokines 및 발산5,6의 검출에 대 한 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 이러한 기술과 관련 된 사용자 가변성 데이터를 더 큰 환자 동료의 요구의 결과로에 불일치를 생성할 수 있습니다.
또는, 천연 및 합성 스폰지를 사용 하 여 흡수 기술 점 막 표면에서 MLF 수집 하 사용 되었습니다. 안과 스폰지 천연 펄프 (예를 들어, Weck cel)의 구성 샘플 타 액, 자 궁 경부 및 질 분 비 물7에 사용 되었습니다. 또한, 폴 리 비닐 알코올 (PVA)에서 만든 합성 갯 솜 그리고 hydroxylated 폴 리 비닐 아세테이트 (HPVA) 활용된8되었습니다. 7 다른 흡수 성 물자 폴리우레탄 미니 스폰지 인간의 눈물10수집 하 사용 되었다 항 체9, 측정 전에 구두 액체를 샘플링에 대 한 비교 되어 있다.
필터 종이 면 식물에서 자연 섬유의 구성 된 알람 및 199211,12,,1314, 동료의 선구적인 종이부터 비 강 분 비 물 흡수에 널리 이용 되는 15,,1617. 필터 종이 디스크 필터 카드 (예: Shandon)에서 생산 되어 고 후 비 강 알레르기 문제를 제어와 자연 알레르기 노출18,19 histamines 및 cytokines를 측정 하기 위해 활용 ,,2021. 그러나, 필터 종이의 다른 배치 단백질 바인딩 및 cytokines를 풀어 몇 가지 실패의 그들의 정도에서 변화 한다. 합성 흡수 성 매트릭스 (SAM)를 사용 하 여 방법 따라서 개발된2,,2223되었습니다. SAMs는 지금 일반적으로 사용 코 MLF를 없음. 이 흡수 성 물자는 편안 하 게 사용 하 고 얻을 수 있습니다 MLF 염증된 코 에서도 자주 시간의 연장된 기간 동안.
비 흡수는 SAM을 사용 하 여 상부 기도에 MLF의 샘플링에 대 한 정밀 점 막 샘플링의 형태입니다. 나 장치 의료 등급 재료 클린 룸을 사용 하 여 의료 기기 CE 표시로 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. NA 샘플러 핸들 및 샘 메 마른 cryotube에 구성 됩니다. 고분자, 일반적으로 섬유, 이루어져 SAM 하지만 그것도 거품으로 사용할 수 있고 이러한 부드럽고 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking으로 흡수 되도록 선택 됩니다. SAMs는 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩. 나는 모든 나가의 기증자에 수행할 수 있는 매우 온화 하 고, 비-침략 적 기술입니다. 또한, 직렬 샘플링, 심지어 몇 분 마다 가능입니다. 나 샘플링 기법5 기존의 상부 기도 대 한 검증 및 반복적인 샘플링 알레르기23,,2425, 기도의 도전 다음 운동 데이터의 생성을 허용 했다 세균도26 그리고 바이러스 형 TLR 촉진제 (Jha, A. 외., 원고 준비에서). 나는 또한 유아 아 토 피27,,2829 의 자연의 역사를 조사 하 고 바이러스 성 기관지염30에 사용 되었습니다.
Bronchoscopic microsampling (BMS)은 올림푸스31,,3233에 의해 개발 된 더 낮은 기도에 MLF의 컬렉션에 대 한 절차입니다. 불행 하 게도,이 BMS 시스템은 일본에서 라이센스만. 두 BMS 시스템을 공급 하는 올림푸스: 섬유 hydroxylated 폴리에스터 (FHPE) 하나34,35,,3637, 프로브 및 하나는 목화와 함께 조사33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. 주요 걸림돌 블록 천식 환자에서 사용 하는 BMS 프로브 출혈, 혈액으로 오염 하는 모든 샘플의 절반 점 막 접촉 발생 되었습니다. 저자는 그것이 가능한 샘플 MLF 천식 환자43주변 항공에서이 BMS 시스템을 사용 하 여 결론을 내렸다.
대신, 바 이노6천식의 실험적인 감염 다음을 포함 하 여 더 낮은 기도의 bronchoscopic 조사 하는 동안 수행할 수 있는 부드러운 샘을 사용 하 여 개발 했습니다. 바 장치 구성: 외부 빈 카 테 테 르, 그 활성화에는 샘을 밀어냅니다 손을-조각 및 그것의 끝에 샘을 가진 중앙 플라스틱 가이드 와이어. 나, 서 바 키트 클린 룸을 사용 하 여 의료 등급 재료에서 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. 또한, 장치는 CE 표시 및 감마 방사선을 제공 됩니다. 샘 스트립, 흡수, 부드러운 이며 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking 있다. 그것은 또한 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩이 있다. 장치를 빠르게 사용할 수 있는 고 MLF는 기도 내 관심의 특정 사이트에서 샘플을 정확 하 게는 bronchoscope의 작업 채널을 통해 들어갈 수 있는. 발 또는 BMS와 달리 바 접촉 출혈 또는 수술 후 환자의 불편 함이 추가 되지는지 않습니다.
NA, BA 샘플의 처리에 신중한 고려를 주어져야 한다. 샘플 수 직접 냉동 고 일괄, 처리 또는 즉시 처리할 수 있습니다. 처리 유형 immunoassays cytokines, 발산 및 면역 글로불린, 또는 바이러스 성, 세균성, elutions를 포함 하 여 특정 다운스트림 응용 프로그램으로 맞출 수 있습니다 및 호스트 셀 RNA. 우리 임상 수집 및 연구소 임상 연구자에 대 한 가이드로 나 및 바와 관련 된 처리 기법 제시.

