Name: 원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 원심 엘루트리에이션을 사용하여 급성 림프구성 백혈병 세포를 세포 주기 단계별로 분리하는 방법을. 이 기술은 항암 화합물의 세포 주기 의존적 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH CA109821 (TCC)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 베크 Coulter 아낌없이 간행물 비용을 충당 하기 위해 자금을 제공 하 고 설정 및 elutriation 시스템의 운영 기술 지원. 우리는 제공 하는 초기 기본 모든 문화에 대 한 박사 프레드 Falkenburg 감사 합니다.

참고:이 프로토콜 기본 B-모든 세포 직경 약 8 µ m (G1 단계)에서 13 µ m (G2/M 단계)에서 범위에 대 한 최적화 되었습니다. 따라서, 특정 원심 분리기 속도 펌프 유량 수 없습니다 다른 크기 범위에 있는 셀에 적용. 그럼에도 불구 하 고, 적절 한 elutriation 매개 변수 침전 비율 방정식을 사용 하 여 추정 될 수 있습니다. 셀 설명된 16 10 6 셀/mL x 1-3의 최적의 밀도 정의 된 혈 청 자유로운 매체에 교양. 분수의 얼음 냉각 튜브를 사용 하 여 4 ° C에서 실시 하는 컬렉션, 제외한 모든 단계 실내 온도 및 24의 최대 20 ° C에서 원심 분리기에서 실시 하는 ° C.
 1. Elutriation 버퍼의 준비 및 자료 <ol><li>세포의 응집을 감소, 행 크의 elutriation 버퍼를 준비 하기 위해 &#39; s 균형 소금물 (HBSS) 페 놀 레드 2% 소 태아 혈 청 (보충 FBS), elutriation 프로세스, 부정 청구 셀 외관을 렌더링 하 고 응집 감소 2-naphthol-6,8-disulfonic 산 dipotassium 소금 (NDA)의 1.6 g/L 중 기계적 스트레스 로부터 세포를 보호 하.
	<ol><li>NDA의 1.6 g을 50 mL 원뿔 튜브 추가할.</li>
		<li>살 균 조건 추가 HBSS의 35 mL 1 L 병에서 NDA를 포함 50 mL 원뿔 튜브. 튜브는 NDA 해산 했다 때까지 소용돌이.</li>
		<li>새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 녹아 NDA를 전송 0.2 µ m 필터를 사용 하 여. HBSS 나머지 1 리터에 기밀 엄수 계약서 추가.</li>
		<li>마지막으로 2% (v/v)의 최종 농도를 HBSS 21 mL FBS 추가. 
		참고: elutriation 버퍼 수 준비 되며 만료 날짜는 HBSS 또는 지시자 염료의 황으로 pH에 큰 변화가 있을 때까지 때까지 4 ° C에 저장.</li>
	</ol></li> <li>표시 튜브 1과 2 (W1, W2) 분수 1-20 (F1 ~ F20), 세척 하 고 중지 되도록 50 mL 원뿔 튜브 분수의 컬렉션에 대 한 라벨.
	<ol><li>분수를 수집 하기 전에 미리 얼음이이 튜브를 진정.</li>
	</ol></li></ol> 2. Elutriation 시스템의 조립 <ol><li>첫째, 스트로보 어셈블리는 원심 분리기에 있도록 설치 전원 코드 왼쪽에 있는 포트를 통해 상공에서 먹이. 원심 분리기를 닫을 때 그것은 보기 창 줄 것입니다 그래서 스트로브 플래시 램프는 챔버의 앞에 인지 확인 합니다.
	<ol><li>먼저 각 브라켓의 상단에 두 개의 구멍에 두 개의 십자 머리 나사를 강화 하 고 다음으로 각 브래킷의 하단에 나사를 강화 하 여 장소에 어셈블리 보안.</li>
		<li>스트로브 전원 포트는 원심 분리기의 뒷면에 전원 코드를 꽂습니다.</li>
	</ol></li> <li>다음, 원심 분리기 드라이브 허브에 곧장 회전자를 설정 하 고 T-핸들 육각 렌치로 고정. 
	참고: 경우에 원심 분리기 비 elutriation 목적을 위해 필요 하지 않습니다, 스트로보 어셈블리와 회전자 지켜질 수 있다 실행 사이의 원심 분리기에.</li>
	<li>회전자 확보 되 면 인감 어셈블리와 장착 플레이트를 회전로 터에 elutriation 챔버, 카운터 밸런스, 포함 된 빠른 릴리스 어셈블리를 놓습니다.
	<ol><li>밀어 균등 하 게 한 손으로 elutriation 챔버와 카운터 밸런스에 다른 한편에는 터 볼트 장착 플레이트에 구멍에 스냅 될 때까지.</li>
		<li>는 마지막으로, 회전 씰 어셈블리에 있는 구멍에 케이블의 1 개의 측에 핀을 배치 하 고 왼쪽 o에 브라켓 십자 머리 나사 (2.1.1에 언급 된) 중 하나 케이블의 다른 쪽에 eyehole를 확보 하 여 고정 케이블을 연결 f 챔버.</li>
	</ol></li> <li>다음, 가변 속도 펌프를 사용 하 여 흐름 시스템을 조립 하 고는 elutriation에 펌프 버퍼 튜브 챔버 elutriation 챔버의 흐름으로 버퍼를 수집.
