체세포 분열의 라이브 세포 이미징

미토시스는 세포 주기 동안 발생하는 핵 내용의 고도로 조직되고 통제된 분열이다. 미토시스는 적절한 유기체 발달과 조직 성장, 유지 보수 및 수리에 근본적으로 중요합니다. 이 과정의 중단은 암과 같은 특정 질병에 표시되었습니다. 시간 경과 형광 현미경 검사를 통한 살아있는 세포 화상 진찰은 실험실에서 미토시스를 공부하는 일반적인 방법 의 한개입니다 오늘 실험실에 있는.

이 비디오에서는 미토시스의 단계를 간략하게 소개한 다음이 세포 과정의 살아있는 세포 이미징에 대한 실험적 고려 사항에 대해 논의 할 것입니다. 자세한 데이터 수집 및 분석 프로토콜이 표시되며 이 기술의 몇 가지 응용 프로그램으로 마무리됩니다.

과학자들이 이 이미징 실험에서 무엇을 찾고 있는지 더 잘 이해하기 위해 먼저 미토시스 단계를 살펴보겠습니다.

세포 주기는 세포 성장 및 분열의 전반적인 과정을 기술합니다. 미토틱 단계는 이 주기의 1개의 짧은 부분을 나타내며, 이는 즉 프로페이즈, 프로메타페이즈, 메타페이드, 상이상, 통신상 및 사이토카네시스의 6단계로 더 세분화될 수 있습니다.

prophase 도중, DNA는 자매 크로마티드로 응축된 백중계에 합류했습니다. 세포질에서, 센트로솜이라고 칭성이라고 칭호로 불린 2개의 중요한 세포기관은 일반적으로 스핀들 섬유로 알려져 있는 microtubule 구조물을 조립하기 시작합니다 - 바퀴 같이 패턴으로.

다음 단계인 prometaphase는 핵막의 붕괴와 키네토초르로 알려진 복잡한 단백질의 조립을 백프로메펠레에서 봅니다. 이 단계는 또한 척추 섬유와 운동 장모의 연관성을 목격합니다.

메타 단계에서 염색체는 두 백중항에서 멀리 떨어진 가상의 비행기인 메타위상 플레이트에 줄을 서 있습니다. 해부학 도중, 염색체는 세포의 반대 쪽 끝으로 이동하는 개별 자매 염색체와 함께, 센트로메어에서 "분해". 텔로 단계에서, 미토틱 스핀들 분해 및 염색체가 축하되기 시작합니다. 마지막으로, 사이토카네시스 동안 - "분열 고랑"을 형성하는 액틴 / myosin 반지의 수축을 통해 - 부모 세포는 두 딸 세포로 분할.

미토틱 진행에 대한 이러한 이해를 통해 라이브 세포 이미징을 사용하여 이 프로세스를 보기 위한 실용적인 고려 사항을 살펴보겠습니다.

가장 먼저 질문하는 질문은 미토시스를 시각화하기 위해 세포에 라벨을 붙이는 방법입니다. 이 실험에 가장 일반적으로 사용되는 "태그"는 한 파장에서 빛을 흡수하고 다른 파장에서 빛을 방출하는 형광 분자입니다.

핵산을 표지하기 위해 Hoechst와 같은 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용할 수 있습니다. 마이크로 투부와 같은 단백질을 라벨링하기 위해 형광 태그 항체를 사용할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 막 불투과성이고, 그러므로 미세 주입 기술은 견본에 삽입하기 위하여 이용됩니다.

또 다른 전략은 세포가 염색체와 같은 미토시스에 적극적으로 관여하는 성분을 라벨링하는 형광 태그 단백질을 표현하기 위해 세포를 조작할 수 있는 유전 라벨링입니다. 형광 분자로 작업 할 때, 당신은 광표백을 피하기 위해 빛에 과도한 노출을 피해야합니다.

올바른 현미경을 선택하는 것은 똑같이 중요한 결정입니다. 가장 일반적으로 사용되는 두 현미경은 epifluorescent 및 공초점입니다. 상피형 또는 넓은 필드 현미경 검사는 전체 시야에서 빛을 전달하며, 공초점 현미경 검사는 레이저를 사용하여 단일 지점에 빛을 집중시킵니다.

상피 성 현미경은 일반적으로 저렴하지만, 공초점 현미경은 점 조명이 증가 된 광학 해상도를 제공하므로 더 선명한 이미지를 생성하는 것이 좋습니다. 조명의 단일 점은 또한 광독성을 감소, 또는 빛에 과도 한 노출에 의해 발생 하는 세포 죽음 증가.

이제 몇 가지 실험적인 고려 사항을 검토했기 때문에 미토시스를 시각화하기 위한 라이브 세포 이미징 실험을 실행하는 방법을 살펴보겠습니다.

