Name: 살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 SOD1 돌연변이 단백질 집계를 정량화하는 고콘텐츠 분석법을 HEK-293 세포를 이용하여. 이 방법은 신경퇴행성 질환 연구와 소분자 스크리닝에 활용됩니다.

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이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642), 한국 국가 연구 재단 (NRF) 개별 과학자 지원 프로그램 (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239)에 의해 투자 된 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. lentivirus 생산 참고: 생산과 lentiviral 벡터의 조작 재조합 관련 된 연구를 위한 국가 학회 (NIH) 지침에 따라 실시 DNA입니다. 플라스 미드는 야생 형 및 A4V 돌연변이 체 SOD1 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V YFP) 향상 된 YFP 태그로 인코딩 김 외에 설명 되어 있습니다. 11 두 유전자 융합 제품 PCR 뇌관 쌍 5를 사용 하 여 증폭 했다 &#8242;-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3 &#8242; 5 &#8242;-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 &#8242; pTRIP 델타 U3 CMV에 삽입 플라스 미드 19 XhoI 및 BsrGI 금지 사이트를 사용 하 여. 이전 실험에서 HEK 293T 세포는 매 2 일 1:6 1: 4의 비율로 분할 했다. 20 개 이상의 통로 적은 60 %confluency 하는 데 도움이 좋은 transfection 효율 보장에서 세포의 유지 보수의 회피.
<ol><li>에 1 일, 바이러스 생산을 위한 세포 배양 매체 (10 %FBS 4 m L-글루타민 m 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 10 cm 직경 조직 문화 접시 (3 x 10 6 셀/접시)에 30-40% 합류에서 HEK 293T 세포 분할.</li>
	<li>유지 10 cm 직경 조직 문화는 CO 2 배양 기 (37 ° C, 5% CO 2)에서 하룻밤 접시.</li>
	<li>주 2에 준비 lentiviral 벡터 10 µ g를 포함 하는 DNA transfection 솔루션 (pTRIP-델타 U3 CMV-SOD1WT-YFP 또는-SOD1A4V-YFP)는 lentiviral 함께 플라스 미드 (5 µ g의 pVSVg, pCMV dR8.71의 10 µ g) (포장 그림 2A) 20. 1 M CaCl 2 125 µ L을 추가 하 고 증류수를 사용 하 여 500 µ L에 양을 맞추십시오. 부드럽게 혼합물에 0.05 M HEPES의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>바꾸기 HEK 293T 세포 10 mL가 미리 데워 진 신선한 문화 매체 항생제 무료 매체 1 mL DNA transfection 솔루션 혼합 하 고 37 ° C, 5% CO 2에서 밤새 품 어.</li>
	<li>3 일에서 신선한 문화 매체와 셀 표면에 뜨는 바꿉니다.</li>
	<li>에 4 일, 수확 15 mL 튜브와 죽은 세포와 파편 제거 하 x 500g에 5 분 동안 원심 분리기에 상쾌한. 더 큰 60 mL 주사기를 사용 하 여 0.45 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여는 상쾌한 정화. 즉시 단일 사용 aliquots (300 µ L)으로 분배 하 고-80 ° c.에 저장 최대 제품 활동을 유지 하기 위해 피하 동결-해 동 주기.</li>