	<ol><li>삽입 크기 16 입력된 튜브 상단에 포트를 통해 변속 펌프에서 오는 왼쪽 원심 분리기 약 실 챔버에 들어가 있도록.</li>
		<li>입력된 튜브의 무료 끝에 피팅을 부착 하 고 회전 씰 어셈블리 측면 입력된 구멍에 피팅을 삽입.</li>
		<li>삽입 크기 16 출력 포트를 통해 튜브와 회전의 상단에 전송 관에 봉인 어셈블리. 
		참고: 흐름 시스템 또한 남아 있을 수 있습니다 elutriation 실행 사이의 조립.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로,는 원심 분리기를 설정 하 고 실험에 필요한 사양 설정.
	<ol><li>변경 회전자 id입니다.</li>
		<li>는 원심 분리기 시간 입력 하는 경우, 설정 된 elutriation 실행을 완료 하는 데 충분 한 더 보다는 2 h.</li>
		<li>설정 온도 20 ° c 24의 최대 온도 ° c.</li>
		<li>맥스 가속과 감속을 위해 느리게 설정.</li>
		<li>마지막으로, 867 x g.를 속도 설정</li>
	</ol></li></ol> 3. Elutriation 시스템의 못쓰게 <ol><li>elutriation 시스템 소독, 5% 표 백제를 포함 하는 500 mL 플라스틱 병에 저수지 튜브를 놓고 출력 튜브는 빈 1 L 플라스틱 폐기물 병에 배치 하려면 먼저.
	<ol><li>펌프를 켜고 25 mL/min로 속도 설정 하 고 5% 표 백제 폐기물 병으로 출력 튜브 펌핑은 때까지 줄곧 elutriation 시스템을 통해 흐름을 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 켜고 거품 및 배 압 순서 속도 (867 x g)를 지정 하는 최대와 서 허용.</li>
		<li>는 원심 분리기를 중지합니다. 로 터 회전 중지, 일단 뚜껑 열고 어떤 누출에 대 한 챔버 검사.</li>
		<li>아무 누출 경우 게 표 백제 솔루션 최소한 5 분에 대 한 시스템을 통해 흐름</li>
	</ol></li> <li>로 표 백제는 수는 세포의 응집으로 이어질 뿐 아니라 세포에 해를 입힐 elutriation 버퍼에서 침전의 형성으로 이어질 수 있습니다 다음, 압력가 마로 소독 물 시스템을 플러시.
	<ol><li>장소 압력가 마로 소독의 1 리터 병으로 저수지 튜브 물 하 고를 통해 적어도 10 분에 대 한</li>
	</ol></li> <li>물으로 홍 조, 후 elutriation 버퍼 시스템에 도입. Elutriation 버퍼 및 셀에 대 한 저수지를 만들 압력가 되었습니다 150 mL 유리병을 사용 합니다.
	<ol><li>Elutriation 버퍼의 100 mL 병에 추가 하 고 튜브 맨 아래에 되도록 유리 병 저수지 튜브 이동.</li>
		<li>는 원심 분리기를 시작 하 고 물 밖으로 플러시 시스템을 통해 흐름에 버퍼가.</li>
		<li>저수지 병 거의 비어 일단 물 시스템에서 완전히 붉 어 지는 출력 튜브 폐기물 병에서 저수지에는 버퍼 시스템을 통해 재활용 되 고 있도록 이동.</li>
	</ol></li> <li>마지막으로 조정 보기 창을 elutriation 챔버 현재 속도로 볼 수 있습니다.
	<ol><li>보도 스트로보 램프 램프 켜 하는 원심 분리기의 외부에 버튼 전원. Elutriation k를 설정노브를 왼쪽 원심 분리기의 외부에도.</li>
		<li>천천히 보기 창을 통해 보고 차례 elutriation 챔버 보기 및 스트로브 빛에 올 때까지 오른쪽 노브는로 터의 회전 시간. 
		참고: elutriation 시스템 남아 있을 수 있습니다이 상태에서 셀 준비 될 때까지.</li>
	</ol></li></ol> 4. 셀 샘플의 준비 <ol><li>수 전지와 여러 50 mL 원뿔 튜브에 aliquot 300 400 백만 성장 매체. 3 분 위한 1210 x g에서 셀 아래로 회전</li>
	<li>25 ml를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 elutriation 버퍼의 성장 매체 및 resuspend 세포 aspirate.</li>
	<li>줄이기 위해 세포 응집, 패스는 25 통해 두 번 셀 게이지 바늘.
	<ol><li>10 mL 주사기를 사용 하 여 셀을 그릴 25 게이지 바늘을 연결 하 고 내부에는 셀을 통과 살 균 50 mL 원뿔 튜브의 벽. 이 모든 25 mL 바늘 통과 될 때까지 반복.</li>
		<li>새 바늘과 주사기를 한 번 위의 과정을 반복. 
		주의: 주사기 바늘은 sharps 용기에 배치 되어야 합니다. 
		참고:이 중요 그 셀 올려집니다 바늘을 통해 elutriation 시스템에 그들을 소개 하기 전에 즉시 세포 응집을 최소한 유지.</li>