<table><tbody><tr><td>비흡수(성인, 너비 7mm)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>환자 그룹/연령에 따라 다양한 크기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>기관지 흡착</td><td>사냥 개발</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>최소 기관지경 채널 크기 2mm; 최대 작업 길이 815mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 코스타&nbsp; 스핀-X&nbsp; 원심분리기 튜브 필터 (멤브레인 없음)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 코스타&nbsp; 스핀-X&nbsp; 원심분리기 튜브 필터(0.22um 멤브레인)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>감염 위험이 있는 샘플의 멸균용.</td></tr><tr><td>분석(용리) 완충액</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>Millipore 웹사이트에 나열되어 있지 않지만 문의 또는 Cedarlane과 같은 일반 실험실 공급 회사를 통해 구할 수 있습니다. 0.05% Tween-20 및 1% BSA를 함유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>NP-40 세포 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>소 혈청 알부민을 1%(w/v)에 추가합니다. 더 높은 절대 중재자 수준을 회복할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>완충액 RLT (RNA 추출)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>비강 흡착 및 기관지 흡착 샘플에서 RNA를 회수할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>HPLC 응용 분야에 사용되는 샘플 용출을 위해</td></tr><tr>Spin-X 튜브 필터에는<td>2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Costar</td><td>3213</td><td>2ml 튜브가 필요하며 기존 1.5ml 튜브는 이에 맞지 않습니다.</td></tr></tbody></table>

