살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

이 실험의 전반적인 목표는 시간과 용량에 따라 잘못 접힌 단백질의 응집을 조절하는 데 있어 작은 분자의 효과를 연구하기 위한 분석을 개발하는 것입니다. 이 방법은 세포 분석 개발을 위한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 high-content 스크리닝 기술에 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 신경 퇴행성 질환에서 발생하는 단백질 응집을 감지하고 정량화하는 간단한 방법을 제공하는 것입니다.

이 기술의 의미는 ALS와 같은 신경 퇴행성 질환의 잠재적 치료법으로 확장되는데, 이는 세포 분석을 개발하고 소분자 조절제에 대한 스크리닝을 수행할 수 있는 간단한 방법을 제안하기 때문입니다. 바이러스 생산을 시작하기 위해 플라스미드 형질 주입 전에 HEK-293 T 세포를 10cm 조직 배양 접시와 10ml의 세포 배양 배지에서 30-40% 합류로 분할합니다. 배양 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 패키징 플라스미드 렌티바이러스 벡터, 125마이크로리터의 1몰 염화칼슘으로 DNA transfection 용액을 준비하고 증류수를 첨가하여 부피를 500μl로 조정합니다. 500마이크로리터의 0.05몰 HEPS 완충액을 부드럽게 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, HEK-293 T 세포 배지를 10ml의 예열 항생제가 없는 신선한 배양 배지와 1ml의 DNA 트랜스펙션 용액을 혼합하여 교체합니다.

섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 다음 날 상층 세포를 신선한 배양 배지로 교체하고 밤새 다시 배양합니다. 마지막으로, 다음 날 상등액을 수확하여 15ml 튜브로 옮깁니다.

죽은 세포와 파편을 제거하려면 500회 g에서 5분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 초자연을 추가로 정제하려면 60ml 주사기를 사용하여 0.45마이크로미터 필터를 통과시킵니다. 그런 다음 여과된 상등액을 즉시 300마이크로리터 일회용 부분 표본에 분주합니다.

형질도입을 위해 세포를 준비하기 위해 10% FBS가 보충된 2밀리리터의 DMAM에 있는 6웰 조직 배양 플레이트에서 60% 합류점으로 세포를 분리하여 감염시킵니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 사용할 때마다 얼음에 얼린 렌티바이러스 분취액 1개를 해동합니다.

한편, 관심 세포주와 호환되는 혈청이 포함된 세포 배양 배지를 가열합니다. 바이러스가 완전히 해동되면 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 DMEM에 희석합니다. 그런 다음 감소된 혈청 배지로 부피를 1ml로 조정합니다.

다음으로, 배지당 1ml의 바이러스에 2마이크로리터의 폴리브레렌을 첨가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 이 혼합물 1ml를 세포에 넣고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 바이러스가 포함된 배지를 제거하고 10%FBS가 보충된 일반 DMEM으로 교체한 후 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

세포 성장을 모니터링하고 2일마다 배지를 교체하십시오.세포가 합류점에 도달하면 6웰 접시의 각 웰을 10cm 조직 배양 플레이트로 확장합니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 마지막으로, 웰당 4번째 셀에 1.5배 10을 저장하고 384개의 웰 분석 플레이트에 50마이크로리터의 DMEM을 저장합니다.

그런 다음 현미경으로 YFP 표지 단백질의 발현 수준을 확인합니다. 발현에서 신호 대 잡음비가 3 이상으로 표시되면 해당 세포주에 대한 세포 스톡을 준비합니다. 화합물 전달을 위해 384웰 저장 폴리프로필렌 플레이트에서 표준 1-3 희석 시리즈로 화합물의 연속 희석액을 추가합니다.

그런 다음 384 모세관 헤드가 장착된 액체 핸들러를 사용하여 바닥이 평평한 검은색 384웰 분석 플레이트에 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 분배합니다. 그런 다음 이 플레이트의 4번째 세포에 1.5 곱하기 10을 파종합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.

프로테아좀 억제제로 처리된 세포주를 이미징하기 전에 염색 용액과 함께 예열된 DMEM 10마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 염색 후 현미경 탭을 선택하여 자동 현미경 작동 소프트웨어를 시작합니다. 먼저 구성 탭을 선택한 다음 올바른 플레이트 유형에서 20배 대물렌즈를 선택합니다.