	</ol></li></ol> 5. Elutriation 시스템 및 분수의 컬렉션에 셀 샘플의 소개 <ol><li>소개 통해 재활용 나머지 elutriation 버퍼는 저수지 탱크에 셀 샘플을 붓는 의해 elutriation 시스템으로 셀 샘플 .
	<ol><li>셀 시스템에 입력 하 고 elutriation 챔버 내에서 평형에 도달 하자. 
		참고:이 과정은 약 5 분 소요 됩니다 그리고 그들이 보기 창을 통해 챔버를 입력으로 셀을 보면서 진행을 추적할 수 있습니다. 모든 셀에에서 있도록 챔버, 걸릴 드롭 eluent의 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 볼. 이 챔버에 그들의 보존을 확인 하는 샘플 그대로 셀의 무료 이면.</li>
	</ol></li> <li>일단 모든 셀 챔버에 입력 한 있는 셀 균형 있는 챔버의 가장 넓은 부분에 뚜렷한 경계가 분수를 수집 하기 시작.
	<ol>출력 관 50 mL 원뿔 관으로 이동 하 여 <li>시작 레이블이 W1. 이 분수, 저수지 탱크에 고 elutriation 버퍼 필요한 경우 보충를 위한 elutriation 버퍼의 50 mL 수집. 
		참고: 모든 셀 시스템에 입력 했습니다 있는지 확인 하기 위해 저수지 탱크를 처음으로 저수지를 채우는 전에 거의 빈 될 수 있습니다. 첫 번째 리필 후 그것 거의 비어 될 저수지에 대 한 기다릴 필요가 되지 않습니다. 또한, 하지 마십시오 있도록 허용 될 빈이 시스템에 거품과 백 프레셔를 만들 것입니다 탱크.</li>
		<li>일단 50 mL가 w 1에 대 한 수집, 동시에 821 x g 속도 변경 표시 W2 원뿔 튜브에 출력 관 고 이동 50 mL이이 속도에서 더 많은 수집.</li>
		<li>계속 속도 변경 하 고 표 1에 표시 된 대로 분수를 수집 합니다. 저수지에서 미디어 탱크와 모든 시간에 얼음에 원뿔 관을 유지 있는지 확인 합니다. 마지막으로, 천천히 속도 감소로 오른쪽 노브를 설정 하 여 보기 창 조정.</li>
		<li>일단 모든 20 분수 수집 되어, 있는 원심 분리기를 중지 및 정지를 표시 하는 원뿔 튜브에 50 mL 수집.</li>
	</ol></li></ol> 6. Elutriation 시스템의 플러싱 <ol><li>는 원심 분리기 멈춘 후 완전히 플러시 시스템 저수지 튜브 압력가 물과 폐기물 병에서 다시 출력 관의 1 리터 병에 넣어.
	<ol><li>50 mL/min까지 펌프 속도 설정 하 고 있도록 그것 고갈 될 때까지 시스템을 통해 실행 물.</li>
	</ol></li> <li>설정 펌프, 빠른 릴리스 어셈블리에서 입력 및 출력 호스를 제거 하 고 고정 케이블에서 핀을 꺼내.
	<li>제거로 터에서 빠른 릴리스 어셈블리 <ol>. 
		참고: 무엇는 원심 분리기 사용 됩니다, 따라서 elutriation 시스템 수 지금 남아 있을 이다. 그렇지 않으면, 전체 어셈블리 수 내려올 반대 순서에 따라 위에서 설명한 대로. Elutriation 챔버 빠른 릴리스 어셈블리에서 제거 하 고 초음파 물 목욕을 사용 하 여 실행 사이의 청소 수 있습니다. 이 이후 실행에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 챔버 벽에서 파편과 오염 물질을 제거.</li>
	</ol></li></ol> 7. 분수와 G1 또는 G2/M 풀의 컬렉션의 분석.
 참고: elutriation의 효과 설명 하기 위하여 각 분수 세포 수, 세포 직경, 및 DNA 콘텐츠 분석 및 풀 셀에 만들어집니다 immunoblot 분석에 대 한 G1 또는 G2/M 단계에 설명 된 대로 대표 결과입니다. 이 프로토콜 섹션 이러한 풀을 만들 및 실험적인 사용을 위해 그들을 준비 하는 방법을 설명 합니다.
<ol><li>2000 x g 4 ° C와 elutriation 버퍼에서 aspirate에서 5 분 동안에 각 분수를 스핀.</li>
	<li>G 1 단계 풀와 G2/M 단계 풀을 얻기 위하여 함께 결합 분수.
	<ol><li>G 1에 대 한 수영장 단계, 총 1 mL의 인산 염 버퍼 염 (PBS) 및 15 mL 원뿔 튜브에 661 x g (f 1-f 5) 788 x g의 속도 범위에서 수집 된 분수를 resuspend. G2/M 단계 풀 resuspend g x 333 x g (F17-F20) 387의 속도 범위에서 수집 된 분수.</li>
		<li>2000 x g 4 ° C와 PBS에서 aspirate에서 5 분에 셀 아래로 회전.</li>
	</ol></li> <li>셀 성장 매체의 10 mL에 resuspend 하 고 세포 수.</li>
	<li>Propidium 요오드 화물 얼룩 통해 콘텐츠 dna 분석 각 풀에서 한 약 수를 받아 고 cytometric 분석 15. 
	참고: 각 풀의 나머지는 추가 실험을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