</ol> 2. Lentiviral 변환 <ol><li>분할 셀 라인 60% 합류에 감염 (HEK 293 세포와 SH-SY5Y; 잘 당 5 x 10 5 셀 및 U2OS; 잘 당 1 x 10 5 셀) 보충 DMEM 미디어의 2 mL에는 6 잘 조직 문화 접시 10 %FBS.</li>
	<li>6 잘 조직 배양 플레이트 37 ° C 배양 기에서 5% CO 2에서 하룻밤 유지.</li>
	<li>-80 ° C 냉장고에서 냉동된 lentivirus를 제거 하 고 각 사용 하기 전에 얼음에 약 수를 녹여; refreeze 하지.</li>
	<li>동안 바이러스 녹고 따뜻한 세포 배양 포함 하는 혈 청의 셀 라인와 호환. 일단 바이러스가 완전히 해 동 준비 희석의 범위 (1:3, 1:10, 1:30, 그리고 1: 100) 1.5 mL 신선한 microfuge 관에서 DMEM에.</li>
	<li>감소 된 혈 청 매체 1 ml 튜브에 볼륨을 키울.</li>
	<li>바이러스/미디어의 1 ml (4 µ g / µ L의 재고)에서 Polybrene의 추가 2 µ L. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 셀에 혼합물의 1 mL를 추가 합니다. 24 헤에 대 한 바이러스 세포를 품 어</li>
	<li>바이러스 미디어를 제거 하 고 정상적인 DMEM 미디어 10% 보충 바꿉니다 FBS. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀 유지.</li>
	<li>셀의 성장 모니터링 하 고 변경 문화 미디어 매 2 일. 에 합류, 10 cm 직경 조직 문화 접시로 6-잘 접시 확장.</li>
	<li>일단 셀 충분히 확장 되었으며, 384-잘 분석 결과 접시는 YFP 식 수준 확인 하기에 DMEM 미디어의 50 µ L에 잘 당 씨 1.5 x 10 4 셀 현미경 검사 법에 의해 단백질을 태그. 신호 대 잡음 비율 표시는 YFP 태그 단백질 셀 식 &#8805; 3, 해당 셀 라인 셀 재고 준비.</li>
</ol> 3. 시간 프로테아좀 억제제의 단백질 집계에 종속 효과 참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행 (자료 참조).
<ol><li>특 면 100 %DMSO (ALLN, 2 mM)에 녹아 있는 384-잘 플랫 바닥 접시에 DMSO 또는 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L.</li>
	<li>DMEM의 50 µ L에 잘 당 수동으로 씨 1.5 x 10 4 셀 미디어 같은에 시험 접시. 프로테아좀 억제제 (ALLN) 최종 농도 10 µ M 이어야 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO 2 현미경 시스템 환경 제어 장치를 설정합니다. 실험적인 체제의 화면 그림 3에 표시 됩니다.</li>
	<li>운영 소프트웨어를 사용 하 여 다음 설정을 가진 넓은 필드 형광 모드로 현미경: 시간 캡처 간격 목표, 비 confocal 모드, 4 필드/글쎄, LWD 20. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.</li>
</ol> 4. 시간 경과 영상 살아있는 세포에 YFP 식에 대 한 및 이미지 분석 (단일 채널) 참고: 다음 단계에서는 응용 프로그램 (예를 들어, 콜럼버스) 소프트웨어의 설명.
기본 개체 (cytosol 및 집계) 세그먼트 <ol><li>선택 적절 한 알고리즘입니다. 필요한 경우 조정 배경 임계값 및 대비 매개 변수 ( 그림 4).</li>
	<li>계산 셀을 사용 하 여 &#39; 셀을 찾을 &#39; 0.1 YFP 강도 채널에 대 한 개별 임계값. 집계를 사용 하 여 결정 한 &#39; 장소를 찾을 &#39; 상대 YFP 자리 강도 알고리즘 &#62; 0.2와 1.0의 분할 계수.</li>
