Name: 인간의 과발현과 정제 시스 - 프레 닐 트랜스퍼 라제 대장균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 인간 DHDDS 과발현 및 정제 방법을 대장균에서 비변성 조건으로 수행하는 과정을. 이 기술은 이소프레노이드 합성 연구와 망막 색소 변성증 관련 돌연변이 이해에 활용됩니다.

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이 작품은 이스라엘 과학 재단 재단 연구 센터 (I-CORE)의 구조 세포 생물학 (1775/12)과 이스라엘 과학 재단 보조금 (1721/16과 2338/16) (YH)과 825/14 (DK ). DK에 대한 Fields Estate Foundation의 지원은 높이 평가됩니다. 이 연구는 Ilan Edri와 Michal Goldenberg가 Tel Aviv University의 Sackler 의학부의 MD 논문 요구 사항을 부분적으로 이행함으로써 수행되었습니다.

1 . E. coli 에서의 과발현을위한 cis -PT의 클로닝 <ol><li> 109aa thioredoxin (TRX) 단백질 17 과 융합 된 단백질 서열의 클로닝 및 고수준 발현을 위해 설계된 pET-32b 발현 벡터 및 대장균 코돈 최적화 된 전장 cis -PT 18 코딩 서열을 수득한다. </li><li> TEV 프로테아제 짧은가요 성 링커 하였다 (담배 식각 바이러스 단백질 분해 효소) 절단 부위 ( &quot;/&quot;는 절단 점을 나타내는 ENLYFQ / G) 9 갖도록주의 시스의 상류 (SGSGSG을 절단 부위의 접근성을 향상시키기) -PT 서열 ( 도 1A ). 또한, 복제에 적합한 5 &#39;및 3&#39;제한 사이트를 추가하십시오. </li><li> 표준 ligation 기술을 사용하여 합성 DNA 구조를 pET-32b 벡터에 클로닝하십시오 10 . </li></ol> 2. 지나치게 높은E. coli 에서의 인간 DHDDS의 절단 <ol><li> 제조사의 지시에 따라 TRX- 융합 DHDDS 구조체로 대장균 T7을 형질 전환시킨다. </li><li> 암피실린 선택 조건 (200 MG / L)하에 LB - 한천에 대한 제조 업체의 지침에 따라 형질 전환 세포를 플레이트. </li><li> 100 밀리그램 / L의 암피실린과 250 ML 플라스크 스타터 문화의 LB 매체 100 ML에 선택한 식민지를 접종하고 200 rpm으로 일정한 흔들림과 37 ° C에서 하룻밤 incubate. </li><li> 이 배양액 80 mL를 2 x YT 배지 (16 g / L 트립 톤, 10 g / L 효모 추출물, 5 g / L NaCl) 1.5 L가 각각 함유 된 2 개의 5 L 플라스크 (플라스크 당 40 mL) L 암피실린. </li><li> OD 600 nm = 0.5에 도달 할 때까지 180 rpm으로 일정하게 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양합니다. </li><li> 온도를 16 ° C로 낮추고 0.5 mM 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 세포를 유도하십시오. 범죄자단백질 발현을 위해 동일한 조건 하에서 16-20 시간 항온 처리한다. </li><li> 원심 분리 (10,000 x g 10 분)에 의해 세포를 수확. 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지 할 수 있습니다. 세포 펠릿은 정화 때까지 -80 ° C에서 보관해야합니다. </li></ol> 삼 . 인간 DHDDS의 정제 <ol><li> 버퍼 A (25 MM 트리스 - HCL, 산도 7.5, 150 MM NaCl, 0.1 % 트리톤 X - 100, 10 MM β - mercaptoethanol), 1 μg / ML DNase I, 그리고 프로 테아 제 억제제 혼합물에있는 세포를 Resuspend. </li><li> 유리 - 테플론 균질기를 사용하여 세포를 균질화하십시오. </li><li> 15,000 PSI 11 - 12,000 마이크로 플루 또는 상응하여 세포를 방해. </li><li> 4 ° C에서 45 분 동안 40,000 xg에서 세포 용 해물을 원심 분리하십시오. 