Anisha Kothari 전지와 세인트 주드 어린이 연구 병원 분자 생물학의 부에 현재 있다.

우리 CCE를 사용 하 여 세포 주기의 다른 단계에 기본을 얻기위한 방법 모든 셀을 설명 했습니다. 최적의 조건에서 셀 g 1 단계에의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구 쉽게 얻어질 수 우수한 수율, 그리고 셀 S 단계에서 매우 풍성 하 게 얻어질 수 있다 또한 원하는 경우. 여기에 제시 된 결과 독립적인 문화, 모든-215주 모든 문화 (특히, 모든-5), 그리고 본질적으로 동일한 결과 얻은 사용 하 여 얻은 했다. 또한, 다른 모든 기본 날짜를 검사 하는 모든 문화 비슷한 밀도 범위 동안 비동기 성장, 그리고 가능성이 CCE를 때 유사 하 게 수행 합니다. 우리의 이전 연구 또한 나타났습니다 HL60, K562, 등 다른 백혈병 세포 라인 CCE19,20를 사용 하 여 다른 세포 주기 단계로 분리 될 수 있다. 절차의 중요 한 단계를 확인 셀...

배양된 세포는 일반적으로 비동기적으로 성장 하 고 개별 세포는 세포 주기의 다른 단계에 존재. 일부 생물 자연스럽 게 동기 세포 주기 전시 또는 특정 생리 적인 자극에 의해 동기화 할 수 있습니다. 예를 들면 점액 형 Physarum polycephalum 의 거 대 한 plasmodia 내 핵 매우 동기 패션1와 Desmodesmus quadricauda 는 빛과 어둠을 번갈아 하 여 동기화 할 수 있습니다 녹색 조류의 세포 분 기간2. 이러한 생물 독특한 실험 특성을 제공, 그들은 부적당 하 게 포유류 세포의 복잡 한 모델. 포유류 세포 인구를 인위적으로 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해 및 세포 주기 검문소의 분자 기준 발전 중심 되었습니다. 일반적인 방법에는 혈 청 부족, 화학 블록 및 릴리스 또는 물리적 특성3,4악용 포함 됩니다. 혈 청의 철수 자주 세포 정지, 입력 하 고 g 1 단계5에 세포 주기 재입국을 촉진 하는 혈 청의 다시 추가 합니다. 화학 억제제 초과 티 미 딘 또는 G1/S 경계에서 세포를 차단 hydroxyurea microtubule 억제제는 일반적으로 M 단계3,4에 셀을 체포 대리인을 포함 합니다. Mitotic 쉐이크-오프 이후 그들은 덜 interphase 셀6보다 부착에 mitotic 세포에 대 한 풍부 하 게 사용할 수 있는 물리적 특성을 악용 하는 방법이 포함 합니다. 그러나, 이러한 모든 기술 잠재적인 단점이 있다. 예를 들어 모든 셀 형식 mitotic 억제제와 사전 동기화 없이 제한 mitotic 쉐이크-오프 후 혈 청 또는 화학 억제제의 존재의 부재와 셀의 수익률에서 생존을 유지 합니다.
어디 셀 점차적으로 감소 크기에 그들은7분할 초기 배아 세포 주기를 제외 하 고 대부분의 세포 주기를 통해 발전 성장 단계를 받아야 더 큰 되 고. 이 속성은 특히 원심 elutriation (CCE) 크기에 서로 다른 세포를 분리 하는 데 사용할 수 있으며 따라서 세포 주기에서8,9단계 기법에 악용 됩니다. CCE, 동안 세포는 2 개의 반대 세력의 영향 아래: 회전의 축에서 셀 드라이브, 원심력과 유체 속도 (특히), 회전 (그림 1)의 축으로 셀 드라이브. Elutriation 챔버에 셀이이 힘 같은지는 평형 위치에 도달 합니다. 평형 위치를 지시 하는 핵심 요소는 셀 직경 및 밀도 있습니다. 버퍼 솔루션의 속도 증가 흐름으로 원심력을 능가 하는 특히 끌기 힘, 새로운 균형을 설립, 챔버 내부 셀의 위치에 변화를 일으키는. 모든 세포는 특히 속도 충분히 증가 하 여 그들의 출구를 홍보를 때까지 더 큰 셀 챔버 내에 유지 하는 반면 먼저 챔버를 떠나 작은 것 들의 결과로 챔버 출구 쪽으로 이동 했다. 특히 속도 연속 증가와 elutriation 챔버 탈출 셀 특정 분수에 수집 될 수 있습니다 고 각 분수 순차적으로 증가 하는 크기의 셀을 포함 합니다. 특히 속도 증분 증가와 elutriation 실시, 대신 원심 분리 속도 감소 하 여 원심력에 순차 감소 동일한 결과 달성할 것 이다. Elutriation 과정 세포 유형과 elutriation 버퍼, 사용 하는 특정 장치에 따라 최적화를 있어야 합니다. 이러한 조건에서 셀의 침전 속도 최고의 Stokes 법칙에 의해 설명: SV = [d2(ρp-ρm) / 18η].ω2r, 어디 SV = 침전 속도; d =; 입자의 직경 Ρp =; 입자의 밀도 Ρm = 버퍼;의 밀도 Η =; 버퍼의 점성 Ω; 회전자의 각 속도 = 그리고 r = 입자의 방사형 위치. 따라서, SV는 셀 직경 및 밀도에 비례 하 고 직경 두 번째 전력 발생, 이후 그것은 일반적으로 세포 주기를 통해 상수는 밀도 보다 더 크게 기여.
CCE의 중요 한 장점은 셀 화학 치료 또는 영양 부족의 가혹한 조건에 적용 되지 않습니다 우수한 수익률 본질적으로 교란된에 복구할 수 있습니다. 요구는 문제의 세포 직경, 적어도 30%의 상당한 증가 받게 세포 주기 통과. 주요 단점은 특수 원심 분리기, 회전자, 및 액세서리의 비용입니다. 그럼에도 불구 하 고, 셀 CCE에 의해 특정 세포 주기 단계에서 풍성 하 게 준비 하는 능력은 크게 포유류 세포9,10에서 효 모 유기 체에서 세포 주기 연구를 촉진 했다. 또한, 최근 발전 암 조직, 이질적인 혼합물에서 특정 종류의 세포 immunotherapy9에 대 한 생산을 다른 세포 유형의 분리 대 건강 한에서 세포의 분리에 사용을 확산 되고있다.
우리의 주요 관심 vinca 알 카 로이드, taxanes 등 에이전트 (Mta)를 대상으로 하는 microtubule의 행동의 메커니즘을 이해 하고있다. 이 약은 유사 분열, 스핀 들 microtubule 함수11,12, 차단에 독점적으로 행동 생각 했다 하지만 최근 증거 그들은 또한 interphase microtubules13,14을 대상 수 있습니다 나왔다. 우리는 최근 주 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) 셀 받 다 죽음에 g 1 단계 또는 m에서 vincristine, 세포 주기 의존적인 방식으로15에서 다른 Mta로 치료 하면 단계를 했다. CCE에 의해 다른 세포 주기 단계에 모든 세포를 분리 하는 기능은이 결론에 도달에서 쓸모 있었다. 이 문서에서는, 우리는 기술적인 세부 사항을 설명 하 고 다른 세포 주기 단계에서 모든 셀 기본 준비에 CCE의 응용 프로그램에 대 한 실용적인 팁을 제공.