</ol> 5. 복용량 응답의 효과 프로테아좀 억제제 단백질 집계에 살아있는 세포의 핵 (2 채널)에 대 한 스테인드 참고: 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지 수집을 수행. 최적의 곡선 적합 되도록 예상된 IC 50 값에 따라 프로테아좀 억제제 (ALLN, Epoxomicin, 및 MG132)의 농도 범위 결정.
384 잘 저장 폴 리 프로필 렌에 화합물의 <ol><li>준비 직렬 희석 1:3 희석 시리즈 표준 접시. 복합 희석 혼합 확인 잘 되도록 화합물 농도 정확.</li>
	<li>빈 플랫-하단 검은 384-잘 시험 접시에 프로테아좀 억제제의 0.25 µ L 분배. 384-모 세관 머리 볼륨을 전송할 수를 갖춘 액체 처리기 사용.</li>
	50에 잘 당 10 4 셀 x <li>씨 1.5 µ L DMEM 미디어의 분석 결과 접시에. 분석 결과 접시 24 h. 위해 37 ° C, 5% CO 2를 품 어</li>
	<li>솔루션 (10 mg/mL의 재고에 Hoechst 33342) 얼룩과 DMEM 미디어 (37 ° C에서 미리 예 열)의 10 µ L을 추가 하 고 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
	<li>발사는 마이크로운영 소프트웨어 대처. 실험 설정의 화면 캡처는 그림 6에 표시 됩니다. 선택은 &#34; 구성 &#34; 탭 하 고 객관적이 고 정확한 판형 X 20을 선택 합니다. 확인 &#34; 칼라 &#34; 다른 접시 종류와 적절 한 초점을 수 있도록 하는 목적에 올바른 값으로 설정 됩니다.</li>
	<li>선택은 &#34; 현미경 &#34; 탭 정의 노출 YFP로 1 (488 레이저) 및 노출 2 Hoechst (405 레이저). 모두 노출에 필터를 활성화 하 고 카메라 1 카메라 2 노출 2 노출 1을 할당 합니다. 노출 1 ~ 800 ms 노출 시간 설정 노출 2 ~ 40 ms.</li>
	<li>선택 노출 1입니다. 0 µ m. 선택 초점 높이 설정 &#34; 초점 &#34;. 일단 초점, 노출 카메라 1. 최적화 노출 평면을 클릭 초점 높이 조정 &#34; 높이 걸릴 &#34;. 노출 시간을 변경 하 고 ~ 3, 000의 최대 픽셀 강도 게 전원 레이저. 노출 매개 변수를 저장 합니다. 반복 노출 2.</li>
	<li>선택 &#34; 실험 정의 &#34; 탭 만들기 레이아웃 및 sublayout. 드래그 앤 드롭 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, skewcrop 파일 및 sublayout. 실험 저장.</li>
	<li>선택 &#34; 자동 실험 &#34; 탭 및 이미지. 각 실행의 끝에, 캡처된 이미지는 서버에 자동으로 업로드 한다.</li>
</ol> 6. 두 이미지의 분석 이미지 <ol><li>세그먼트는 기본 개체 (핵, cytosol, 및 집계) 소프트웨어 알고리즘을 선택 합니다 ( 그림 7).</li>
	<li>세그먼트 개체의 검사에 의해 정확 하 게 핵을 세그먼트 방법을 선택 합니다. Hoechst 스테인드 개체 1 채널에서 (Ch1) 셀의 수를 결정 하기 위해 사용 됩니다. 돌연변이 체 SOD1-채널 2 (Ch2) A4V의 양을 결정 하는 데 사용 됩니다에서 YFP 얼룩.</li>
	<li>계산 셀을 사용 하는 &#39; 핵을 찾을 &#39; 알고리즘 Hoechst 얼룩 영역으로 &#62; 20 µ m 2, 7.0, 0.40, 그리고 대조의 개별 임계값의 분할 계수와 &#62; 0.10.</li>
	<li>데이터 테이블을 만들고 사용 하 여 화합물의 각각에 대 한 EC 50를 결정는 &#39; 비 선형 회귀 &#39; 방정식 그래프 소프트웨어에서.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