비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

비 흡수 (NA)과 기관지 흡수 (바)의 방법 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 인간의 호흡기의 점 막 내벽 유체 (MLF)을 흡수. 나, 비 열 등에서 액체를 흡수 하 고 최소한의 불편을 초래 하는 비-침략 적 기술입니다. 나는 상부 기도의 샘플링을 자주 반복 하는 기능 재현 가능한 결과 얻지 못했다.
비교 함으로써, 호흡기 점 막, 비인 두 포부 (경찰청) 등 기존의 보라고 샘플링의 대체 방법을 더 침략 적 이며 큰 데이터 변화 될 수 있습니다. 다른 방법 제한, 예를 들어, 생 검 및 기관지 절차는 침략 적가 래 포함 많은 죽은 죽어 세포 하며 액 화, exhaled 호흡 응축 (EBC) 포함 물과 타 액, 및 게 샘플은 희석과 변수입니다.
바 병원에 bronchoscope의 작업 채널을 통해 수행할 수 있습니다. 샘플링은 잘 용납 하 고 기도에 여러 사이트에서 수행할 수 있습니다. 바는 MLF 샘플 bronchoalveolar 게 (BAL) 샘플 보다 덜 묽 게 되 고 결과.
이 문서에서는 NA, BA의 기법 뿐만 아니라 원하는 다운스트림 biomarker 측정 되 고에 지 어질 수 있다 결과 샘플의 실험실 처리 합니다. 이러한 흡수 기술을 임상 호흡기 연구에 사용 되는 기존의 샘플링 기법 유용한 대안입니다.

없음은 쉽게 다양 한 연구에에서 이용 되어 고 비 접촉 측정 점 막 염증. 코에 알레르기의 관리, 다음 스타 글란 딘-d 2 (PGD2) 수준 상승 하 고 분 (그림 1), 돛대 세포 degranulation (트와 츠 외, 원고 준비 중) 맞춰가 관찰할 수 있습니다. 또한, 중재자 타입 II 염증, IL-5 (그림 2, 24에서 허가로 증 쇄 하는), 등의 비 강 알레르기 도전23,24다음 시간에 측정할 수 있습니다. 알레르기 천식과 건강 한 컨트롤의 실험적인 감염, 나는 7 일 (그림 3, 6에서 허가로 증 쇄 하는)의 과정을 통해 인터페론 감마 (IFN-γ)를 포함 하 여 중재자의 패널을 측정 하 사용 되었다. 또한, 유아의 자연 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염, 나 비-RSV 기관지염와 건강 한 컨트롤 ( 유아 상대적인 IFN-γ 등 염증 성 cytokines의 높은 수준의 연관 RSV를 시연 그림 4, 30의 허가 함께 재발급). 흥미롭게도, RSV와 비-RSV 기관지염이이 차별 시간 일치 경찰청 샘플 (그림 4)에 중요 했다.
바 이노와 알레르기 천식의 실험적인 감염 동안도 사용 되었다. 하루의 4 rhinovirus 감염, 레벨의 IFN-γ, CXCL11에서 IL-10과 IL-5 기준선 (그림 5;에서 상승 했다 A, B, C, D, 각각). 또한,이 기술은 건강 한 컨트롤 (그림 5D) (그림 5 6에서 허가로 증 쇄 하는)을 기준으로 라 이노 바이러스 감염 시 알레르기 천식의 낮은 기도에 높은 IL-5 레벨을 시연 했다.
