Name: 비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 학습하세요 비강 및 기관지 점막 체액 샘플링을 위한 합성 흡수 매트릭스(SAM)를 이용한 비강흡수 및 기관지흡수 기법을. 이 비침습적 방법은 호흡기 질환 연구와 임상 진단에 활용됩니다.

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이 작품 여 제휴에서 건강 연구 (NIHR) 생물 의학 연구 센터 (BRC) 대 한 제국 국가 연구소, NIHR 건강 보호 연구 단위 (HPRU)에 제국 대학 런던에서 호흡기 감염에서 자금 지원 자금: 공중 보건 영국 (PHE)와 NIHR 제국 환자 안전 변환 연구 센터. 표현 그 저자와 반드시 보 건국에서 NIHR, 보건 또는 공중 보건 영국 있습니다.

다음 프로토콜에 사용 되는 기법 있다 서쪽 런던 연구 윤리 위원회 (참조 번호 15/소호/0444)에 의해 승인 되었습니다.
1. 비 흡수 (없음)
<ol><li>
나 샘플링 이전 준비
	<ol>
<li>나를 들고 먼저 손을 씻고 고 장갑, 가급적 환자 앞에 넣어.</li>
		<li>머리 토치를 사용 하 여 비 강 검사 그리고 그들의 비 지배적인 엄지를 사용 하 여 코 구멍을 시각화 하는 환자의 코를 철회 하는 임상. 참고: 비 강 검 경 일반적으로 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>비 강 및 샘플링 이전 비 등을 시각화. 참고: 네어스 (콧구멍) 횡단면에서 라운드 하지 않습니다 그리고 그들은 바로 뒤로 서. 일반적으로, 비 열 등 돌출 또는 측면 벽에는 콧구멍의 들여쓰기로 볼 수 있습니다 비 강 심장으로 형성 매끄러운, 평면 내측 벽. 우리가 하려는 열 등에서 샘플 비, 기본 상피 이기 때문에 호흡기44의 간단한 ciliated 상피.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나 샘플링
	<ol>
<li>샘플링, 비 열 등에 대 한 평면 그것을 orientating는 콧구멍의 루멘을 부드럽게 나 샘을 전달.</li>
		<li>비 강 점 막에 샘을 집게 손가락을 사용 하는 기증자를 요구 하십시오. 나는 약간 격 이네요, 가능한 눈 급수와 MLF 흡수 될 수 있습니다. 참고: 성인, 우리 일반적으로 성능이 나 60 s.</li>
		<li>MLF의 흡수, 후는 콧구멍에서 나 장치를 제거 하 고 다시 원래 튜브에 넣어.</li>
		<li>실험실에서 즉시 샘플을 처리 하거나이 프로토콜의 뒷부분에 설명한 대로, 그들을 동결. 참고: 나는 다양 한 비 강 점 막 도전 모델, 그리고 다른 기도 질병 공부 되는. 그러나, 각 연구와 환자 인구에 대 한 다른 호흡기 샘플링 방법에 대 한 유효성 검사를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 기관지 흡수 (BA)
<ol><li>
바 샘플링 이전 준비 참고: 바 전문된 인력 상계 제품군에 의해 수행 됩니다.<ol>
<li>테 내려 바 장치를 배치 하기 전에 SAM은 압출 하 고 카 테 터로 다시 철수를 확인 합니다.</li>
		<li>바 환자에 실시, 사전 모의 바 상계 시뮬레이터에 실시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바 샘플링
	<ol>
<li>기도와 오른쪽 주 기관지 bronchoscope는 기관지 intermedius, 그냥 오른쪽 하단 및 오른쪽 중간 엽으로 사단을 인접의 수준에 전달 합니다. 참고: 우리가 일반적으로 샘플 기관지 intermedius에서 비록 기도 내의 다른 사이트를 샘플링할 수 있다. 카 테 터와 샘 관찰, 하나 bronchoscope 팁을 볼 수 없습니다. 우리는 bronchoscope 원하는 샘플링 사이트에 도달 했습니다 일단 바에 대 한 다음과 같은 간단한 단계를 관찰 합니다.</li>
		<li>화이트 팁 그냥 최대 1cm는 bronchoscope의 끝에 말 초 기도에 표시 될 때까지 아래로 카 테 터: 바 테는 bronchoscope의 동작 채널을 통해 삽입 합니다. 기도의 루멘의 중심에서 bronchoscope 및 카 테 터 팁을 유지. 카 테 터 팁과 마모는 점 막 하의 위험을 줄이기 위해 기관지 점 막의 접촉을 최소화 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
		<li>샘 아웃: SAM 오른쪽 중간 또는 오른쪽 하단 엽 기도의 루멘으로 돌출 되도록 핸들 바 장치의 우울. 직접 비전 않도록 하는 샘은 기도 벽에 MLF 접촉 bronchoscope의 끝을 구 부. 30 점 막 벽에 평면 기도, 내 샘을 두고 s.</li>
		<li>샘에: 습 한 샘 프로브는 되도록 직선과 하지 구부러진 카 테 터의 끝에 다시 bronchoscope을 통해 봐. 필요한 경우, 카 테 터와 bronchoscope 팁 SAM을 다시를 주어질 수 있다. 직접 비전, 카 테 터에 다시 직선 샘을 부드럽게 철회. 참고: 경우에 카 테 터에 다시 샘을 제거 하는 어려움, 샘과 전체 장치 철수 기도에서 다시 내밀 었 다.</li>
		<li>카 테 터:는 bronchoscope의 동작 채널에서 전체 카 테 터를 철수.</li>
		<li>샘을 잘라: SAM 멸 균가 위로 잘라 고 얼음에는 cryotube에 넣어. 이 샘플은 다양 한 방법으로,이 프로토콜에 나중으로 처리할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 나 및 바 샘플 처리
참고: 나와 바에서 발생 하는 샘플의 실험실 처리에 대 한 다양 한 옵션을 확인 하 고 있습니다. 이러한 프로토콜은 나중에 사용 하기 위해 샘플을 저장 하 고 SAM에서 MLF 샘플 elute 추구 합니다.
<ol><li>
NA, BA 샘플의 즉각적인 처리에 대 한 옵션
	<ol>
