원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

이 절차의 전반적인 목표는 원심 용출을 사용하여 세포를 다른 세포 주기 단계로 분리하는 것입니다. 이 방법은 암 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포를 별도의 상으로 분리하기 때문에 항암 화합물의 상 의존적 영향에 대한 심문이 가능합니다.

이 기술의 주요 장점은 화학적 섭동이 아닌 물리적 특성을 사용하여 세포를 특정 상으로 분리할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하려면 스트로브 어셈블리를 원심분리기에 설치하여 전원 코드가 왼쪽의 포트를 통해 챔버 밖으로 공급되도록 합니다. 스트로브 플래시 조정 lamp 원심분리기가 닫혀 있을 때 보기 창과 정렬되도록 합니다.

각 브래킷 상단에 있는 두 개의 Phillips 헤드 나사를 조여 어셈블리를 제자리에 고정합니다. 그런 다음 브래킷 바닥에 있는 나비 나사를 조입니다. 전원 코드를 원심분리기 뒷면에 있는 스트로브 전원 포트에 꽂습니다.

그런 다음 로터를 원심분리기 구동 허브에 똑바로 놓고 T 핸들 육각 렌치로 단단히 고정합니다. 그런 다음 용출 챔버, 평형기, 회전 씰 어셈블리 및 장착 플레이트가 포함된 어셈블리를 로터에 놓습니다. 로터의 볼트가 제자리에 고정될 때까지 한 손은 용출 챔버에, 다른 한 손은 균형판에 올려 놓고 균일하게 아래로 누릅니다.

케이블의 한쪽 끝에 있는 핀을 회전 씰 어셈블리의 구멍에 넣습니다. 그리고 고정 케이블을 연결하기 위해 브래킷에 부착된 십자 머리 나사 중 하나로 다른 쪽 끝의 아이홀을 고정합니다. 흐름 시스템을 조립하고 용출 챔버 안팎으로 버퍼를 펌핑하려면 크기 16 튜브를 가변 속도 펌프에 연결하십시오.

이 튜브의 한쪽 자유 끝을 원심분리기 챔버의 왼쪽 상단에 있는 포트를 통해 챔버로 들어가도록 삽입합니다. 이 튜브의 다른 쪽 끝에 피팅을 부착한 다음 피팅을 회전 씰 어셈블리의 입력 구멍에 삽입합니다. 마지막으로, 포트를 통해 출력 튜브를 삽입하여 회전 씰 어셈블리 상단의 이송 튜브에 부착합니다.

용출 시스템이 조립되면 입력 튜브의 다른 쪽 끝을 500% 표백제로 채워진 500ml 병에 넣어 살균합니다. 그리고 출력 튜브를 빈 1리터 쓰레기통에 넣습니다. 그런 다음 펌프를 켜고 표백제가 폐기물 병으로 펌핑 될 때까지 용출 시스템을 통해 완전히 흐르도록합니다.

이제 원심분리기를 켜고 기포와 배압을 방출하기 위해 지정된 최대 속도에 도달하도록 합니다. 설정 속도에 도달하면 원심분리기를 멈춥니다. 로터가 완전히 멈춘 후 뚜껑을 열고 챔버에 누출이 있는지 검사합니다.

다음으로, 앞서 설명한 것과 유사한 방식으로 10분 동안 시스템을 통해 멸균수를 흘려보냅니다. 물로 씻어낸 후 물통을 100ml의 용출 완충액으로 채워진 멸균 유리병으로 교체하십시오. 입력 튜브를 이 병에 넣어 맨 아래에 오

원심분리기를 시작하고 버퍼가 시스템을 통해 흐르도록 합니다. 물통 병이 거의 비워지고 물이 시스템에서 완전히 씻겨 나간 후 버퍼가 시스템을 통해 지속적으로 재활용되도록 폐기물 병의 출력 튜브를 저장소로 이동합니다. 마지막으로 스트로브 램프를 켜고 용출 손잡이를 맨 왼쪽으로 돌립니다.

이제 용출 챔버가 명확하게 보이고 스트로브 라이트가 로터의 속도와 동기화되도록 손잡이를 오른쪽으로 천천히 돌려 보기 창을 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 샘플을 준비합니다. 재활용 용출 완충액이 들어 있는 저장 용기에 재현탁액을 추가합니다.

세포가 시스템으로 들어가 용출 챔버 내에서 평형에 도달하도록 합니다. 모든 세포가 챔버에 유지되도록 하려면 유리 슬라이드에 용리액을 한 방울 떨어뜨려 현미경으로 관찰합니다. 샘플에 온전한 세포가 없는 경우 챔버에 머무름을 확인합니다.

모든 세포가 챔버 안으로 들어가고 챔버의 가장 하얀 부분에서 세포와 평형을 포함하는 뚜렷한 경계가 보이면 분획을 수집하기 시작합니다. 출력 튜브를 W1이라고 표시된 미리 냉각된 50ml 원추형 튜브로 이동합니다. 이 튜브에 50ml의 용출 완충액을 모아 얼음에 보관하십시오. W1 분획을 수집한 직후 원심분리기 속도를 821G로 낮추고 출력 튜브를 W2라고 표시된 원추형 튜브로 이동하고 이 속도로 50밀리리터를 더 수집합니다.

계속해서 속도를 변경하고 분수를 수집합니다. 저장 탱크에 매체가 있는지 확인하고 수집된 분획은 항상 얼음에 보관하십시오. 모든 분획을 채취한 후 원심분리기를 중지하고 stop이라고 표시된 원뿔형 튜브에 50ml를 모읍니다.

각 분획에서 수집된 펠렛 세포, 그리고 필요에 따라 유세포 분석 또는 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 다운스트림 분석을 사용합니다. 연속적인 용출 분획(elutriation segments)에서 세포의 평균 직경을 표시하는 선 그래프가 표시됩니다. 세포 직경이 클수록 용리되는 분수 수가 높아집니다.

형광 활성화 세포 분류 분석 결과는 20개의 용출 분획 각각에 있는 세포의 DNA 함량을 보여줍니다. 초기 분획 F1 내지 F5는 G1 단계의 세포를 나타내는 2N DNA 함량을 가진 세포를 거의 독점적으로 포함합니다. G1 및 S 상에서 세포의 혼합물은 중간 분획 F6 내지 F9에서 보였다. 그리고 G2에서 M까지의 세포를 나타내는 4N DNA 함량을 가진 세포는 F10에서 시작하여 관찰되었습니다.

여기에 표시된 것은 G1 단계 및 G2에서 M 단계에 있는 세포의 풀링된 분획에서 세포주기 관련 단백질의 수준을 조사한 웨스턴 블롯 결과입니다. G2에서 M Pool은 예상대로 G1 Pool에 비해 Phospho-Rb 및 Cyclin B 1 수치가 더 높았습니다. Cyclin D 하나의 신호는 약했지만 그럼에도 불구하고 G1 풀에서 감지할 수 있었고 G2에서 M 풀에서는 감지할 수 없었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시간을 할애하고 용출 시스템이 제대로 조립되었는지, 모든 재료와 용액이 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 이어, 치료 화합물이 세포주기 의존적 방식으로 어떻게 작용할 수 있는지 조사하기 위해 세포주기 분석, 세포 생존력 분석 및 면역블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.