가용성 분획을 포함하는 상청액을 회수한다. </li><li> 상층 액을 5 - 10 mL 코발트 고정화 금속 친 화성 크로마토 그래피 (Co 2+ -IMAC) 12 컬럼에 넣고 10이후에 완충액 A 및 10 mM 이미 다졸로 철저히 세척하여 비특이적 단백질 결합을 감소시켰다. </li><li> 과잉 발현 된 단백질을 완충액 A로 250 mM 이미 다졸로 보충하십시오. </li><li> 완충액 A로 평형화 된 53 mL 예비 탈염 칼럼을 사용하여 이미 다졸을 제거한다. </li><li> 하룻밤 4 ° C에서 6xHis - 태그 TRX 융합 단백질을 제거하기 위해 용출 단백질에 6xHis 태그 TEV 프로 테아 제 (50mg 단백질 당 1mg TEV 프로 테아 제)를 첨가하십시오. </li><li> cleaved 6x His - 태그 TRX 융합 단백질과 TEV 프로 테아 제를 제거하기 위해 5 MM 이미 다졸로 보충 버퍼 A와 함께 평형 Co 2 + -IMAC 컬럼에 절단 단백질을로드합니다. </li><li> 30 kDa 분자량 차단 원심 분리 필터를 사용하여 3 ~ 4 mL로 유출액과 농축 물을 수집합니다. </li><li> 최종 정제를 위해 버퍼 A로 평형화 된 superdex-200 크기 - 배제 크로마토 그래피 컬럼 상에 농축 된 단백질을 로딩한다. 단백질은 이량 체 (~ 76 kDa)로 용리됩니다. </li&gt; <li> 컬럼 분석 곡선과 용출 프로파일을 비교하여 관련 분율을 선택하십시오. </li><li> SDS-PAGE를 사용하여 준비의 순도를 평가하십시오. </li><li> 다운 스트림 실험에 필요한 단백질 농도를 결정하고 사용하기 전까지 액체 질소에서 정화되고 농축 된 단백질의 플래시 동결 분취 량을 측정하고 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 4. 분석적인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) <ol><li> 동결 융해 사이클을 견딜 수있는 단백질의 능력을 보장하기 위해 동결 단백질의 분량을 해동하고 21,000 x g 에서 10 분간 원심 분리하여 불용성 응집체를 제거합니다. 뜨는을 수집합니다. </li><li> 상 단백질 넣 캅토-200 분석 컬럼 25 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 150 mM의 NaCl로 미리 평형, 0.02 % 트리톤 X-100, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 초 고성능 액체 크로마토 그래피 시스템 (13)을 사용하여, 14 . </li><li> 트립토판 플루 오레 모니터scence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm)를 사용하여 단백질의 용출 프로필을 검출합니다. 분자량 평가를위한 올바른 보정 곡선을 가져야합니다. 이러한 곡선은 SEC 컬럼 제조업체 를 통해 구할 수 있습니다. </li></ol> 5. 효소 반응 속도론 - 시간 의존적 활동 15 , 16 , 17 <ol><li> 정제 단백질의 활동을 보장하기 위해 10 μM FPP와 50 μM 14 C - IPP와 정제 DHDDS 5 μM을 섞어 22 - 30 ° C에서 0.5 MM MgCl 2 와 버퍼 A의 반응을 시작합니다. 참고 : 정확한 반응 조건은 DHDDS와는 다른 cis -PT의 준비에 따라 다를 수 있습니다. 또한, DHDDS의 활성도는 온도와 [Mg 2+ ]에 따라 달라집니다. 주의 : 14 C-IPP는 방사성 물질이므로 해당 지역의 방사선 안전 규정에 따라 사용해야합니다. </li&gt; <li> 0, 2, 4 및 6 시간에 반응에서 15 μL 샘플을 철회 후, 15 밀리 버퍼 A 보충 20 MM EDTA (10 MM EDTA의 최종 농도)의 추가로 반응의 즉각적인 급냉 다음. </li><li> H 2 O가 포화 된 1- 부탄올 1 mL를 넣고 충분히 소용돌이 칠하여 반응 생성물을 추출한다. 참고 : 여기서 프로토콜을 중지하고 샘플을 나중에 읽을 수 있도록 보관할 수 있습니다. </li><li> 샘플에 신틸레이션 칵테일을 넣고 신틸레이션 카운터를 사용하여 총 방사능을 나타내는 15 μL의 방사능과 함께 14 C를 포함하는 부탄올 단계의 반응 생성물을 정량하십시오. </li><li> 각 시점에서 0 시간 샘플을 사용하여 측정 된 배경 판독 값을 뺀 후 14 C-IPP의 백분율을 계산합니다. </li><li> 14 개의 이용 비율을 계산하여 각 시점에서의 네트 (14) C-IPP 혼입 계산 </C-IPP 농도를 측정하고, 시간의 함수로서 결과를 플로팅한다. 시간에 따른 순 14 C-IPP 통합의 증가가 예상된다. </li></ol>