안정적인 세포를 생성 하기 위한 두 가지 주요 방법 있다. 처음 몇 주를 소요 하며 게놈 통합된 플라스 미드 DNA 벡터의 과도 transfection 및 저항 선택. 두 번째는 제한 노력으로 여러 셀 라인에서이 프로토콜을 대상 단백질의 효과적인 표현 의무가 만들기 lentivirus, 사용 시간의 문제를 걸립니다. 여행-CMV 벡터19 지속적인된 벡터 보존된 변환 효율과 안정적인 transgene 식 사용 했다. 놀랍게도, 생성 된 3 셀 라인 과도 식에 따라 실험 프로토콜 달리, SOD1 돌연변이의 아무 표시 집계 설명 이전11보였다. 그것은 시간의 상대적으로 짧은 기간에 높은 단백질 식 생산으로 일시적인 식 단백질 집계를 선호입니다. 일시적인 transfection 시 단백질의 대부분을 저하, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 저하 집계 하기 쉬운 단백질을 완벽 하 게 활용 되는 포화 지점에 도달 합니다. 그러나, 우리는 안정적인 라인 더 단백질...

단백질 집계는 생물학 과정을 단백질 그룹을 misfolded 및 신경 퇴행 성 질환 (amyloidosis)에 원인이 되는 에이전트 역할을 할 수는 있습니다. 단백질 집계 특성화 촉진은 병의 발병에 영향을 주는 새로운 요인의 발견에서 세포 장애 뿐만 집계의 역할 이해에 필수적 이다. 살아있는 세포에 형광 태그 단백질의 시각화 높은 콘텐츠 심사 (HCS)1,2,,34에 적용 가능한 분석 실험의 개발에 도움이 수 있는 강력한 방법입니다.
루 경화 증 (ALS) 집계 가족 ALS (fALS)에 산발적 ALS (염)5,6 모터 신경에서 축적 하는 성향으로 misfolded 단백질의 존재로 인 한 proteopathic 질병으로 간주 됩니다. . FALS 경우의 ~ 20%의 하위 집합 관련 된 인코딩 cytosolic 항 산화 효소 유전자에 지배적인 돌연변이와 구리-아연 superoxide dismutase 입력 1 (SOD1)7,8. SOD1 변형, 탈 선 안정성, 증가 전개 속도, 집계9, 성향 등의 기능과 구조에 변화를 포함 하 여이 유전자 파생된 전에 대 한 몇 가지 잠재적인 원인 제안 되었습니다. 10. 특히, 두 ALS 연결 된 SOD1 이체에 의해 공유 하는 유일한 확인 하 고 잠재적으로 유독한 속성 이며 야생-타입 (WT) SOD1 compartmentalized 단백질 집계 또는 배치할 포함11,12 형태로 증가 성향 . Misfolded 돌연변이 체 SOD1, 지속적으로 polyubiquitinated 이며, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 타락. 그 결과, 프로테아좀의 활동의 억제의 저수준 SOD1 집계13,14, 수용 성 돌연변이 체 SOD1와 교환할 수 있는 수용 성 구성 요소 형태로 비정 질 구조를 구성 하는 돌연변이의 축적에 리드 cytosol15. 특히, SOD1 돌연변이 A4V에서 (알라닌 codon 4에서 valine 변경) 가장 일반적인 ALS를 일으키는 돌연변이 이며 2 년 미만 질병 발병16후의 평균 생존 시간 빠른 neurodegeneration을 리드. 화학적, SOD1 A4V monomerize, 집계, 녹말 체 모;를 형성 하는 증가 경향이 있다 그것의 기 공 같은 집계 다른 질병에 연결 된 돌연변이 형태, α-synuclein와 β 아 밀 로이드 단백질17등의 녹말 체 모와 비슷합니다. SOD1 집계 축적의 역학 연구, 가용성과 불용 성 SOD1 집계 형태를 모니터링 하기 위한 방법 개발 유지.
우리는 이전, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 및 HEK 293 세포 형광 단백질 태그 SOD1, ALS 관련 돌연변이 SOD1 이합체 화 및 집계11손상으로 뚜렷이 페. 과도 식 시스템 단기 유전자 overexpression의 생물 학적 결과 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다, 방법 원하는 유전자의 안정적인 통합을 제공 하는 분석 결과 개발에 대 한 선호 있을 수 있습니다. 따라서, lentiviral 벡터 포유류 세포 18에 장기 및 규제 유전자 발현을 부여 하는 기능을 제공 합니다. 이 연구에서 우리가 재조합 lentivirus WT 베어링으로 불리고 안정적인 셀 라인의 세대에 집중 하 고 돌연변이 체 SOD1 태그 노란 형광 성 단백질 (YFP)와. 라이브 셀 이미징 현미경 SOD1 집계의 자동화 된 정량화에 사용 하 여, 우리는 실행 하 고 SOD1 집계 이벤트는 프로테아좀의 억제 시 계량.