이러한 대표적인 결과 eluted 0.05% 트윈-20 및 1 %BSA 포함 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 샘플에서 생성 된 ( 재료의 표참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> 그림 1 : 빠른 생성 및 비 강 알레르기 도전 다음 스타 글란 딘-d 2의. 디 모 데 잔디 꽃가루와 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 샘플에 비 흡수 있다에서 스타 글란 딘-d 2 (PGD2)의 레벨 측정 (n = 5). 각 줄은 한 개인에서 데이터를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> 그림 2 : IL-5 비 강 알레르기 도전 다음의 운동 측정. 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 비 흡수 샘플에서 IL-5의 생산. 3 알레르기 도전 연구를 실시 했다, 참가자와 함께 반복 (n = 19) 위약 (파란색)을 받고, 낮은 복용량 (10 mg) 경구 프레드 니 손 (오렌지), 또는 높은 복용량 (25mg) 경구 프레드 니 손 (빨간색) 알레르기 관리 이전 1 시간. 라인은 표시 하 고 오차 막대는 모든 참가자의 95% 신뢰 간격. (그림 2017 Leaker 외, 점 막 면역학에서 허가로 증 쇄). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> 그림 3 : Rhinovirus 감염 시 인터페론-γ의 유도. 건강 한 성인의 감염 도전 중 (n = 11, 블루)와 알레르기 천식 (n = 28, 레드) 이노-16, 비 흡수 샘플링 인터페론-γ (IFN-γ)의 레벨을 측정 하기 위해 사용 되었다. 데이터는 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 개인 및 B) 중간 레벨의 A) 원시 스파게티 플롯으로 표현 됩니다. (그림은 헨젤과 그 외 여러분 에서 허가로 증 쇄 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> 그림 4 : Nasosorption 유아의 RSV 감염 연관 높은 인터페론-γ 차별. 비 흡수와 비인 두 열망 (경찰청) 기관지염 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염과 관련 된 유아의 인터페론-γ 수준을 측정 하는 데 사용 했다 (빨강, n = 12), 비-RSV 호흡기 병원 체 (녹색, n = 12), 그리고 건강 한 컨트롤 (블루, n = 9). 데이터 Kruskall-월리스 테스트를 사용 하 여 여러 비교를 Dunns 정정 분석 했다 (* * *p&lt; 0.001). 라인 중간 값 나타냅니다 있으며 오차 막대 interquartile 범위. (트와 츠 외 허가 수정 그림 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> 그림 5 : 기관지 흡수 샘플 rhinovirus 감염 동안에 염증 성 중재자. 건강 한 컨트롤의 이노 16 감염 다음 (n = 10, 파랑) 및 알레르기 천식 자원 봉사자 (n = 23, 레드), 기관지 흡수 기준선에와 감염의 날 4 D) IL-5, C) IL-10, B) CXCL11, A) IFN-γ의 수준을 측정 하는 데 사용 되었다. 데이터 Wilcoxon 분석 평가 테스트 (일치 샘플)와 맨-휘트니 테스트 (최고의 샘플) 서명. 헨젤 외 에서 허가로 증 쇄 하는 그림 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 원고는 위와 더 낮은 기도의 점 막 내벽 액체 (MLF)을 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 특히 비 강 및 기관지 흡수 기술의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 더 나은 표준화 및 기존 호흡기 샘플링 기법 보다 내성 제공합니다.

