4.3: 체세포 분열의 라이브 세포 이미징

유사분열(Mitosis)은 세포주기 동안 발생하는 핵 내용물의 고도로 조직화되고 통제된 분할입니다. 유사분열은 적절한 유기체 발달과 조직 성장, 유지 및 복구에 근본적으로 중요합니다. 이 과정의 중단은 암과 같은 특정 질병에서 나타났습니다. 타임 랩스 형광 현미경을 통한 라이브 셀 이미징은 오늘날 실험실에서 유사분열을 연구하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다.

이 비디오에서는 유사분열 단계를 간략하게 소개한 다음 이 세포 과정의 라이브 셀 이미징을 위한 실험적 고려 사항에 대해 논의합니다. 자세한 데이터 수집 및 분석 프로토콜이 표시되며이 기술의 몇 가지 응용 프로그램으로 마무리하겠습니다.

과학자들이 이러한 이미징 실험에서 찾고있는 것을 더 잘 이해하기 위해 먼저 유사 분열 단계를 살펴 보겠습니다.

세포주기는 세포의 성장과 분열의 전반적인 과정을 설명합니다. 유사분열 단계는 이 주기의 짧은 부분 중 하나를 나타내며, 이는 6개의 단계, 즉 전단계(prophase), 전성기(prometaphase), 중기(metaphase), 아나페이즈(anaphase), 텔로페이즈(telophase) 및 사이토키네시스(cytokinesis)로 더 나눌 수 있습니다.

전구기(prophase) 동안 DNA는 중심체에서 결합된 자매 염색분체로 응축됩니다. 세포질에서 중심솜(centrosome)이라고 하는 두 개의 주요 소기관은 일반적으로 방추 섬유(spindle fiber)로 알려진 미세소관 구조를 바퀴 모양의 패턴으로 조립하기 시작합니다.

다음 단계인 프로메타페이즈(prometaphase)는 핵막이 파괴되고 중심체에서 키네토코어(kinetochore)로 알려진 단백질 복합체가 조립되는 것을 봅니다. 이 단계는 또한 방추 섬유와 동체의 연결을 목격합니다.

중기(metaphase)에서 염색체는 두 중심체에서 등거리에 있는 가상의 평면인 중기판(metaphase plate)에 정렬합니다. 아나페이즈(anaphase) 동안, 염색체는 "분리된다"? 중심체에서 개별 자매 염색체가 세포의 반대쪽 끝으로 이동합니다. 텔로 페이즈에서 유사 분열 방추체가 분해되고 염색질이 응축되기 시작합니다. 마지막으로, "분열 고랑"을 형성하는 actin/myosin 고리의 수축을 통한 cytokinesis? 부모 세포는 두 개의 딸 세포로 분열합니다.

유사분열 진행에 대한 이러한 이해를 바탕으로 라이브 셀 이미징을 사용하여 이 과정을 보기 위한 실용적인 고려 사항을 살펴보겠습니다.

첫 번째 질문은 유사 분열을 시각화하기 위해 세포에 레이블을 지정하는 방법입니다. 가장 일반적으로 사용되는 ?태그? 이 실험을 위해 한 파장의 빛을 흡수하고 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 분자가 있습니다.

핵산을 라벨링하기 위해 Hoechst와 같은 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용할 수 있습니다. 미세소관과 같은 단백질을 표지하기 위해 형광 표지된 항체를 사용할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 멤브레인 불침투성이므로 샘플에 삽입하기 위해 미세 주입 기술이 사용됩니다.

또 다른 전략은 유전자 라벨링(genetic labeling)으로, 염색체와 같이 유사분열에 활발하게 관여하는 구성 요소를 라벨링하는 형광 표지 단백질을 발현하도록 세포를 조작할 수 있습니다. 형광 분자로 작업할 때는 광표백을 피하기 위해 빛에 과도하게 노출되는 것을 피해야 합니다.

올바른 현미경을 선택하는 것도 마찬가지로 중요한 결정입니다. 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 현미경은 에피 형광등과 컨포칼입니다. 에피 형광 또는 광시야 현미경 검사는 전체 시야에 빛을 전달하는 반면, 컨포칼 현미경 검사는 레이저를 사용하여 단일 지점에 빛을 집중시킵니다.

에피 형광 현미경은 일반적으로 더 저렴하지만, 포인트 조명이 향상된 광학 해상도를 제공하여 더 선명한 이미지를 생성하기 때문에 컨포칼 현미경이 선호됩니다. 또한 단일 조명 지점은 광독성 또는 빛에 대한 과도한 노출로 인한 세포 사멸 증가를 줄입니다.

이제 몇 가지 실험적 고려 사항을 검토했으므로 유사분열을 시각화하기 위해 라이브 셀 이미징 실험을 실행하는 방법을 살펴보겠습니다.