<table><tbody><tr><td>ALLN (C20H37N3O4)</td><td>Millipore</td><td>208719</td><td></td></tr><tr><td>MG132 (C26H41N3O5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>에폭소마이신(C 28H50N4O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3652</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Opera EvoShell 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 1.8.1</td><td></td></tr><tr><td>Operetta</td><td>Perkin Elmer</td><td>OPRT1288</td><td></td></tr><tr><td>Harmony 이미징 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 3.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Columbus 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.3.2</td><td></td></tr><tr><td>CyBi Hummingwell 액체 처리</td><td>CyBio AG</td><td>OL 3387 3 0110</td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 세포에 sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

루 경화 증 (ALS) 유전자 인코딩 구리-아연 superoxide dismutase 1 (SOD1)에서 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있는 치명적인 신경 질환 이다. SOD1의 구조적 불안정 및 가족 ALS 환자에 SOD1 긍정적인 포함 검색 misfolded 또는 집계 SOD1 ALS 병 리에 대 한 잠재적인 원인 역할을 지원합니다. 이 연구에서 우리는 높은 콘텐츠 접근을 차단 하 여 살아있는 세포에 SOD1 집계의 역학을 계량 하도록 세포 기반 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 안정적인 셀 라인 표현 야생-타입 및 돌연변이 A4V SOD1 태그로 노란 형광 성 단백질 및 두 단백질 집단의 흔적 없이 cytosol에 표현 되었다 발견 lentiviral 벡터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 흥미롭게도,만 SOD1 A4V HEK 293 안정적으로 표현 하지만 하지 U2OS 또는 SH SY5Y 셀 라인에 프로테아좀 억제제 처리 시 집계를 형성 했다. 우리는 다양 한 프로테아좀 억제제의 복용량 응답 분석을 기반으로 집계를 계량 하 고 시간 경과 현미경 검사 법에 의해 집계 형성 속도 론을 추적 가능 하다는 것을 보여줍니다. 우리의 접근 ALS 돌연변이의 역할에 SOD1 집계 형성에 효과 측정 SOD1 A4V 집계를 방지 하는 작은 분자에 대 한 심사의 가능성을 소개 합니다.

Lentivirus를 사용 하 여 생성 안정적인 셀 라인: SOD1 단백질 집계 모니터링에 대 한 전반적인 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 첫 번째 단계에서 셀 라인 (1 단계)에 SOD1 안정적인 유전자 배달에 대 한 식 lentiviral 벡터를 생성 했습니다. 인코딩 SOD1 WT YFP 태그 및 SOD1 A4V 두 lentiviral 벡터 (SOD1WT-YFP 및 SOD1A4V-YFP, 각각) 포장 및 봉투 플라스 미드 (그림 2A)을 준비 했다. Lentiviral 변환 (단계 2) 셀에 선 테스트 (HEK 293, U2OS, 및 SH-SY5Y) 남아 있었다 (그림 2B), 건강, 보였다 높은 식 수준 및 장기 YFP 라벨 SOD1 형태에 관계 없이. 흥미롭게도, WT도 ...