<li>옵션 1: 추가 처리 전에 몇 시간 동안 얼음에 습 한 샘을 저장 합니다.</li>
		<li>옵션 2: 즉시 딥 프리즈 나 SAMs 컬렉션에 관. 마찬가지로,가 위, 샘플링 장치에서 제거 후, 극저온 튜브에 바 SAMs 동결.</li>
		<li>옵션 3: 직접 또는 깊은 동결 처리 이전 차입 버퍼 (300 µ L)에서 분리 된 샘을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA, BA 샘플에 대 한 차입 버퍼의 옵션 참고: MLF 샘플에서 분석 하는 것에 따라 차입 버퍼 선택 하 고 우리는 4 개의 주요 대안을 제안:<ol>
<li>미리 준비 된 분석 결과 버퍼 immunoassay 절차에 대 한 적합 한 사용. 이러한 버퍼 뿐만 아니라 단백질, 예를 들어, 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1% 적은 양의 세제 (0.05%)를 포함 해야 합니다.</li>
		<li>또는 사용 하 여 세제의 큰 금액을 포함 하는 버퍼 세포 세포의 용 해 발생 합니다. 참고: 우리는 1% 농도에서 트리톤 X 또는 NP40를 포함 하는 버퍼를 사용 합니다. 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하는 SAM에서 eluted 수 cytokines와 발산에에서 일반적으로 결과 세포내와 세포 외 cytokines. 이러한 버퍼 단백질, 포함 되어야 하 고 1 %BSA 함께 만들어집니다.</li>
		<li>바이러스 성 RNA 또는 측정 호스트 RNA의 양이 많은 PCR 같은 RNA 측정에 대 한 습 한 샘에 직접 RNA 추출 버퍼를 추가 합니다. 참고: Chaotropic RNA 추출 버퍼 guanidinium 변성 단백질을 포함. 대안은은 immunoassay 또는 세포 세포의 용 해 버퍼에 포함 된 eluted MLF 액체에 RNA 추출 버퍼를 추가 하는 것 이다.</li>
		<li>Trifluoroacetic 산 등의 유기 용 매를 사용 하 여 지질과 대사 산물, 질량 분석 평가 대 한의 추출. 참고: 이러한 모든 시이 약의 세부 자료 섹션에 포함 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차입 기법
	<ol>
<li>위의 차입 기법 중 하나에 대 한 원하는 추출 버퍼 함께 2 mL 마이크로 원심 튜브에 SAM를 삽입 합니다.</li>
		<li>소용돌이 혼합 30에 대 한 샘플을 느슨하게 연결 된 체액 및 생체의 샘을 씻어 s.</li>
		<li>전체 샘플 복구를 보장 하기 위해, 습 한 샘 열을 추가 스핀 필터 미니에 사용 된 동일한 2 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 삽입 하 여 원심 차입을 수행 합니다. 참고: 두 가지 유형의 회전 필터 미니 열을 사용할 수 있습니다. 첫 번째 장소에서 SAM을 보유만 플라스틱 메쉬를 체액의 전체 차입을 허용 포함 되어 있습니다. 또는, 전염 성 재료를 사용 하는 경우 0.22 μ m 기 공 크기와 회전 필터를 사용 합니다. 이러한 필터 샘플을 소독 하 고 의심 Mycobacterial 감염 샘플에 적합. 그러나, 이러한 필터 버퍼, 일반적인 상호 작용을 통해 필터에 중재자의 바인딩을 최소화 하 미리 incubated 이어야 한다.</li>
		<li>소독된 집게를 사용 하 여 회전 필터에 습 한 샘을 전송. 집게를 오염을 방지 하기 위해 샘플 사이 변경 합니다.</li>
		<li>4 ° c 원심 분리기 샘플 미니 원심 분리기에서 16000 x g에서 20 분 동안 냉각</li>
	</ol>
</li>
	<li>
요약 예제 프로토콜
	<ol>
<li>실험실에서 라벨 2 mL 샘플 컬렉션에 대 한 마이크로 원심 튜브 및 차입 버퍼의 원하는 볼륨을 추가 (NA;에 대 한 일반적으로 300 µ L 바에 대 한 100 µ L). 뚜껑을 밀봉 하 고 얼음에 놓습니다.</li>
		<li>샘플링 (즉시 또는 실험실에서) SAM 다음 집게를 사용 하 여 핸들에서 제거 하 고 컬렉션 튜브 (이전 단계에서 생성)를 포함 하는 버퍼에 배치 됩니다. Microcentrifuge 튜브의 뚜껑은 안전 하 게 닫히고 얼음, 추가 처리를 위해 실험실에 샘플을 전송 확인 하십시오.</li>
		<li>30에 대 한 그들의 전송 컨테이너와 소용돌이 믹스에서 샘과 차입 버퍼를 포함 하는 튜브를 제거 s.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 샘을 제거 하 고 (또는 0.22 μ m 셀 루 로스 아세테이트 필터 없이) 스핀 열에 배치.</li>
		<li>컬렉션 튜브에서 차입 버퍼를 수집 하 고 유지.</li>
		<li>스핀 열, 샘, 원래 컬렉션 튜브 (또는 살 균 필터링 하는 경우 새로운 한 샘플링) 열 회전 컬렉션 버퍼를 추가. 이러한 방식으로 세척 액체 elute SAM에서 샘플을 수집 관으로 다시 회전 열을 통해 전달 합니다.</li>
		<li>뚜껑 봉인 (16000 x g, 20 분, 4 ° C) 샘플을 원심.</li>
		<li>원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 선반에 장소.</li>
		<li>튜브의 밀폐 뚜껑 열고 SAM를 포함 하는 스핀 열을 제거 합니다. 샘과 스핀 열에 적절 한 폐기물 컨테이너를 삭제 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 약 수로 튜브 내에 포함 된 eluate 이라는 극저온 튜브 합니다. 각 약 수에 eluate의 총 볼륨 및 볼륨을 기록 합니다.</li>
		<li>-80 ° C 냉장고에 밀봉된 저온 관 전송 및 사용까지 똑바로 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