세포는 유리 바닥 접시 또는 커버 슬립에서 배양해야 하며, 이는 유사 분열을 가장 잘 시각화 할 수 있습니다. 다음으로, 라벨링이 수행될 때까지 통제된 환경에서 유지해야 합니다. 앞서 언급했듯이 라벨링 기술의 선택은 현재 진행 중인 실험에 따라 다릅니다. 라벨링 후 세포 배양 접시를 현미경의 특수 챔버에 놓습니다. 이를 통해 이미징 중에 세포 배양 상태를 유지할 수 있습니다.

다음으로, 라벨링 분자에 따라 현미경에서 excitation 및 emission 파장을 설정합니다. 데이터 수집의 경우 이미지 캡처를 위한 시점과 위치를 설정합니다. 이러한 맥락에서 시점은 모든 유사분열 단계에 대한 완전한 시각적 범위를 제공하기 위해 이미지를 획득하는 경우입니다. 위치는 배양 접시의 X-Y 좌표를 나타냅니다. 또한 각 위치에 대해 서로 다른 피사계 심도에서 이미지를 획득할 수 있습니다. 각 이미지는 Z축의 광학 슬라이스를 나타냅니다. 따라서 이를 통칭하여 Z-스택이라고 합니다. 모든 매개변수를 입력한 후 설정을 테스트한 다음 편안히 앉아서 즐기십시오!

타임랩스 데이터를 획득하면 여러 가지 방법으로 표시할 수 있습니다. 이러한 방법 중 몇 가지에 대해 논의해 보겠습니다.

몽타주는 타임랩스 데이터를 표시하는 가장 일반적인 방법 중 하나이며, 여러 이미지가 시간에 따라 그리드와 같은 패턴으로 배열됩니다. 이는 유사분열 진행을 명확하게 보여줄 수 있으며 연구자가 개별 유사분열 단계에서 보낸 시간과 같은 정보를 결정할 수 있도록 합니다. 이 이미지들을 순차적으로 결합하여 "영화"를 만든다. 보다 역동적인 프레젠테이션이 될 수 있습니다.

마지막으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 얻은 Z-스택을 결합하여 샘플의 3D 재현을 제시할 수 있습니다. 이것은 유사 분열 기계 조각 사이의 공간적 관계를 정확하게 나타낼 수 있습니다. 2D에서 서로 옆으로 보이는 구성 요소가 실제로는 3차원에서 멀리 떨어져 있을 수 있기 때문에 이는 중요합니다.

이제 살아있는 세포 이미징 실험을 실행하는 방법을 알았으므로 이 기술의 몇 가지 응용 프로그램을 검토해 보겠습니다.

유사분열은 발달의 필수적인 부분입니다. 여기에서 연구자들은 신경 전구 세포의 유사분열을 관찰하기 위해 배아 쥐의 뇌를 분리했습니다. 이러한 세포의 통제된 분열은 적절한 뇌 성장과 기능에 매우 중요합니다. 분리 후, 비브라톰을 사용하여 뇌를 절편화하고, 막 투과성 핵산 결합 염료로 염색하고, 컨포칼 현미경을 통해 이미지화하여 신경 전구 세포의 유사분열을 명확하게 시각화했습니다.

DNA 복구는 세포 성장과 분열에 관여하는 중요한 세포 과정입니다. 이 실험에서 연구자들은 DNA 손상에 대한 반응으로 생성된 반점인 병소를 형성하는 DNA 복구 단백질을 연구했습니다. 살아있는 세포 이미징 및 3D 분석 결과는 세포 분열 과정 전반에 걸쳐 DNA 복구 단백질의 국소화를 강조했습니다.

마지막으로, 연구자들은 "일시 중지"인 유사 분열 체크포인트를 연구합니다. 분열이 계속되기 전에 세포 상태를 평가하는 지점. 유사분열에서 방추체 조립 체크포인트 또는 SAC는 유사분열 방추체와 염색체 사이의 적절한 연결을 보장합니다. 이를 연구하기 위해 과학자들은 형질전환 파리 배아에 SAC 유도 시약을 미세주입하고 살아있는 세포 이미징을 사용하여 유사분열을 분석했습니다. 결과는 정지된 키네토코레(kinetochores)를 보여주며, 유사분열을 통해 진행하지 못하는 세포를 보여줍니다.

당신은 방금 유사 분열의 살아있는 세포 이미징에 대한 JoVE의 비디오를 보았습니다. 유사분열 단계에 대한 소개에 이어 이 비디오는 라이브 셀 이미징을 위한 중요한 고려 사항과 데이터 분석 기술을 소개했습니다. 마지막으로, 이 기술의 응용이 제시되었습니다. 라이브 셀 이미징은 과학자들이 발달, 조직 유지 및 질병과 관련된 유사 분열 메커니즘을 이해하는 데 상당한 도움이 되었습니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!