<table><tbody><tr><td>행크스의 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L 병</td></tr><tr><td>Fetal Plus 소 혈청</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL 병</td></tr><tr><td>2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g 분말</td></tr><tr><td>50 mL concial 튜브</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/케이스</td></tr><tr><td>PES 멤브레인 0.22 &마이크로; m 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>원심분리기 용출 시스템과 호환 JE</td></tr><tr><td>5.0 용출기 로터 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>로터 키트(로터, T-핸들 육각 렌치, 퀵 릴리스 어셈블리(용출 챔버 제외), 앵커링 케이블 및 스트로브 어셈블리 챔버 포함</td></tr>, <tr><td>표준, 4-mL, "A"</td><td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>표준 용출 챔버&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load 펌프 헤드</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 가변 속도 드라이브</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm 백금 경화 실리콘 펌프 튜브, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1.5 Precision Glide 바늘</td><td>BD</td><td>305127</td><td>멸균, 일회용 바늘</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td>멸균, 일회용 주사기</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase 염색 완충액</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>550825 propidium iodide/RNase 염색 완충액</td></tr><tr><td>cyclin B1 (GNS1) 마우스 monoclonal IgG 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyclin D1 (DCS-6) 마우스 monoclonal IgG 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR 토끼 단클론 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) 토끼 단클론 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H + L) -HRP 접합체</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG (H + L) -HRP 접합체</td><td>BioRad</td><td>제170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>호

원심 elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

셀을 동기화 하는 기능 세포 주기 규칙의 우리의 이해를 발전의 중심이 되었습니다. 일반적인 기술이 포함 혈 부족; 화학 물질 세포에서 다른 세포 주기 단계; 체포 또는 mitotic 쉐이크-오프는 그들의 감소 된 준수 악용의 사용. 그러나, 이러한 모든 단점이 있다. 예를 들어 혈 청 기아 잘 정상 세포에 대 한 하지만 덜 oncogene 활성화 나 종양 억제기 손실로 인해 손상 된 세포 주기 검문소와 종양 세포에 대 한 잘 작동합니다. 마찬가지로, 화학적 치료 세포 인구는 약물 유발 손상 항구 하 고 스트레스 관련 변경 표시 수 있습니다. 이러한 문제를 circumvents는 기술 셀 2 개의 반대 힘, 원심력과 유체 속도, 크기 및 밀도 기준으로 셀의 분리에 어떤 결과를 받게 됩니다 특히 원심 elutriation (CCE) 이다. 때문에 세포 주기를 통해 일반적으로 발전 확대, CCE 다른 세포 주기 단계에 셀을 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포에이 기술을 적용. 최적의 조건에서 우수한 수익률에 g 1 단계 셀의 근본적으로 순수한 인구와 G2/M 단계에 있는 세포의 매우 풍부한 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 세포 인구를 항 암 제 약물의 행동의 공부 세포 주기-종속 메커니즘 및 다른 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다. 우리는 또한 어떻게 표준 절차 수 있습니다 수정 최적이 아닌 성능 결과 보여 하 고 기술의 한계를 논의. 응용 프로그램 및 다른 종류의 세포에 기술 탐구 상세한 방법론 제시 용이 해야.

기본 모든 셀 (3-4 × 108) 원심 elutriation 대상이 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 두 세척 분수와 20 메인 분수, 수집. 표 1 각 분수 해당 회전자 속도 있는 셀의 총 수 제시는 대표 데이터를 보여 줍니다. 전반적인 항복이 했다 일반적으로 80% 이상. 개별 분수에 셀 직경의 측정 확인 해당 셀 직경 elutriation (그림 2) 진출 증가. 이러한 결과 두 개의 독립적인 결정의 평균을 대표 하 고 데이터 재현성의 높은 학위를 반영. 분수 다음 propidium 요오드 화물 얼룩을 복종 되었다과 cytometry DNA 콘텐츠 (그림 3)를 결정 합니다. 초기 분수 (F1-f 5) G1 단계를 대표 하는 2N DNA 콘텐츠로 거의 독점적으로 셀을 포함. G 1 단계에서 S 단계 세포의 혼합물 중간 분수 (F6-F9)에서...