기존 기도 샘플링 기법에서 결과 높은 변수;로 간주 다른 샘플링 기법 표준화 연구5이 분야 내에서 필요 합니다. NA, BA 비-침략 적 방식으로 MLF의 샘플링을 허가 있고 흥미로운 가능성이 건강 하 고 병 항공에 면역 반응 측정. 이 제공 하는 수많은 잠재적인 이점이 큰 내성, 샘플링의 속도, 샘플링, 자주 반복 하는 기능을 포함 하 여 기존 기술, 낮은 간 사용자 가변성, 기술과 면역 중재자5의 희석을 감소 . 기간 흡수 및 사용 처리 기술을 각 연구에 대 한 최적화와 샘플링 이벤트 사이 엄격 하 게 유지 있어야 합니다. 또한, 학사, 경우 기도 내에서 샘플링의 사이트 복제 되어야 합니다 신중 하 게 개인 사이.
나, 그리고 특히 바, 임상 연구에 대 한 여전히 비교적 새로운 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술의 장점을 대체 기법5에 대 한 주의 유효성 검사를 포함 하 여 수많은 연구에 그들의 사용에서 이어지고 있다. 이 소자 들은 CE 표시 장치 호흡 연구에서 광범위 한 사용에 대 한 준비로 지금입니다. NA, BA 대체 샘플링 기법 보다 훨씬 작은 샘플 볼륨에서 결과, 반면 높은 획득된 농도 낮은 풍부한 면역 중재자에 대 한 감도 향상 될 수 있습니다.
원하는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 NA, BA 샘플 수 직접 동결 이후 처리, 임상 연구 환경에서 연구 타당성을 강화. 샘플 처리에 대 한 프로토콜 특정 다운스트림 응용 프로그램에 맞게 적용할 수 있습니다. 제안된 처리 기술을 단백질 또는 지질 면역 중재자 또는 핵 산의 컬렉션에 사용할 수 있지만 각 연구에 대 한 최적화 되어야 합니다. 특히, MLF 다른 버퍼가 eluted 될 수 있습니다. 첫째, 점 막 cytokines, 발산, 및 항 체6,45측정 immunoassay 버퍼를 사용할 수 있습니다. 세제 상부와 버퍼 또한 세포내 cytokines의 포함을 허용 하는 세포 세포 발생을 보장 하기 위해 사용할 수 있습니다. 바이러스 성 감염, 바이러스 성 결정에 대 한 버퍼를 사용 한다 Chaotropic RNA 추출 로드, mRNA과 미생물. 또는, lipidomics 및 질량 분석에 대 한 유기 용 매를 사용할 수 있습니다.
결론적으로, 점 막 표면에서 직접 흡수 MLF의 호흡, 위장, 비뇨 생식 기, 및 다른 점 막 질환에서 잠재적인 사용 흥미로운 기술입니다. 그러나, 이러한 유망한 흡수 기술을 샘플링 및 개별 분석 (biomarkers) 각 질병에에서 대 한 기술 처리의 정확한 확인이 필요 합니다. 또한, 이러한 소설 정밀 점 막 샘플링 기법 혈액, 호흡, 및가 래와 같은 기존 샘플에 대 한 유효성 검사를 요구할 것 이다. 이러한 기법, MLF 미생물, cytokines, 발산, prostanoids, 및 항 체를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