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<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
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<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
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<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

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E. coli 세포에서 기능성 인간 DHDDS를 정제하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 간단하고 효율적이어서 적절한 구조가 사용 가능 해지면 3-4 일 내에 단백질을 과발현하고 정제 할 수 있습니다. 단백질 정제를위한 그러한 프로토콜은 많은 질병 18 의 유전학에 관한 정보의 과다한 정보를 제공하는 게놈 시퀀싱의 돌파구를 고려할 때 특별한 의미가 있습니다. 따라서 단백질 수준 19 에서 병원성 메커니즘을 특성화하기위한 높은 처리량 방법의 개발이 필요합니다. 이종 단백질의 과발현과 정제에서 흔히 나타나는 함정을 극복하기 위해 여기에 몇 가지 조치가 취해졌으며, 이는 수용성 단백질과 기능성 단백질을 성공적으로 얻는 데 중요합니다. 첫째, DHDDS는 TRX 융합체로서 과발현되었다. TRX는 융합 단백질 폴딩을 촉진하고 융합 단백질 용해도를 증가 시켜서 포유 동물 b조형물 <su...

Prenyltransferases 다중 축합 반응 1을 통해 아이소 펜 테닐 다이 포스페이트 (IPP)를 사용하여 알릴 포스페이트, 2 쇄 신장을 촉매하는 효소 군이다. E 형 효소 트랜스 이중 결합의 형성을 촉진하는 반면 3 Z 형 효소, 축합 반응, 시스 이중 결합의 형성을 촉매. -Prenyltransferases 시스 (시스 -PT, Z 형 효소) 고전 단 체인 (C 15), 중쇄 (C 50-55)에 자신의 제품의 사슬 길이에 따라 분류되며, 장쇄 (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 이소 펜 테닐 디 포스페이트 (IPP) 1을 이용한 다중 응축을 통해 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 신장을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT입니다, 5 , 6 . 이것은 dehydrodolichyl 포스페이트의 형성을 초래하는 dolichylpyrophosphate 전구체 N - 결합 글리코 실화 단백질 1에 관련된 글리코 캐리어 분자로서의 C 55-100 polyprenyl 인산. Ashkenazi 유태인 중, DHDDS에있는 missense 비 보존 적 돌연변이 (K42E)는 염색체 열성 색소 성 망막염을 초래합니다 7 , 8 . 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. Escherichia coli 는 재조합 단백질 발현을위한 가장 편리하고 비용 효율적인 숙주로 여겨지며, 따라서 가장 빈번하게 사용되는 숙주이기도합니다. 그러나 대장균 에서 이종성으로 단백질을 과발현 시키려 할 때, 단백질 특유의 고려가 이루어져야한다. 적절하게 접힌 상태에서 얻음대장균 으로부터의 재조합 단백질은 상이한 단백질의 독특한 특성으로 인해 단순한 문제가 아니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 수많은 접근법이 개발되었습니다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 - 최적화의 사용은 대장균 에서 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. 참고로, 단백질 융합하지 않고 효모 시스의 -PT를 과발현하는 이전 시도조차 세제 (12)의 존재에 불용성을 완료 할 예정 실패했습니다. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효과적이며 시간을 절약 할 수 있으며 기계 론적 연구에 적합한 DHDDS 준비를 얻을 수 있습니다. 서로 다른 종에서 cis -PT의 상 동성을 고려할 때,이 프로토콜은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있다고 제안한다.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>노바젠</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 익스프레스&nbsp; 리스Y&nbsp; 유능한&nbsp; E. 대장균&nbsp; (고효율)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON-superflow 수지</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 탈염 컬럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 증가 5/150 GL&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-이소펜테닐 피로인산</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트랜스, 트랜스 파르네실 피로 인산</td>염 <td>시그마</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 과발현과 정제 시스 - 프레 닐 트랜스퍼 라제 대장균