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

오늘 우리는 점막 내막액을 흡수하기 위해 합성 흡수 매트릭스를 사용하는 정밀 점막 샘플링의 한 형태인 비흡수 기술을 시연할 것입니다. 비흡수 샘플러는 핸들과 멸균 극저온 튜브의 SAM으로 구성됩니다. SAM은 섬유 또는 발포체의 폴리머로 구성되며, 부드럽고 흡수성이 있으며 시료 채취를 위한 빠른 심지가 있도록 특별히 선택됩니다.또한 SAM은 단백질 결합을 최소화하여 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있습니다. 비흡수는 아기를 포함한 모든 연령대의 환자에게 수행할 수 있는 매우 부드럽고 비침습적인 기술입니다. 또한 몇 분마다라도 직렬 샘플링이 가능합니다.비흡수를 수행할 때는 먼저 손을 씻고 장갑을 착용해야 하며, 가급적이면 환자 앞에서 착용해야 합니다. 먼저 비강을 검사합니다. 헤드 토치를 사용하고 임상의가 주로 사용하지 않는 엄지손가락을 사용하여 환자의 코를 후퇴시켜 비강을 시각화하는 것이 좋습니다.비강 검경은 일반적으로 필요하지 않습니다. 비강을 들여다보면 콧구멍이나 콧구멍은 단면이 둥글지 않고 똑바로 뒤로 뻗어 있습니다. 일반적으로 하부 비갑개는 콧구멍의 측면 벽에 움푹 들어간 돌출부로 보이며, 코 중격은 매끄럽고 평평한 내측 벽을 형성합니다.우리는 이 하부 비갑개에서 표본을 추출하고 싶은데, 그 이유는 기저 상피가 호흡기의 단순한 섬모 상피이기 때문입니다. 샘플링할 때, 비강 흡수 SAM은 내강 위로 부드럽게 전달되어 하부 비갑개에 대해 평평하게 배치됩니다. 그런 다음 검지를 사용하여 SAM을 코 점막에 누릅니다.이것은 MLF가 흡수될 때 눈물이 날 수 있는 약간의 간지러움을 유발할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 시간 제한 60초 흡수를 사용합니다. 그런 다음 비강 흡착 장치를 콧구멍에서 제거하고 냉동 튜브에 다시 넣고 즉시 얼음에 보관한 다음 급속 냉동할 수 있습니다.또는 MLF를 즉시 용출할 수 있습니다. 비흡수는 다양한 코 점막 챌린지 모델과 다양한 기도 질환에서 연구되고 있습니다. 그러나 이 비교적 새로운 방법은 여전히 다른 호흡기 샘플링 방법에 대한 공식적인 검증이 필요합니다.기관지 흡착 기술은 합성 흡수 매트릭스를 사용하여 기관지의 점막 내벽액을 샘플링합니다. 이 방법은 광섬유 기관지경을 통해 전문 인력이 수행합니다. 기관지 흡착 장치는 중앙 플라스틱 가이드와이어가 있는 외부 중공 카테터로 구성됩니다.이것은 끝에 SAM이 있으며 핸드피스가 활성화될 때 압출될 수 있습니다. 비흡수와 마찬가지로 SAM 스트립은 부드럽고 흡수성이 있으며 시료 채취를 위한 빠른 흡수가 가능합니다. 또한 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있도록 단백질 결합을 최소화합니다.기관지 흡착 장치를 기관지 내시경에 놓기 전에 SAM이 카테터로 쉽게 돌출되고 다시 빠져나오는지 확인하는 것이 일반적입니다. 이제 기관지경 시뮬레이터를 사용한 기관지 흡착 방법을 시연하겠습니다. 먼저 표준 기관지 내시경 검사를 수행하여 기관지 내시경을 기관을 따라 오른쪽 주요 기관지로 들어가 오른쪽 하부 및 오른쪽 중간 엽의 구분에 바로 근접한 기관지 intermedius 수준으로 통과시킵니다.이 레벨에 삽입되면 5단계를 따릅니다. 하나는 카테터를 내리는 것입니다. 기관지경의 작동 채널을 통해 기관지경 끝에서 원위 최대 1cm까지 흰색 끝이 기도에서 보일 때까지 기관지흡착 카테터를 삽입합니다.기관지경과 카테터 끝을 기도 내강 중앙에 두십시오. 점막 손상의 위험을 줄이기 위해 카테터 팁과 기관지 점막 사이의 접촉을 최소화하도록 주의하십시오. 둘, 샘 아웃.기관지 흡착 장치의 손잡이를 눌러 SAM 스트립이 오른쪽 중간 또는 오른쪽 하엽 기도의 내강으로 돌출되도록 합니다. 직접 볼 수 있는 상태에서 기관지경의 끝을 구부려 SAM이 기도 벽의 점막 내막액과 접촉하고 있는지 확인합니다. SAM 스트립을 기도 내에 두고 30초 동안 점막벽에 평평하게 둡니다.3점, SAM이 들어왔습니다. 