계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

이 실험의 전반적인 목표는 시간과 용량에 따라 잘못 접힌 단백질의 응집을 조절하는 데 있어 작은 분자의 효과를 연구하기 위한 분석을 개발하는 것입니다. 이 방법은 세포 분석 개발을 위한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 high-content 스크리닝 기술에 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 신경 퇴행성 질환에서 발생하는 단백질 응집을 감지하고 정량화하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다.이 기술의 의미는 ALS와 같은 신경 퇴행성 질환의 잠재적 치료법으로 확장되는데, 이는 세포 분석을 개발하고 소분자 조절제에 대한 스크리닝을 수행할 수 있는 간단한 방법을 제안하기 때문입니다. 바이러스 생산을 시작하기 위해 플라스미드 형질 주입 전에 HEK-293 T 세포를 10cm 조직 배양 접시와 10ml의 세포 배양 배지에서 30-40% 합류로 분할합니다. 배양 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 패키징 플라스미드 렌티바이러스 벡터, 125마이크로리터의 1몰 염화칼슘으로 DNA transfection 용액을 준비하고 증류수를 첨가하여 부피를 500μl로 조정합니다. 500마이크로리터의 0.05몰 HEPS 완충액을 부드럽게 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, HEK-293 T 세포 배지를 10ml의 예열 항생제가 없는 신선한 배양 배지와 1ml의 DNA 트랜스펙션 용액을 혼합하여 교체합니다.섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 다음 날 상층 세포를 신선한 배양 배지로 교체하고 밤새 다시 배양합니다. 마지막으로, 다음 날 상등액을 수확하여 15ml 튜브로 옮깁니다.죽은 세포와 파편을 제거하려면 500회 g에서 5분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 초자연을 추가로 정제하려면 60ml 주사기를 사용하여 0.45마이크로미터 필터를 통과시킵니다. 그런 다음 여과된 상등액을 즉시 300마이크로리터 일회용 부분 표본에 분주합니다.형질도입을 위해 세포를 준비하기 위해 10% FBS가 보충된 2밀리리터의 DMAM에 있는 6웰 조직 배양 플레이트에서 60% 합류점으로 세포를 분리하여 감염시킵니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 사용할 때마다 얼음에 얼린 렌티바이러스 분취액 1개를 해동합니다.한편, 관심 세포주와 호환되는 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 가열합니다. 바이러스가 완전히 해동되면 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 DMEM에 희석합니다. 그런 다음 감소된 혈청 배지로 부피를 1ml로 조정합니다.다음으로, 배지당 1ml의 바이러스에 2마이크로리터의 폴리브레렌을 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 이 혼합물 1ml를 세포에 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 10%FBS가 보충된 일반 DMEM으로 교체한 후 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.세포 성장을 모니터링하고 2일마다 배지를 교체하십시오.세포가 합류점에 도달하면 6웰 접시의 각 웰을 10cm 조직 배양 플레이트로 확장합니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 마지막으로, 웰당 4번째 셀에 1.5배 10을 저장하고 384개의 웰 분석 플레이트에 50마이크로리터의 DMEM을 저장합니다.그런 다음 현미경으로 YFP 표지 단백질의 발현 수준을 확인합니다. 발현에서 신호 대 잡음비가 3 이상으로 표시되면 해당 세포주에 대한 세포 스톡을 준비합니다. 화합물 전달을 위해 384웰 저장 폴리프로필렌 플레이트에서 표준 1-3 희석 시리즈로 화합물의 연속 희석액을 추가합니다.그런 다음 384 모세관 헤드가 장착된 액체 핸들러를 사용하여 바닥이 평평한 검은색 384웰 분석 플레이트에 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 분배합니다. 그런 다음 이 플레이트의 4번째 세포에 1.5 곱하기 10을 파종합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.프로테아좀 억제제로 처리된 세포주를 이미징하기 전에 염색 용액과 함께 예열된 DMEM 10마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 염색 후 현미경 탭을 선택하여 자동 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다. 먼저 구성 탭을 선택한 다음 올바른 플레이트 유형에서 20배 대물렌즈를 선택합니다.다른 플레이트 유형에서 적절한 초점을 허용하려면 호출자가 대물렌즈에서 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하십시오. 다음으로 노출 하나를 선택합니다. 초점 높이를 0마이크로미터로 설정한 다음 초점을 선택합니다.초점이 맞춰지면 카메라 1을 노출시킵니다. 노출면을 최적화하려면 초점 높이를 조정하고 테이크 높이를 클릭합니다. 