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT)는 다중 응축 반응을 통한 isopentenyl diphosphate (IPP) 를 사용하여 알릴이 인산의 사슬 연신을 촉매하는 효소 군입니다. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase)는 ispenetenyl diphosphate (IPP)와의 다중 축합을 통한 farnesyl diphosphate (FPP, allylic diphosphate)의 사슬 연신을 촉매하는 진핵 장쇄 cis -PT (축합 반응으로부터 cis 이중 결합을 형성 함)이다. DHDDS는 효소의 비 보존 적 돌연변이 (K42E)가 망막염 색소 침착 으로 이어 지므로 궁극적으로 실명으로 이끄는 생물 의학적으로 중요합니다. 따라서, 본 프로토콜은 역학적 연구에 적합한 대량의 정제 된 DHDDS를 얻기 위해 개발되었다. 여기에서, 단백질 융합, 최적화 된 배양 조건 및 코돈 최적화의 사용은 기능적으로 활성 인 DHDDS의 과발현 및 정제를 허용하기 위해 사용되었다. <em&gt; E이다. 콜리. 설명 된 프로토콜은 간단하고 비용 효율적이며 시간을 절약합니다. 상이한 종 사이의 cis -PT의 상 동성은이 프로토콜이 천연 고무 합성에 관여하는 것과 같은 다른 진핵 cis- PT에도 적용될 수 있음을 시사한다.

여기에 사용 된 구조 및 정제 과정에 대한 일반적인 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 각 정제 단계에서 얻은 샘플을 그림 2 에 나타냈다 . 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여줌으로써 매우 정제 된 제품을 생성합니다. 도 3 은 정제 된 효소의 SEC 분석 결과로서, 단백질이 동종이 량체로만 ​​관찰된다는 것을 나타낸다. 그림 4 는 대표적인 시간 의존 활성 분석을 보여줍니다. 14 C-IPP 혼입은 6 시간 이상 명확하게 상승하여 정제 된 효소가 기능적임을 입증한다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

에스 케리 치아 (Escherichia )로부터의 비 변성 조건 하에서 코돈 최적화 된 인간 시스 - 프레 닐 전이 효소의 과발현 및 정제를위한 간단한 프로토콜 콜라이 (coli )는 효소 활성 분석과 함께 기술된다. 이 프로토콜은 기계적 연구에 적합한 양 및 품질의 다른 시스 플 닐 트랜스퍼 라제 단백질의 생산을 위해 일반화 될 수 있습니다.