대부분의 호흡기 질환 염증 반응, 원인과 알레르기 비 염, 바이러스 및 곰 팡이 감염, 결핵, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐에 호흡기 점 막 표면에서 샘플링에 대 한 긴급 한 필요가 있는 섬유 증 및 폐 암 1. 비인 두 aspirate (경찰청), 코 게 고 bronchoalveolar 게 (BAL) 위와 더 낮은 기도 샘플링에 대 한 일반적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 현재 가난한 내성, 염증 성 중재자의 희석 및 샘플링2를 자주 반복 하는 무 능력을 포함 하 여 상당한 문제. 경찰청 샘플링 한 대안 면봉, 몰려들었다 나일론, 면의 사용 이다 또는 레이 온3,4, 하지만이 또한 한계를가지고, 이후 그들은 불편 하 고 비 강 상피, 그리고 일부 경우 돌이킬 수 없는 바인딩의 손상을 일으킬합니다 염증 성 중재자5. 이러한 기술은 일반적으로 한 시간 이상 연속적으로 반복 수 없습니다 그리고 대체 기술을 더 낮은 풍부 cytokines 및 발산5,6의 검출에 대 한 효과가 있을 수 있습니다. 또한, 이러한 기술과 관련 된 사용자 가변성 데이터를 더 큰 환자 동료의 요구의 결과로에 불일치를 생성할 수 있습니다.
또는, 천연 및 합성 스폰지를 사용 하 여 흡수 기술 점 막 표면에서 MLF 수집 하 사용 되었습니다. 안과 스폰지 천연 펄프 (예를 들어, Weck cel)의 구성 샘플 타 액, 자 궁 경부 및 질 분 비 물7에 사용 되었습니다. 또한, 폴 리 비닐 알코올 (PVA)에서 만든 합성 갯 솜 그리고 hydroxylated 폴 리 비닐 아세테이트 (HPVA) 활용된8되었습니다. 7 다른 흡수 성 물자 폴리우레탄 미니 스폰지 인간의 눈물10수집 하 사용 되었다 항 체9, 측정 전에 구두 액체를 샘플링에 대 한 비교 되어 있다.
필터 종이 면 식물에서 자연 섬유의 구성 된 알람 및 199211,12,,1314, 동료의 선구적인 종이부터 비 강 분 비 물 흡수에 널리 이용 되는 15,,1617. 필터 종이 디스크 필터 카드 (예: Shandon)에서 생산 되어 고 후 비 강 알레르기 문제를 제어와 자연 알레르기 노출18,19 histamines 및 cytokines를 측정 하기 위해 활용 ,,2021. 그러나, 필터 종이의 다른 배치 단백질 바인딩 및 cytokines를 풀어 몇 가지 실패의 그들의 정도에서 변화 한다. 합성 흡수 성 매트릭스 (SAM)를 사용 하 여 방법 따라서 개발된2,,2223되었습니다. SAMs는 지금 일반적으로 사용 코 MLF를 없음. 이 흡수 성 물자는 편안 하 게 사용 하 고 얻을 수 있습니다 MLF 염증된 코 에서도 자주 시간의 연장된 기간 동안.
비 흡수는 SAM을 사용 하 여 상부 기도에 MLF의 샘플링에 대 한 정밀 점 막 샘플링의 형태입니다. 나 장치 의료 등급 재료 클린 룸을 사용 하 여 의료 기기 CE 표시로 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. NA 샘플러 핸들 및 샘 메 마른 cryotube에 구성 됩니다. 고분자, 일반적으로 섬유, 이루어져 SAM 하지만 그것도 거품으로 사용할 수 있고 이러한 부드럽고 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking으로 흡수 되도록 선택 됩니다. SAMs는 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩. 나는 모든 나가의 기증자에 수행할 수 있는 매우 온화 하 고, 비-침략 적 기술입니다. 또한, 직렬 샘플링, 심지어 몇 분 마다 가능입니다. 나 샘플링 기법5 기존의 상부 기도 대 한 검증 및 반복적인 샘플링 알레르기23,,2425, 기도의 도전 다음 운동 데이터의 생성을 허용 했다 세균도26 그리고 바이러스 형 TLR 촉진제 (Jha, A. 외., 원고 준비에서). 나는 또한 유아 아 토 피27,,2829 의 자연의 역사를 조사 하 고 바이러스 성 기관지염30에 사용 되었습니다.
Bronchoscopic microsampling (BMS)은 올림푸스31,,3233에 의해 개발 된 더 낮은 기도에 MLF의 컬렉션에 대 한 절차입니다. 불행 하 게도,이 BMS 시스템은 일본에서 라이센스만. 두 BMS 시스템을 공급 하는 올림푸스: 섬유 hydroxylated 폴리에스터 (FHPE) 하나34,35,,3637, 프로브 및 하나는 목화와 함께 조사33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. 주요 걸림돌 블록 천식 환자에서 사용 하는 BMS 프로브 출혈, 혈액으로 오염 하는 모든 샘플의 절반 점 막 접촉 발생 되었습니다. 저자는 그것이 가능한 샘플 MLF 천식 환자43주변 항공에서이 BMS 시스템을 사용 하 여 결론을 내렸다.
대신, 바 이노6천식의 실험적인 감염 다음을 포함 하 여 더 낮은 기도의 bronchoscopic 조사 하는 동안 수행할 수 있는 부드러운 샘을 사용 하 여 개발 했습니다. 바 장치 구성: 외부 빈 카 테 테 르, 그 활성화에는 샘을 밀어냅니다 손을-조각 및 그것의 끝에 샘을 가진 중앙 플라스틱 가이드 와이어. 나, 서 바 키트 클린 룸을 사용 하 여 의료 등급 재료에서 제조 되 고 먼지와 알레르기의 자유롭다. 또한, 장치는 CE 표시 및 감마 방사선을 제공 됩니다. 샘 스트립, 흡수, 부드러운 이며 샘플 컬렉션에 대 한 신속한 wicking 있다. 그것은 또한 흡수 비의 효율적인 차입 수 있도록 최소한의 단백질 바인딩이 있다. 장치를 빠르게 사용할 수 있는 고 MLF는 기도 내 관심의 특정 사이트에서 샘플을 정확 하 게는 bronchoscope의 작업 채널을 통해 들어갈 수 있는. 발 또는 BMS와 달리 바 접촉 출혈 또는 수술 후 환자의 불편 함이 추가 되지는지 않습니다.
NA, BA 샘플의 처리에 신중한 고려를 주어져야 한다. 샘플 수 직접 냉동 고 일괄, 처리 또는 즉시 처리할 수 있습니다. 처리 유형 immunoassays cytokines, 발산 및 면역 글로불린, 또는 바이러스 성, 세균성, elutions를 포함 하 여 특정 다운스트림 응용 프로그램으로 맞출 수 있습니다 및 호스트 셀 RNA. 우리 임상 수집 및 연구소 임상 연구자에 대 한 가이드로 나 및 바와 관련 된 처리 기법 제시.