세포는 유리 바닥 접시 또는 커버립에 배양되어야하며, 이는 미토시스의 최상의 시각화를 가능하게합니다. 다음으로 레이블이 수행될 때까지 제어된 환경에서 유지관리해야 합니다. 앞에서 언급했듯이 라벨링 기술의 선택은 손에 있는 실험에 달려 있습니다. 라벨링 후, 현미경에 전문화 접시를 전문 챔버에 놓는다. 이것은 세포 배양 조건이 화상 진찰 도중 유지될 수 있습니다.

다음으로, 표지 분자에 따라 현미경에 흥분 및 방출 파장을 설정합니다. 데이터 수집의 경우 이미지 캡처에 대한 설정 시간 점 및 위치입니다. 이러한 맥락에서 시간점은 모든 미토계 단계에 대한 완전한 시각적 커버리지를 제공하기 위해 이미지를 획득하는 인스턴스입니다. 위치는 문화 요리에 X-Y 좌표를 참조하십시오. 또한 각 위치에 대해 서로 다른 깊이에서 이미지를 수집할 수 있습니다. 각 이미지는 Z축의 광학 슬라이스를 나타냅니다. 따라서 집합적으로 Z 스택이라고 합니다. 모든 매개 변수를 입력 한 후 설정을 테스트 한 다음 앉아서 즐기십시오!

타임랩스 데이터를 획득한 경우 이를 제시하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 이러한 몇 가지 방법에 대해 살펴보겠습니다.

몽타주는 시간 경과 데이터를 제시하는 가장 일반적인 방법 중 하나이며, 여러 이미지가 시간에 따라 그리드와 같은 패턴으로 배열됩니다. 이들은 명확하게 미토Tic 진행을 보여줄 수 있고, 연구원이 개별 적인 미토틱 단계에서 보낸 시간과 같은 정보를 결정할 수 있습니다. 이러한 이미지를 순차적으로 결합하여 "영화"를 만드는 것이 보다 역동적인 프레젠테이션이 될 수 있습니다.

마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 얻은 Z-스택을 결합하여 샘플의 3D 레크리에이션을 제시할 수 있다. 이것은 정확하게 미토틱 기계의 조각 사이 공간 관계를 드러낼 수 있습니다. 이는 2D에서 서로 나란히 보이는 구성 요소가 실제로 3차원에서 멀리 떨어져 있을 수 있기 때문에 중요합니다.

이제 라이브 셀 이미징 실험을 실행하는 방법을 알고 있으므로 이 기술의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

미토시스는 개발의 필수적인 부분입니다. 여기에서, 연구원은 신경 전구 세포에 있는 미토시스를 관찰하기 위하여 배아 마우스 두뇌를 격리했습니다. 이 세포의 통제된 분열은 적당한 두뇌 성장 및 기능에 중요합니다. 고립 후 뇌는 진동을 사용하여 단면화되었고, 막 투과성 핵산 결합 염료로 염색하고, 공초점 현미경 검사를 통해 이미지하여 신경 전구 세포의 미토시스를 명확하게 시각화하였다.

DNA 복구는 세포 성장 및 분열에 관여하는 중요한 세포 과정입니다. 이 실험에서, 연구원은 DNA 손상에 응하여 생성된 반점인 foci를 형성하는 DNA 복구 단백질을 공부했습니다. 살아있는 세포 화상 진찰 및 3D 분석의 결과는 세포 분열 과정 전반에 걸쳐 DNA 복구 단백질의 현지화를 강조했습니다.

마지막으로, 연구원은 분열이 계속되기 전에 세포 조건이 평가되는 "일시 정지" 점인 미토틱 체크포인트를 연구합니다. 미토시스에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 또는 SAC는 미토틱 스핀들과 염색체 사이의 적절한 연결을 보장합니다. 이를 연구하기 위해 과학자들은 SAC 유도 시약을 형질선 플라이 배아로 미세 주입하고 살아있는 세포 이미징을 사용하여 미토시스를 분석했습니다. 결과는 미토시스를 통해 진행하지 못하는 세포를 보여주는 체포된 운동장 초장을 보여줍니다.

당신은 미토시스의 라이브 세포 이미징에 JoVE의 비디오를 보았다. 미토시스 의 단계에 대한 소개에 따라,이 비디오는 라이브 세포 이미징에 대한 중요한 고려 사항과 데이터 분석 기술을 소개했습니다. 마지막으로 이 기술의 응용 프로그램이 제시되었습니다. 살아있는 세포 화상 진찰은 발달, 조직 유지 보수 및 질병과 관련있는 미토Tic 기계장치를 이해하는 과학자를 실질적으로 도왔습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!