이 프로토콜의 다른 세포 주기 단계에 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포를 분리 하는 원심 elutriation 사용을 설명 합니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

이 절차의 전반적인 목표는 원심 용출을 사용하여 세포를 다른 세포 주기 단계로 분리하는 것입니다. 이 방법은 암 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포를 별도의 상으로 분리하기 때문에 항암 화합물의 상 의존적 영향에 대한 심문이 가능합니다.이 기술의 주요 장점은 화학적 섭동이 아닌 물리적 특성을 사용하여 세포를 특정 상으로 분리할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하려면 스트로브 어셈블리를 원심분리기에 설치하여 전원 코드가 왼쪽의 포트를 통해 챔버 밖으로 공급되도록 합니다. 스트로브 플래시 조정 lamp 원심분리기가 닫혀 있을 때 보기 창과 정렬되도록 합니다.각 브래킷 상단에 있는 두 개의 Phillips 헤드 나사를 조여 어셈블리를 제자리에 고정합니다. 그런 다음 브래킷 바닥에 있는 나비 나사를 조입니다. 전원 코드를 원심분리기 뒷면에 있는 스트로브 전원 포트에 꽂습니다.그런 다음 로터를 원심분리기 구동 허브에 똑바로 놓고 T 핸들 육각 렌치로 단단히 고정합니다. 그런 다음 용출 챔버, 평형기, 회전 씰 어셈블리 및 장착 플레이트가 포함된 어셈블리를 로터에 놓습니다. 로터의 볼트가 제자리에 고정될 때까지 한 손은 용출 챔버에, 다른 한 손은 균형판에 올려 놓고 균일하게 아래로 누릅니다.케이블의 한쪽 끝에 있는 핀을 회전 씰 어셈블리의 구멍에 넣습니다. 그리고 고정 케이블을 연결하기 위해 브래킷에 부착된 십자 머리 나사 중 하나로 다른 쪽 끝의 아이홀을 고정합니다. 흐름 시스템을 조립하고 용출 챔버 안팎으로 버퍼를 펌핑하려면 크기 16 튜브를 가변 속도 펌프에 연결하십시오.이 튜브의 한쪽 자유 끝을 원심분리기 챔버의 왼쪽 상단에 있는 포트를 통해 챔버로 들어가도록 삽입합니다. 이 튜브의 다른 쪽 끝에 피팅을 부착한 다음 피팅을 회전 씰 어셈블리의 입력 구멍에 삽입합니다. 마지막으로, 포트를 통해 출력 튜브를 삽입하여 회전 씰 어셈블리 상단의 이송 튜브에 부착합니다.용출 시스템이 조립되면 입력 튜브의 다른 쪽 끝을 500% 표백제로 채워진 500ml 병에 넣어 살균합니다. 그리고 출력 튜브를 빈 1리터 쓰레기통에 넣습니다. 그런 다음 펌프를 켜고 표백제가 폐기물 병으로 펌핑 될 때까지 용출 시스템을 통해 완전히 흐르도록합니다.이제 원심분리기를 켜고 기포와 배압을 방출하기 위해 지정된 최대 속도에 도달하도록 합니다. 설정 속도에 도달하면 원심분리기를 멈춥니다. 로터가 완전히 멈춘 후 뚜껑을 열고 챔버에 누출이 있는지 검사합니다.다음으로, 앞서 설명한 것과 유사한 방식으로 10분 동안 시스템을 통해 멸균수를 흘려보냅니다. 물로 씻어낸 후 물통을 100ml의 용출 완충액으로 채워진 멸균 유리병으로 교체하십시오. 입력 튜브를 이 병에 넣어 맨 아래에 오도록 합니다.원심분리기를 시작하고 버퍼가 시스템을 통해 흐르도록 합니다. 물통 병이 거의 비워지고 물이 시스템에서 완전히 씻겨 나간 후 버퍼가 시스템을 통해 지속적으로 재활용되도록 폐기물 병의 출력 튜브를 저장소로 이동합니다. 마지막으로 스트로브 램프를 켜고 용출 손잡이를 맨 왼쪽으로 돌립니다.