직접 시력 하에서 SAM을 카테터로 직접 집어넣습니다. 집어넣을 때 촉촉한 SAM 프로브가 직선인지 확인하십시오.필요한 경우 카테터와 기관지경 끝을 다시 가져와 SAM을 곧게 펼 수 있습니다. SAM을 집어넣는 데 어려움이 있는 경우 SAM이 기도 밖으로 돌출된 전체 장치를 빼냅니다. 넷, 카테터를 위로 올리세요.기관지경의 작동 채널에서 전체 카테터를 빼냅니다. 다섯, 샘을 잘라버려. SAM은 멸균 가위로 잘라 냉동 튜브에 넣고 급속 냉동 또는 직접 용출하기 전에 즉시 얼음 위에 올려 놓아야 합니다.다음 비디오 클립은 연구용 기관지 내시경 검사를 받는 환자의 기도로 SAM을 밀어내는 과정을 보여줍니다. 기관지 흡착은 현재 다양한 폐 질환에서 연구되고 있습니다. 우리는 이 정밀 점막 샘플링 방법이 진단 정밀 검사와 환자 계층화 및 모니터링에 유용하게 사용될 것으로 기대합니다.비강 흡수 및 기관지 흡착 후 실험실 처리. The elution of Mucosal Lining Fluid from the Synthetic Absorptive Matrix(합성 흡수 기질에서 점막 내벽액의 용출). 오늘 우리는 비강 흡수 및 기관지 흡착의 비침습적 점막 샘플링 기술 이후 실험실 샘플 처리의 일반적인 원리를 시연할 것입니다.특히, 합성 흡수 매트릭스에서 점막 내벽 유체 샘플을 용리하는 방법을 시연할 것입니다. 채취 시점에는 실험실로 운송하기 위해 샘플을 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. 샘플은 즉시 처리하거나 나중에 용출하기 위해 원래 샘플 튜브의 급속 냉동에 직접 배치할 수 있습니다.즉각적인 처리가 수행되는 경우 샘플을 얼음에 담아 원래 샘플 튜브에 넣어 실험실로 옮길 수 있습니다. 또는 SAM을 분리하여 채취 지점에서 용리 완충액에 넣은 다음 얼음에 담아 실험실로 옮길 수 있습니다. 샘플은 처리 전에 몇 시간 동안 버퍼에 넣거나 샘플 튜브 내에 얼음 위에 남아 있을 수 있습니다.SAM의 원심분리 및 스핀 용출 전 세척 단계는 시료 수율을 최적화하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 SAM을 원하는 추출 버거와 함께 Eppendorf 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 샘플을 와류 믹서에서 30초 동안 혼합하여 느슨하게 부착된 유체와 생체 분자의 SAM을 세척합니다.완전한 시료 회수를 보장하기 위해 세척에 사용되는 것과 동일한 Eppendorf tube 내부의 스핀 인서트에 촉촉한 SAM을 첨가하여 스핀 용리를 수행합니다. 이 절차에는 깨끗한 집게를 사용해야 하며 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 교체해야 합니다. 이 방법은 원심분리를 사용하여 SAM에서 유체를 추출합니다.우리는 16, 섭씨 4도에 냉각된 원심분리기에 있는 000 g에 20 분 동안 표본을 원심분리기 한다. 사용되는 용리 버거는 원하는 응용 프로그램에 따라 결정됩니다. 우리는 일반적으로 단백질 함유 아미노 분석 완충액 또는 RNA 용해 완충액을 사용합니다.두 가지 유형의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다. 첫 번째는 SAM을 제자리에 고정하는 플라스틱 메쉬만 포함하여 유체를 완전히 용출할 수 있습니다. 또는 감염성 물질로 작업하는 경우 0.2마이크로미터 기공 크기의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다.이 필터는 감염된 샘플의 오염을 제거하고 미생물 감염이 의심되는 샘플에 적합합니다. 이러한 필터가 필요한 경우 샘플을 추가하기 전에 proteinaceous buffer가 필터를 통해 흡수될 수 있는 사전 incubation 단계를 포함하는 것이 중요합니다. 이 단계는 비특이적 단백질 흡수에 의한 필터에 대한 매개체의 결합을 최소화합니다.다음은 2급 병원체를 포함하여 오염 제거 단계가 필요하지 않은 샘플의 비흡수 및 기관지 흡착 처리를 위해 본 실험실에서 사용하는 방법의 예입니다. 1단계, SAM을 적절한 완충액과 와류가 들어있는 Eppendorf에 30초 동안 넣습니다. 