약 3000의 최대 픽셀 강도에 대한 노출 시간과 레이저 파워를 변경하고 노출 매개변수를 저장합니다.실험 정의 탭을 선택하고 레이아웃 및 하위 레이아웃을 만듭니다. 그런 다음 관련 레이아웃 노출, 참조 이미지, 기울이기, 자르기 파일 및 하위 레이아웃을 끌어다 놓습니다. 그런 다음 실험을 저장합니다.마지막으로 자동 실험 탭을 선택하고 이미지를 획득합니다. 2채널 영상의 경우, 먼저 소프트웨어 알고리즘을 선택하여 핵, 세포질, 응집체와 같은 기본 객체를 분할합니다. 먼저, 100% DMSO 또는 DMSO에 용해된 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 바닥이 평평한 384웰 플레이트에 분배합니다.동일한 플레이트에서 50마이크로리터의 DMEM에 웰당 4번째 세포에 1.5배 10을 수동으로 파종합니다. 그런 다음 현미경 시스템 환경 제어 장치를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정합니다. 광시야 형광 모드에서 현미경을 작동하고 소프트웨어 설정으로 LWD 20배 대물렌즈 비공초점 모드, 웰당 4개 필드 및 1시간의 캡처 간격을 선택합니다.그런 다음 적절한 알고리즘을 선택하여 cytosol 및 aggregates와 같은 기본 객체를 분할합니다. 필요한 경우 배경 임계값 및 대비 매개변수를 조정합니다. SOD-1 야생형 및 SOD-1 A4V 돌연변이로 형질도입된 테스트된 세포주는 건강하게 유지되었고, SOD 형태에 관계없이 높은 발현 수준 및 장기적으로 광범위한 phi-labeling을 보여주었습니다.프로테아좀 억제제 ALLN을 24시간 동안 처리하면 HEK-293 세포에서 SOD-1 A4V YFP 응집체의 축적이 촉진되었지만 SOD-1 Wild Type YFP 형질도입 세포에서는 축적되지 않았습니다. 또한, 동일한 벡터로 형질도입된 U2 OS 및 SH-SY5Y 세포주 SOD-1 A4V YFP에서 응집 수준이 매우 낮았습니다. ALLN의 유무에 관계없이 세포를 파종한 후 50시간 동안 응집체 형성을 모니터링했습니다.ALLN 응집체 형성은 24시간에 안정기에 도달했으며 다음 12시간 동안 안정적으로 유지되었습니다. 또한, ALLN의 세포독성 효과로 인해 28시간 경과후 세포 밀도가 현저히 감소한 반면, DMSO 처리된 음성 대조군에서는 세포 수가 증가했습니다. 프로테아좀 억제제의 존재 하에서 24시간 동안 배양된 SOD-1 A4V YFP 세포를 Hoechst 용액으로 염색하였다.3가지 상이한 프로테아좀 억제제에 대한 상대적 독성은 Hoechst 염료로 표지된 웰에 남아 있는 부착 세포주의 수를 측정하여 정면적화되었습니다. 총 세포 수는 프로테아제 억제제의 용량 증가에 대한 반응으로 감소했습니다. 반대로, SOD-1 A4V 응집체를 발현하는 세포의 비율은 프로테아제 억제제의 농도에 따라 증가했다.이 과정을 수행할 때 세포 품질이 결과에 큰 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 세포에 미세혈장이 없고 모든 단계에서 건강한지 확인하는 것이 중요합니다. 이 과정에 따라, 공명 에너지 전달을 사용하여 단백질의 분해 또는 단백질과 다른 단백질의 상호 작용에 관한 추가 질문에 답하기 위해 다른 이미징 방법을 사용할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 High-Content 이미지 분석을 사용하여 여러 살아있는 세포에서 단백질의 운명을 테스트하는 도구를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 따라서 이 방법은 간단한 세포 모델에서 발생하는 단백질 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포와 분화된 뉴런과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 프로테아좀 억제제를 사용하여 프로테아좀 활성을 차단하여 형광 표지에 융합된 잘못 접힌 돌연변이 단백질이 유비퀴틴 의존성 프로테아솜 분해를 겪어 세포 세포질 내에 축적되는 것을 방지하는 세포 기반 단백질 응집 분석을 시연합니다. 그런 다음 단백질 응집체를 시각화하고 형광 현미경으로 정량화합니다.

Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

단백질 집계 및 autophagic 플럭스의 초파리 모델의 중앙 신 경계에서의 형광 이미징-기반 세포 생물학 연구에서 양적 데이터를 추출 하는 간단 하 고 융통성 있는 워크플로 개발 했습니다. neurodegeneration입니다.

ImageJ를 사용 하 여 붙일 태그가 단백질의 편견된 분석 통해 초파리 에서 Neurodegeneration의 양적 세포 생물학

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.

이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과

우리는 여기에서 형광 상관 분광학을 사용하여 세포 용해 및 살아있는 세포에 있는 단백질 올리고머 및 응집을 측정하는 절차를 소개합니다.

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

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배우세요 SOD1 돌연변이 단백질 집계를 정량화하는 고콘텐츠 분석법을 HEK-293 세포를 이용하여. 이 방법은 신경퇴행성 질환 연구와 소분자 스크리닝에 활용됩니다.

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