<table><tbody><tr><td>비흡수(성인, 너비 7mm)</td><td>Hunt Developments</td><td>NSFL-FXI-11</td><td>환자 그룹/연령에 따라 다양한 크기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>기관지 흡착</td><td>사냥 개발</td><td>BSFL-FXI-11</td><td>최소 기관지경 채널 크기 2mm; 최대 작업 길이 815mm</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 코스타&nbsp; 스핀-X&nbsp; 원심분리기 튜브 필터 (멤브레인 없음)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS9301-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 코스타&nbsp; 스핀-X&nbsp; 원심분리기 튜브 필터(0.22um 멤브레인)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8160-24EA</td><td>감염 위험이 있는 샘플의 멸균용.</td></tr><tr><td>분석(용리) 완충액</td><td>Millipore</td><td>AB-33k</td><td>Millipore 웹사이트에 나열되어 있지 않지만 문의 또는 Cedarlane과 같은 일반 실험실 공급 회사를 통해 구할 수 있습니다. 0.05% Tween-20 및 1% BSA를 함유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>NP-40 세포 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>FNN0021</td><td>소 혈청 알부민을 1%(w/v)에 추가합니다. 더 높은 절대 중재자 수준을 회복할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>완충액 RLT (RNA 추출)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>비강 흡착 및 기관지 흡착 샘플에서 RNA를 회수할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML-M</td><td>HPLC 응용 분야에 사용되는 샘플 용출을 위해</td></tr><tr>Spin-X 튜브 필터에는<td>2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Costar</td><td>3213</td><td>2ml 튜브가 필요하며 기존 1.5ml 튜브는 이에 맞지 않습니다.</td></tr></tbody></table>

비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

비 흡수 (NA)과 기관지 흡수 (바)의 방법 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 인간의 호흡기의 점 막 내벽 유체 (MLF)을 흡수. 나, 비 열 등에서 액체를 흡수 하 고 최소한의 불편을 초래 하는 비-침략 적 기술입니다. 나는 상부 기도의 샘플링을 자주 반복 하는 기능 재현 가능한 결과 얻지 못했다.
비교 함으로써, 호흡기 점 막, 비인 두 포부 (경찰청) 등 기존의 보라고 샘플링의 대체 방법을 더 침략 적 이며 큰 데이터 변화 될 수 있습니다. 다른 방법 제한, 예를 들어, 생 검 및 기관지 절차는 침략 적가 래 포함 많은 죽은 죽어 세포 하며 액 화, exhaled 호흡 응축 (EBC) 포함 물과 타 액, 및 게 샘플은 희석과 변수입니다.
바 병원에 bronchoscope의 작업 채널을 통해 수행할 수 있습니다. 샘플링은 잘 용납 하 고 기도에 여러 사이트에서 수행할 수 있습니다. 바는 MLF 샘플 bronchoalveolar 게 (BAL) 샘플 보다 덜 묽 게 되 고 결과.
이 문서에서는 NA, BA의 기법 뿐만 아니라 원하는 다운스트림 biomarker 측정 되 고에 지 어질 수 있다 결과 샘플의 실험실 처리 합니다. 이러한 흡수 기술을 임상 호흡기 연구에 사용 되는 기존의 샘플링 기법 유용한 대안입니다.