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비변성 조건에서 코돈에 최적화된 human cis-prenyltransferase를 과발현 및 정제하고 효소 활성을 분석하는 것입니다. 이 절차는 진핵생물 장쇄 시스-프레닐트랜스퍼라제 디하이드로돌리실 디포스페이트 합성효소(DHDDS)로 시연됩니다. 이 방법은 이소프레노이드 합성에 대한 이해를 높이고 DHDDS의 돌연변이와 관련된 색소성 망막염의 병태생리학적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 간단하고 비용 효율적이며 시간을 절약할 수 있다는 것입니다. 또한 다른 cis-prenyltransferase 단백질의 대량 생산을 위해 일반화할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 human DHDDS의 발현을 복제하는 것으로 이 절차를 시작합니다.완충액 A, DNase I 밀리리터당 1마이크로그램 및 프로테아제 억제제 혼합물에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 유리 테프론 균질화기를 사용하여 재현탁 세포를 균질화합니다. Microfluidizer 또는 이에 상응하는 것을 가진 세포를 12, 000에서 15, 000 psi에 붕괴하십시오.다음으로, 40, 4 섭씨 온도에 45 분 동안 g 000 번 g에 세포 용해물을 원심 분리하십시오. 가용성 분획을 포함하는 상등액을 회수합니다. 5-10mm 코발트 고정 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 10밀리몰 이미다졸을 사용하여 상등액을 로드합니다.고속 단백질 액체 크로마토그래피 기계에 로딩한 후 비특이적 단백질 결합을 줄이기 위해 10밀리몰 이미다졸로 완충액 A로 컬럼을 철저히 세척합니다. FPLC 프로그램을 시작합니다. 250 millimolar imidazole이 보충된 완충액 A로 과발현된 단백질을 용리시킵니다.용출 후, 완충액 A.와 평형을 이룬 분취용 탈염 컬럼 53 밀리리터를 사용하여 이미다졸을 제거한 다음, 헥사히스티딘 태그가 붙은 TEV 프로테아제를 용출된 단백질에 첨가하여 헥사히스티딘 태그가 붙은 티오레독신 DHDDS 융합을 제거합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음으로, 절단된 단백질을 5밀리몰 이미다졸이 보충된 완충액 A로 평형을 이룬 코발트 고정 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로드합니다.플로우스루를 수집하여 절단된 헥사히스티딘 태그가 붙은 티오레독신과 TEV 프로테아제를 제거합니다. 30 킬로달톤 분자량 차단 원심 필터를 사용하여 흐름을 3-4 밀리리터 사이로 농축합니다. 그런 다음 농축된 단백질을 완충액 A와 평형을 이룬 Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로드하여 최종 정제를 수행합니다.샘플을 분획 수집기의 96웰 랙에 넣습니다. 단백질은 이량체로 용리됩니다. 용리 프로파일을 컬럼 검량선과 비교하여 관련 분획을 선택합니다.이 시점에서 SDS-PAGE를 사용하여 제제의 순도를 평가합니다. 마지막으로, 다운스트림 실험에 필요한 단백질 농도를 측정하고 액체 질소에서 정제된 농축 단백질의 급증발 동결 분취액을 측정합니다. 사용할 때까지 부분 표본을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.단백질이 동결-해동 주기를 견딜 수 있는 능력을 보장하려면 냉동 단백질의 부분 표본을 해동합니다. 부분 표본을 21, 000 곱 g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 응집체를 제거합니다. 원심분리 후 상층액을 수집합니다.다음으로, 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 TNXB로 사전 평형을 이룬 Superdex 200 분석 컬럼에 단백질을 로드합니다. 트립토판 형광을 모니터링하여 단백질의 용리 프로파일을 검출합니다. SEC 컬럼 제조업체를 통해 제공되는 분자량 평가를 위한 유효한 검량선이 있는지 확인하십시오.