비흡수의 경우 일반적으로 300마이크로리터의 완충액을 사용하고 기관지 흡착의 경우 100마이크로리터를 사용합니다.2단계에서는 집게를 사용하여 SAM을 제거하고 SAM을 세척하는 데 사용되는 버퍼와 함께 플라스틱 메쉬 필터 컵에 넣습니다. 3단계: SAM이 들어 있는 플라스틱 메시 필터 컵을 원래 Eppendorf로 되돌립니다. 4단계, 필터 컵, 완충액 및 SAM이 포함된 Eppendorf를 섭씨 4도에서 16, 000g에서 20분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 SAM이 들어 있는 필터 컵을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 용리액을 분주하고 급속 냉동하여 나중에 분석할 수 있습니다. 비흡수 샘플링은 여러 임상 호흡기 연구 환경에 적용되었습니다.여기에는 프로스타글란딘 D2 및 인터루킨 5와 같은 코 알레르기 유발 물질 중 염증 매개체의 측정이 포함됩니다. 이러한 챌린지 모델 설정에서 중요한 것은 비흡수에 의한 샘플링을 통해 매개체 수준의 빈번한 운동 프로파일링을 수행할 수 있으며, 여기서 샘플링은 몇 분마다 반복될 수 있다는 것입니다. 비흡수는 또한 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 리노바이러스 감염 챌린지 중에 사용되었으며, 연구 기간 동안 비흡수가 매일 반복되었습니다.이 연구에서 비흡수를 사용하여 리노바이러스 감염에 대한 인터페론 반응의 민감한 특성을 규명할 수 있었습니다. 마지막으로, 비흡수 샘플링을 사용하여 세기관지염이 있는 영아를 연구했습니다. 이 연구에서 호흡기 세포융합 바이러스에 의한 감염은 인터페론 감마와 같은 염증 매개체의 수치가 더 높은 것과 관련이 있었습니다.중요한 것은 비흡수를 이용한 샘플링을 통해 유아를 대상으로 한 연구에 건강한 대조군을 포함할 수 있다는 것입니다. 기관지 흡착은 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 리노바이러스 챌린지 연구에도 사용되었습니다. 이 연구는 리노바이러스 감염 시 하부 기도에서 염증 매개체인 인터페론 감마, ITAC, IL-10 및 IL-5가 유의하게 증가했음을 보여주었습니다.이 기술을 하기도 연구에 포함하면 기관지폐포 세척과 같은 기존 방법으로는 검출할 수 없는 매개체 수준을 측정할 수 있는 가능성이 생깁니다. 결론적으로, 점막 내막액은 비침습적으로 얻을 수 있으며 감염 및 염증에 대한 염증 반응을 측정할 수 있는 흥미로운 잠재력을 가지고 있습니다. 용리 방법은 샘플의 특성과 측정할 파라미터에 따라 조정해야 합니다.특히, MLF는 점막 사이토카인 및 케모카인, 바이러스 감염, 바이러스 부하, 박테리아 및 진균 감염, 미생물 군집 및 점막 항체를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 점막 샘플링 및 용출 방법은 개별 프로젝트에 대한 맞춤형 개발과 신중한 검증이 필요합니다.

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연구

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Medicine

의학

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Spiral Microfluidics Channel을 사용한 기관 분비에서 무표지 호중구 분리

이 비디오는 신생아 인간 비강 점막 내막 유체 추출물의 면역 매개체 수치를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 전기화학발광 기반 멀티플렉스 분석 시스템은 매개체가 여기될 때 방출되는 빛의 강도를 평가하여 이러한 매개체를 측정합니다.

Quantification of immune mediaator levels in human mucosal lining fluid(인간 점막 내막액의 면역 매개체 수치 정량화)

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