없음은 쉽게 다양 한 연구에에서 이용 되어 고 비 접촉 측정 점 막 염증. 코에 알레르기의 관리, 다음 스타 글란 딘-d 2 (PGD2) 수준 상승 하 고 분 (그림 1), 돛대 세포 degranulation (트와 츠 외, 원고 준비 중) 맞춰가 관찰할 수 있습니다. 또한, 중재자 타입 II 염증, IL-5 (그림 2, 24에서 허가로 증 쇄 하는), 등의 비 강 알레르기 도전23,24다음 시간에 측정할 수 있습니다. 알레르기 천식과 건강 한 컨트롤의 실험적인 감염, 나는 7 일 (그림 3, 6에서 허가로 증 쇄 하는)의 과정을 통해 인터페론 감마 (IFN-γ)를 포함 하 여 중재자의 패널을 측정 하 사용 되었다. 또한, 유아의 자연 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염, 나 비-RSV 기관지염와 건강 한 컨트롤 ( 유아 상대적인 IFN-γ 등 염증 성 cytokines의 높은 수준의 연관 RSV를 시연 그림 4, 30의 허가 함께 재발급). 흥미롭게도, RSV와 비-RSV 기관지염이이 차별 시간 일치 경찰청 샘플 (그림 4)에 중요 했다.
바 이노와 알레르기 천식의 실험적인 감염 동안도 사용 되었다. 하루의 4 rhinovirus 감염, 레벨의 IFN-γ, CXCL11에서 IL-10과 IL-5 기준선 (그림 5;에서 상승 했다 A, B, C, D, 각각). 또한,이 기술은 건강 한 컨트롤 (그림 5D) (그림 5 6에서 허가로 증 쇄 하는)을 기준으로 라 이노 바이러스 감염 시 알레르기 천식의 낮은 기도에 높은 IL-5 레벨을 시연 했다.
이러한 대표적인 결과 eluted 0.05% 트윈-20 및 1 %BSA 포함 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 샘플에서 생성 된 ( 재료의 표참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> 그림 1 : 빠른 생성 및 비 강 알레르기 도전 다음 스타 글란 딘-d 2의. 디 모 데 잔디 꽃가루와 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 샘플에 비 흡수 있다에서 스타 글란 딘-d 2 (PGD2)의 레벨 측정 (n = 5). 각 줄은 한 개인에서 데이터를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> 그림 2 : IL-5 비 강 알레르기 도전 다음의 운동 측정. 비 강 알레르기 도전 다음 직렬 비 흡수 샘플에서 IL-5의 생산. 3 알레르기 도전 연구를 실시 했다, 참가자와 함께 반복 (n = 19) 위약 (파란색)을 받고, 낮은 복용량 (10 mg) 경구 프레드 니 손 (오렌지), 또는 높은 복용량 (25mg) 경구 프레드 니 손 (빨간색) 알레르기 관리 이전 1 시간. 라인은 표시 하 고 오차 막대는 모든 참가자의 95% 신뢰 간격. (그림 2017 Leaker 외, 점 막 면역학에서 허가로 증 쇄). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> 그림 3 : Rhinovirus 감염 시 인터페론-γ의 유도. 건강 한 성인의 감염 도전 중 (n = 11, 블루)와 알레르기 천식 (n = 28, 레드) 이노-16, 비 흡수 샘플링 인터페론-γ (IFN-γ)의 레벨을 측정 하기 위해 사용 되었다. 데이터는 interquartile 범위를 나타내는 오차 막대와 개인 및 B) 중간 레벨의 A) 원시 스파게티 플롯으로 표현 됩니다. (그림은 헨젤과 그 외 여러분 에서 허가로 증 쇄 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> 그림 4 : Nasosorption 유아의 RSV 감염 연관 높은 인터페론-γ 차별. 비 흡수와 비인 두 열망 (경찰청) 기관지염 호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 감염과 관련 된 유아의 인터페론-γ 수준을 측정 하는 데 사용 했다 (빨강, n = 12), 비-RSV 호흡기 병원 체 (녹색, n = 12), 그리고 건강 한 컨트롤 (블루, n = 9). 데이터 Kruskall-월리스 테스트를 사용 하 여 여러 비교를 Dunns 정정 분석 했다 (* * *p&lt; 0.001). 라인 중간 값 나타냅니다 있으며 오차 막대 interquartile 범위. (트와 츠 외 허가 수정 그림 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> 그림 5 : 기관지 흡수 샘플 rhinovirus 감염 동안에 염증 성 중재자. 건강 한 컨트롤의 이노 16 감염 다음 (n = 10, 파랑) 및 알레르기 천식 자원 봉사자 (n = 23, 레드), 기관지 흡수 기준선에와 감염의 날 4 D) IL-5, C) IL-10, B) CXCL11, A) IFN-γ의 수준을 측정 하는 데 사용 되었다. 데이터 Wilcoxon 분석 평가 테스트 (일치 샘플)와 맨-휘트니 테스트 (최고의 샘플) 서명. 헨젤 외 에서 허가로 증 쇄 하는 그림 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 원고는 위와 더 낮은 기도의 점 막 내벽 액체 (MLF)을 합성 흡수 성 행렬 (SAM)를 사용 하 여 특히 비 강 및 기관지 흡수 기술의 사용을 설명 합니다. 이 메서드는 더 나은 표준화 및 기존 호흡기 샘플링 기법 보다 내성 제공합니다.