이제 용출 챔버가 명확하게 보이고 스트로브 라이트가 로터의 속도와 동기화되도록 손잡이를 오른쪽으로 천천히 돌려 보기 창을 조정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 샘플을 준비합니다. 재활용 용출 완충액이 들어 있는 저장 용기에 재현탁액을 추가합니다.세포가 시스템으로 들어가 용출 챔버 내에서 평형에 도달하도록 합니다. 모든 세포가 챔버에 유지되도록 하려면 유리 슬라이드에 용리액을 한 방울 떨어뜨려 현미경으로 관찰합니다. 샘플에 온전한 세포가 없는 경우 챔버에 머무름을 확인합니다.모든 세포가 챔버 안으로 들어가고 챔버의 가장 하얀 부분에서 세포와 평형을 포함하는 뚜렷한 경계가 보이면 분획을 수집하기 시작합니다. 출력 튜브를 W1이라고 표시된 미리 냉각된 50ml 원추형 튜브로 이동합니다. 이 튜브에 50ml의 용출 완충액을 모아 얼음에 보관하십시오. W1 분획을 수집한 직후 원심분리기 속도를 821G로 낮추고 출력 튜브를 W2라고 표시된 원추형 튜브로 이동하고 이 속도로 50밀리리터를 더 수집합니다.계속해서 속도를 변경하고 분수를 수집합니다. 저장 탱크에 매체가 있는지 확인하고 수집된 분획은 항상 얼음에 보관하십시오. 모든 분획을 채취한 후 원심분리기를 중지하고 stop이라고 표시된 원뿔형 튜브에 50ml를 모읍니다.각 분획에서 수집된 펠렛 세포, 그리고 필요에 따라 유세포 분석 또는 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 다운스트림 분석을 사용합니다. 연속적인 용출 분획(elutriation segments)에서 세포의 평균 직경을 표시하는 선 그래프가 표시됩니다. 세포 직경이 클수록 용리되는 분수 수가 높아집니다.형광 활성화 세포 분류 분석 결과는 20개의 용출 분획 각각에 있는 세포의 DNA 함량을 보여줍니다. 초기 분획 F1 내지 F5는 G1 단계의 세포를 나타내는 2N DNA 함량을 가진 세포를 거의 독점적으로 포함합니다. G1 및 S 상에서 세포의 혼합물은 중간 분획 F6 내지 F9에서 보였다. 그리고 G2에서 M까지의 세포를 나타내는 4N DNA 함량을 가진 세포는 F10에서 시작하여 관찰되었습니다.여기에 표시된 것은 G1 단계 및 G2에서 M 단계에 있는 세포의 풀링된 분획에서 세포주기 관련 단백질의 수준을 조사한 웨스턴 블롯 결과입니다. G2에서 M Pool은 예상대로 G1 Pool에 비해 Phospho-Rb 및 Cyclin B 1 수치가 더 높았습니다. Cyclin D 하나의 신호는 약했지만 그럼에도 불구하고 G1 풀에서 감지할 수 있었고 G2에서 M 풀에서는 감지할 수 없었습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시간을 할애하고 용출 시스템이 제대로 조립되었는지, 모든 재료와 용액이 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 이어, 치료 화합물이 세포주기 의존적 방식으로 어떻게 작용할 수 있는지 조사하기 위해 세포주기 분석, 세포 생존력 분석 및 면역블롯과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 3개의 백혈병 세포 하위 집단, 즉 배지에서 자유롭게 떠다니는 부유 백혈병 세포, 중간엽 기질 세포 단층의 표면에 부착된 위상 밝은 백혈병 세포, 2D 공동 배양에서 중간엽 기질 세포 단층 아래로 이동한 위상 희미한 백혈병 세포의 공간 분리 방법을 설명합니다.