다른 플레이트 유형에서 적절한 초점을 허용하려면 호출자가 대물렌즈에서 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하십시오. 다음으로 노출 하나를 선택합니다. 초점 높이를 0마이크로미터로 설정한 다음 초점을 선택합니다.

초점이 맞춰지면 카메라 1을 노출시킵니다. 노출면을 최적화하려면 초점 높이를 조정하고 테이크 높이를 클릭합니다. 약 3000의 최대 픽셀 강도에 대한 노출 시간과 레이저 파워를 변경하고 노출 매개변수를 저장합니다.

실험 정의 탭을 선택하고 레이아웃 및 하위 레이아웃을 만듭니다. 그런 다음 관련 레이아웃 노출, 참조 이미지, 기울이기, 자르기 파일 및 하위 레이아웃을 끌어다 놓습니다. 그런 다음 실험을 저장합니다.

마지막으로 자동 실험 탭을 선택하고 이미지를 획득합니다. 2채널 영상의 경우, 먼저 소프트웨어 알고리즘을 선택하여 핵, 세포질, 응집체와 같은 기본 객체를 분할합니다. 먼저, 100% DMSO 또는 DMSO에 용해된 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 바닥이 평평한 384웰 플레이트에 분배합니다.

동일한 플레이트에서 50마이크로리터의 DMEM에 웰당 4번째 세포에 1.5배 10을 수동으로 파종합니다. 그런 다음 현미경 시스템 환경 제어 장치를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정합니다. 광시야 형광 모드에서 현미경을 작동하고 소프트웨어 설정으로 LWD 20배 대물렌즈 비공초점 모드, 웰당 4개 필드 및 1시간의 캡처 간격을 선택합니다.

그런 다음 적절한 알고리즘을 선택하여 cytosol 및 aggregates와 같은 기본 객체를 분할합니다. 필요한 경우 배경 임계값 및 대비 매개변수를 조정합니다. SOD-1 야생형 및 SOD-1 A4V 돌연변이로 형질도입된 테스트된 세포주는 건강하게 유지되었고, SOD 형태에 관계없이 높은 발현 수준 및 장기적으로 광범위한 phi-labeling을 보여주었습니다.

프로테아좀 억제제 ALLN을 24시간 동안 처리하면 HEK-293 세포에서 SOD-1 A4V YFP 응집체의 축적이 촉진되었지만 SOD-1 Wild Type YFP 형질도입 세포에서는 축적되지 않았습니다. 또한, 동일한 벡터로 형질도입된 U2 OS 및 SH-SY5Y 세포주 SOD-1 A4V YFP에서 응집 수준이 매우 낮았습니다. ALLN의 유무에 관계없이 세포를 파종한 후 50시간 동안 응집체 형성을 모니터링했습니다.

ALLN 응집체 형성은 24시간에 안정기에 도달했으며 다음 12시간 동안 안정적으로 유지되었습니다. 또한, ALLN의 세포독성 효과로 인해 28시간 경과후 세포 밀도가 현저히 감소한 반면, DMSO 처리된 음성 대조군에서는 세포 수가 증가했습니다. 프로테아좀 억제제의 존재 하에서 24시간 동안 배양된 SOD-1 A4V YFP 세포를 Hoechst 용액으로 염색하였다.

3가지 상이한 프로테아좀 억제제에 대한 상대적 독성은 Hoechst 염료로 표지된 웰에 남아 있는 부착 세포주의 수를 측정하여 정면적화되었습니다. 총 세포 수는 프로테아제 억제제의 용량 증가에 대한 반응으로 감소했습니다. 반대로, SOD-1 A4V 응집체를 발현하는 세포의 비율은 프로테아제 억제제의 농도에 따라 증가했다.

이 과정을 수행할 때 세포 품질이 결과에 큰 영향을 미친다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 세포에 미세혈장이 없고 모든 단계에서 건강한지 확인하는 것이 중요합니다. 이 과정에 따라, 공명 에너지 전달을 사용하여 단백질의 분해 또는 단백질과 다른 단백질의 상호 작용에 관한 추가 질문에 답하기 위해 다른 이미징 방법을 사용할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 High-Content 이미지 분석을 사용하여 여러 살아있는 세포에서 단백질의 운명을 테스트하는 도구를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 따라서 이 방법은 간단한 세포 모델에서 발생하는 단백질 응집에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 환자 특이적 유도 만능 줄기 세포와 분화된 뉴런과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.