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

오늘은 합성 흡수 매트릭스를 사용하여 점막 표면액을 흡수하는 정밀 점막 샘플링 방식인 나소소프션(nasosorption) 기술을 시연하겠습니다. 나소소프션 샘플러는 핸들과 멸균 크라이오튜브(cryotube)에 담긴 SAM으로 구성됩니다. SAM은 섬유 또는 폼 형태의 폴리머로 구성되며, 샘플 수집을 위한 빠른 심지 현상과 더불어 부드럽고 흡수력이 뛰어나도록 특별히 선정되었습니다.SAMs는 또한 단백질 결합이 최소화되어 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있습니다. 비강 흡착(Nasosorption)은 매우 완만한 비침습적 기술로, 영유아를 포함한 모든 연령대의 환자에게 시행할 수 있습니다. 또한, 몇 분 간격의 연속적인 샘플링도 가능합니다.비강 흡입(nasosorption)을 수행할 때는 먼저 환자가 보는 앞에서 손을 씻고 장갑을 착용하는 것이 좋습니다. 우선 비강 내부를 검사합니다. 헤드 랜턴 사용을 권장하며, 임상의는 비우세손 엄지손가락으로 환자의 코를 들어 올려 비강 내부를 시각화해야 합니다.일반적으로 비경(nasal speculum)은 필요하지 않습니다. 비강 내부를 살펴보면 콧구멍(nares)의 단면은 원형이 아니며 곧게 뒤쪽으로 이어져 있습니다. 일반적으로 콧구멍의 외측벽에 움푹 들어간 돌출부 형태로 하비갑개(inferior turbinate)가 보이며, 비중격(nasal septum)은 매끄럽고 평평한 내측벽을 형성하고 있습니다.하비갑개의 하부 상피는 호흡기 계통의 단순 섬모 상피이므로, 이곳에서 샘플을 채취하고자 합니다. 샘플링 시, nasosorption SAM을 루멘을 따라 부드럽게 삽입하여 하비갑개에 평평하게 밀착시킵니다. 그런 다음 검지 손가락을 사용하여 SAM을 비강 점막에 누릅니다.MLF가 흡수되면서 약간의 간질거림과 함께 눈물이 날 수 있습니다. 일반적으로 60초 동안 시간을 정해 흡수시킵니다. 그 후 비강 흡수 장치를 콧구멍에서 제거하여 크라이오튜브에 다시 넣고, 즉시 얼음에 보관한 후 급속 냉동할 수 있습니다.또는 즉시 MLF 용출 단계로 진행할 수 있습니다. nasosorption은 다양한 비점막 자극 모델 및 여러 기도 질환에서 연구되고 있습니다. 하지만 이 상대적으로 새로운 방법은 다른 호흡기 샘플링 방법들과의 공식적인 검증이 여전히 필요합니다.기관지 흡착 기술은 합성 흡수 매트릭스를 사용하여 기관지의 점막 내층액을 채취합니다. 이 방법은 전문 인력이 섬유 내시경을 통해 수행합니다. 기관지 흡착 장치는 중앙에 플라스틱 가이드와이어가 포함된 외부 중공 카테터로 구성됩니다.이 제품의 끝단에는 핸드피스 작동 시 돌출되는 SAM이 장착되어 있습니다. nasosorption과 마찬가지로 SAM 스트립은 부드럽고 흡수력이 뛰어나며, 샘플 수집을 위한 빠른 심지 현상을 보입니다. 또한 단백질 결합을 최소화하여 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있도록 설계되었습니다.기관지 흡착 장치를 기관지경을 통해 삽입하기 전에, SAM이 카테터 밖으로 쉽게 돌출되었다가 다시 원활하게 회수되는지 확인하는 것이 일반적입니다. 이제 기관지경 시뮬레이터를 사용하여 기관지 흡착 방법을 시연하겠습니다. 먼저 표준 기관지경 검사를 수행하며, 기관지경을 기관을 지나 우측 주기관지로 통과시킨 후, 우하엽과 우중엽이 나뉘는 지점 바로 근위부인 중간기관지 높이까지 진입시킵니다.이 수준까지 삽입되면 다섯 가지 단계를 따릅니다. 첫째, 카테터 삽입입니다. 기관지 내시경의 작동 채널을 통해 기관지 흡입 카테터를 삽입하며, 카테터의 흰색 팁이 기도 내에서 보일 때까지, 최대 기관지 내시경 끝단에서 원위쪽으로 1 cm까지 삽입합니다.기관지경과 카테터 팁을 기도의 루멘 중심에 유지하십시오. 점막 손상 위험을 줄이기 위해 카테터 팁과 기관지 점막 사이의 접촉을 최소화하도록 주의하십시오. 둘, SAM을 제거합니다.SAM 스트립이 우중엽 또는 우하엽 기도의 내강으로 밀려 나오도록 기관지 흡착 장치의 핸들을 누릅니다. 직접 시야 하에서 기관지 내시경의 팁을 구부려 SAM이 기도 벽의 점막 안감 액체와 접촉하고 있는지 확인합니다. SAM 스트립을 기도 내에 두고 점막 벽에 밀착시킨 상태로 30초 동안 유지합니다.셋째, SAM을 삽입합니다. 직접 시야 하에 SAM을 카테터 안으로 직접 후퇴시킵니다. 후퇴시킬 때 습윤 상태의 SAM 프로브가 직선을 유지하고 있는지 확인하십시오.필요한 경우, 카테터와 기관지경 팁을 다시 끌어당겨 SAM을 곧게 펼 수 있습니다. SAM을 후퇴시키는 데 어려움이 있다면, SAM이 돌출된 상태 그대로 장치 전체를 기도 밖으로 제거하십시오. 넷, 카테터를 올립니다.기관지경의 수술 채널에서 카테터 전체를 제거합니다. 다섯째, SAM을 절단합니다. SAM을 멸균 가위로 절단하여 크라이오튜브에 넣고, 급속 냉동하거나 직접 용출시키기 전에 즉시 얼음 위에 올려두어야 합니다.다음 비디오 클립은 연구 목적의 기관지 내시경 검사를 받는 환자의 기도로 SAM을 압출하는 모습을 보여줍니다. 기관지 흡착(Bronchosorption)은 현재 다양한 폐 질환을 대상으로 연구되고 있습니다. 이러한 정밀 점막 샘플링 방법이 진단 과정과 환자 층화 및 모니터링에 유용하게 활용되기를 기대합니다.비강 흡착 및 기관지 흡착 후의 실험실 처리. 합성 흡착 매트릭스로부터의 점막 내층액 용출. 오늘은 비침습적 점막 샘플링 기술인 비강 흡착 및 기관지 흡착 이후의 일반적인 실험실 샘플 처리 원리를 시연하겠습니다.특히, 합성 흡수 매트릭스로부터 점막 내층 액체 시료를 용출하는 방법을 시연하겠습니다. 수집 시점에 시료는 실험실로 운송하기 위해 얼음에 보관해야 합니다. 시료는 즉시 처리하거나, 나중에 용출하기 위해 원래의 시료 튜브에 담아 바로 초저온 냉동고에 보관할 수 있습니다.즉시 처리를 수행하는 경우, 샘플을 원래의 샘플 튜브에 담아 얼음 위에서 실험실로 운반할 수 있습니다. 또는 채취 시점에 SAM을 분리하여 용출 버퍼에 넣은 후, 얼음 위에서 실험실로 운반할 수 있습니다. 샘플은 처리 전까지 수 시간 동안 버퍼 내에서 또는 샘플 튜브에 담긴 채로 얼음 위에 보관할 수 있습니다.SAM의 원심분리 및 스핀 용출 전 세척 단계는 시료 회수율을 최적화하는 것을 목적으로 합니다. 