정제된 단백질의 활성을 보장하기 위해 먼저 정제된 DHDDS의 5마이크로몰을 10마이크로몰 FPP 및 50마이크로몰 C14 IPP와 혼합합니다. 섭씨 22-30도에서 0.5 밀리몰 염화마그네슘으로 완충액 A에서 반응을 시작합니다. 20 밀리몰 EDTA가 보충된 15 마이크로리터의 완충액 A를 첨가하여 반응을 즉시 담금질한 후 0, 2, 4 및 6시간에 반응에서 15 마이크로리터 샘플을 회수합니다.그런 다음 1 밀리리터의 수분 포화 1- 부탄올을 첨가하고 완전히 와류를 일으켜 반응 생성물을 추출합니다. 여기서 프로토콜을 중지할 수 있으며, 나중에 판독할 수 있도록 샘플을 보관할 수 있습니다. 다음으로 샘플에 섬광 칵테일을 추가합니다.섬광 계수기를 사용하여 C14를 포함하는 부탄올 상의 반응 생성물을 15 마이크로 리터의 방사능과 함께 정량화하여 총 방사능을 나타냅니다. 마지막으로, 총 C14 IPP 농도에서 사용된 백분율을 계산하여 각 시점에서 순 C14 IPP 혼입을 계산하고 결과를 시간 함수로 표시합니다. 시간이 지남에 따라 순 C14 IPP 통합의 증가가 예상됩니다.각 정제 단계에서 얻은 샘플이 여기에 나와 있습니다. 이 SDS-PAGE 분석은 DHDDS의 단계적 정제를 보여주며, 그 결과 고도로 정제된 제품이 생성됩니다. 이 크로마토그램은 정제된 효소의 분석적 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 나타내며, 단백질이 동질이합체로만 관찰된다는 것을 보여줍니다.여기서 화살표는 공극 부피를 나타냅니다. 대표적인 시간 의존적 활성 분석법은 C14 IPP 혼입이 6시간에 걸쳐 명확하게 상승하여 정제된 효소가 기능한다는 것을 입증합니다. 일단 숙달되면 이 간단한 제제를 2-3일 안에 완료할 수 있어 매우 순수하고 활동적인 효소를 얻을 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 E.coli에서 human cis-prenyltransferase를 과발현 및 정제하는 방법과 시간 의존적 방식으로 그 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 5 일간의 프로토콜은 모든 단계, 장비 및 기반의 효율적인 내생 대장균 처음부터 TX-TL의 무 세포 발현 시스템을 구축 및 실행에 필요한 추가 소프트웨어를 설명합니다. 시약, 프로토콜은 8 셋업 시간 이하의 반응, 수집, 및 프로세스 데이터를 걸린다.

구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

단백질 동시 발현은 단백질 복합체의 in vitro 재구성에 대한 강력한 대안이며 in vivo에서 생화학 및 유전자 검사를 수행하는 데 도움이 됩니다. 여기에서 우리는 단백질 복합체를 얻고 세포의 돌연변이 빈도를 조정하기 위해 대장균에서 단백질 공동 발현을 사용하는 것에 대해 보고합니다.

단백질 공동 식의 다각적 인 장점에<em&gt; 대장균</em

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.

재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols

합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

이 기사에서는 C41(DE3) 발현 시스템에서 독성 뉴클레아제인 재조합 Nsp15를 과발현한 다음 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 태그가 지정된 단백질을 정제하는 방법론에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 다른 까다로운 독성 단백질에 적용될 수 있습니다.

대장균에서 독성 뉴클레아제를 과발현 및 정제

배우세요 인간 DHDDS 과발현 및 정제 방법을 대장균에서 비변성 조건으로 수행하는 과정을. 이 기술은 이소프레노이드 합성 연구와 망막 색소 변성증 관련 돌연변이 이해에 활용됩니다.

인간의 과발현과 정제 시스 - 프레 닐 트랜스퍼 라제 대장균

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