Leukemic Subpopulation Harvest: 2D 공동 배양에서 백혈병 세포 하위 집단의 공간적 분리 방법

이 비디오는 말초 혈액에서 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 인간 환자의 혈액 샘플에서 CLL 세포를 분리하여 핵 및 세포질 분획을 효율적으로 생성할 수 있습니다.

밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

이 비디오는 백혈병 세포에서 세포 및 핵 분획을 생성하는 방법인 백혈병 세포에서 세포 내 분획을 준비하는 방법을 설명합니다. 핵 및 세포질 분획은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

백혈병 세포에서 Subcellular Fractions의 준비: 백혈병 세포에서 세포 및 핵 분획을 생성하는 방법

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

호중구는 백혈구 중 가장 풍부한 유형입니다. 밀도 구배 분리 방법에 의한 인간 혈액에서 호중구의 분리 및 과립구 경로를 따른 인간 전골수구(HL60) 세포의 분화가 여기에 설명되어 있습니다. 항림프종제에 대한 림프종 세포의 민감도에 대한 역할을 테스트합니다.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

이 프로토콜은 1 차적인 만성 림프구성 백혈병 세포에서 핵 및 세포질 분획의 최적화 그리고 연속적인 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 견본은 세포 자극 및 약 처리에 핵과 세포질 구획 사이에서 일어나는 단백질 인신 매매에 있는 단백질 현지화 그리고 변경을 결정하기 위하여 이용됩니다.

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.

오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

이 프로토콜은 유도 화학 요법에 대한 반응의 역학을 기반으로 급성 림프구성 백혈병의 재발을 생성하기 위한 마우스 모델을 설명하는 것을 목표로 합니다.

급성 림프구성 백혈병에 대한 유도 화학 요법에 대한 백혈병 재발의 쥐 모델

배우세요 원심 엘루트리에이션을 사용하여 급성 림프구성 백혈병 세포를 세포 주기 단계별로 분리하는 방법을. 이 기술은 항암 화합물의 세포 주기 의존적 효과를 연구하는 데 활용됩니다.

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

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