이를 위해 SAM을 원하는 추출 버퍼와 함께 Eppendorf 튜브에 넣습니다. 그런 다음 볼텍스 믹서로 30초 동안 혼합하여 SAM에 느슨하게 부착된 액체와 생체분자를 세척합니다.시료를 완전히 회수하기 위해, 세척에 사용했던 동일한 Eppendorf tube 내의 스핀 인서트에 습윤 상태의 SAM을 추가하여 스핀 용출을 수행합니다. 오염을 방지하기 위해 이 과정에서는 깨끗한 핀셋을 사용해야 하며, 시료마다 핀셋을 교체해야 합니다. 이 방법은 원심분리를 이용하여 SAM에서 액체를 추출합니다.4 °C로 냉각된 원심분리기를 사용하여 샘플을 16,000 g에서 20분 동안 원심분리합니다. 사용할 용출 버퍼는 원하는 응용 분야에 따라 결정됩니다. 일반적으로 단백질 함유 아미노 분석 버퍼 또는 RNA 용해 버퍼를 사용합니다.두 가지 유형의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다. 첫 번째는 SAM을 고정하는 플라스틱 메쉬만 포함되어 있어 유체의 완전한 용출이 가능합니다. 또는, 감염성 물질을 다루는 경우 0.2 µm 공극 크기의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다.이 필터들은 감염된 시료를 오염 제거하며 미생물 감염이 의심되는 시료에 적합합니다. 이러한 필터가 필요한 경우, 시료를 추가하기 전에 단백질 완충액을 필터에 충분히 적시는 사전 배양 단계를 포함하는 것이 중요합니다. 이 단계는 비특이적 단백질 흡착으로 인해 매개체가 필터에 결합하는 것을 최소화합니다.다음은 2급 병원체를 포함하여 오염 제거 단계가 필요하지 않은 시료의 비강 흡착(nasosorption) 및 기관지 흡착(bronchosorption) 처리에 당 연구실에서 사용하는 예시 방법입니다. 1단계로, 적절한 완충액이 들어 있는 Eppendorf 튜브에 SAM을 넣고 30초 동안 볼텍싱합니다. 비강 흡착의 경우 일반적으로 300 µL의 완충액을 사용하며, 기관지 흡착의 경우 100 µL를 사용합니다.두 번째 단계로, 포셉을 사용하여 SAM을 제거한 후 SAM 세척에 사용된 완충액과 함께 플라스틱 메쉬 필터 컵에 넣습니다. 세 번째 단계로, SAM이 들어있는 플라스틱 메쉬 필터 컵을 원래의 Eppendorf 튜브에 다시 넣습니다. 네 번째 단계로, 필터 컵, 완충액, SAM이 들어있는 Eppendorf 튜브를 4 °C에서 16,000 g로 20분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후 SAM이 포함된 필터 컵을 제거하여 폐기합니다. 이후 용출액을 소분하여 딥프리징(deep frozen) 보관함으로써 추후 분석에 사용할 수 있습니다. 나소소프션(Nasosorption) 샘플링은 다수의 임상 호흡기 연구 환경에 적용되어 왔습니다.여기에는 prostaglandin D2 및 interleukin 5와 같이 비강 알레르겐 유발 시험 중 발생하는 염증 매개체 측정이 포함됩니다. 특히 이러한 유발 모델 설정에서 나소소프션(nasosorption)을 통한 샘플링을 이용하면 몇 분 간격으로 반복 샘플링이 가능하여 매개체 농도의 빈번한 역학적 프로파일링을 수행할 수 있습니다. 나소소프션은 또한 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 라이노바이러스 감염 유발 시험에서도 사용되었으며, 연구 기간 동안 매일 반복적으로 수행되었습니다.연구에 nasosorption을 활용함으로써 라이노바이러스 감염에 따른 인터페론 반응을 민감하게 분석할 수 있었습니다. 마지막으로, 세기관지염 환아를 연구하기 위해 nasosorption 샘플링을 사용하였습니다. 본 연구에서 호흡기 세포 융합 바이러스 감염은 인터페론 감마와 같은 염증성 매개체의 수치 상승과 관련이 있는 것으로 나타났습니다.중요한 점은, 비강 흡착(nasosorption)을 통한 샘플링을 통해 영유아 연구에 건강한 대조군을 포함할 수 있다는 것입니다. 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 라이노바이러스 챌린지 연구에서도 기관지 흡착(bronchosorption)이 사용되었습니다. 이 연구는 라이노바이러스 감염 동안 하기도에서 염증 매개체인 interferon gamma, ITAC, IL-10 및 IL-5가 유의하게 증가함을 입증했습니다.하기도 연구에 이 기술을 도입하면 기관지 폐포 세척법과 같은 기존 방법으로는 검출되지 않을 수 있는 매개체 수치를 측정할 가능성이 열립니다. 결론적으로, 점막 표면액은 비침습적으로 얻을 수 있으며, 감염 및 염증 시의 염증 반응을 측정하는 데 흥미로운 잠재력을 가지고 있습니다. 용출 방법은 샘플의 특성과 측정하고자 하는 파라미터에 따라 조정되어야 합니다.특히, MLF는 점막 사이토카인 및 케모카인, 바이러스 감염, 바이러스 양, 세균 및 진균 감염, 마이크로바이옴, 그리고 점막 항체를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 점막 샘플링 및 용출 방법은 개별 프로젝트에 맞춘 맞춤형 개발과 세심한 검증이 필요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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Spiral Microfluidics Channel을 사용한 기관 분비에서 무표지 호중구 분리

이 비디오는 신생아 인간 비강 점막 내막 유체 추출물의 면역 매개체 수치를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 전기화학발광 기반 멀티플렉스 분석 시스템은 매개체가 여기될 때 방출되는 빛의 강도를 평가하여 이러한 매개체를 측정합니다.

Quantification of immune mediaator levels in human mucosal lining fluid(인간 점막 내막액의 면역 매개체 수치 정량화)

인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.

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생물 의학 연구에 소 폐 : 시각적으로 유도 기관지, Intrabronchial 접종 및<em&gt; 생체</em&gt; 샘플링 기법

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