4.5: 트랜스웰 이동 측정

트랜스웰 이동 분석법은 과학자들이 세포 이동을 정량화할 수 있는 고전적인 기술입니다. 이동은 세포가 개별적으로 또는 군집 지어 이동할 수 있는 능력을 나타냅니다. 세포의 이동은 세포골격의 정밀한 재구조를 통해 가능해지며, 이동은 일반적으로 단서로 작용하는 자극에 대한 반응으로 발생합니다.

오늘은 간단한 챔버 설정을 활용하여 유인 신호에 대한 반응으로 이동을 평가하는 트랜스웰 이동 분석에 대해 논의할 것입니다.

트랜스웰 챔버에 대한 몇 가지 배경 정보를 제공하는 것으로 시작하겠습니다.

이 장치는 1961년 스티븐 보이든(Stephen Boyden) 박사가 처음 설계했으며, 그는 백혈구 이동을 연구하는 데 사용했습니다. 따라서 이 방법은 Boyden 챔버 분석이라고도 합니다.

단순한 Boyden 챔버에서 외벽은 96 우물 플레이트와 같은 우물입니다. 각 웰 내부에는 원통형 인서트인 트랜스웰이 배치됩니다. 인서트에는 정의된 기공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인이 있습니다. 우물에 넣으면 챔버가 두 개의 구획으로 나뉩니다. 상단 구획은 이동 거동을 연구할 세포가 파종되는 곳이고, 하단 저장소는 화학유인제 용액이 놓이는 곳입니다. 정의에 따르면, 화학유인물질(chemoattractant)은 "세포를 끌어당김"으로써 세포의 운동성을 촉진하는 능력을 가진 분자입니다.

이러한 인력으로 인해 상단 구획의 세포는 기공을 통해 하단 저장소로 이동합니다. 세포가 일부 흑색종 세포와 같이 부착 특성을 가지고 있는 경우 이동 후 막 아래쪽에 "달라붙게" 됩니다. 이 경우 멤브레인을 고정하고 염색할 수 있으며 현미경으로 세포를 계수할 수 있습니다. 반면에, 정자와 같이 부착되지 않은 세포는 바닥 저장소로 이동합니다. 이 경우, 저장소 용액의 세포는 혈구계의 도움으로 계수 할 수 있습니다.

이 분석의 설정은 간단하지만 실험 전에 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 그 중 일부를 검토해 보겠습니다.

시딩 용액부터 시작하여 세포 이동을 관찰할 수 있도록 밀도가 최적화되어 있는지 확인해야 합니다. 세포가 너무 적으면 감지할 수 없는 이동이 발생할 수 있으며, 밀도가 높을수록 멤브레인이 과도하게 채워져 이동을 열거하기 어려워집니다. 두 번째 고려 사항은 인서트의 기공 크기입니다. 세포 유형에 따라 신중하게 선택해야 합니다. 기공 크기가 너무 작으면 세포가 통과할 수 없습니다.

또는 기공 크기가 너무 크면 세포가 빠져나가게 되는데, 이는 이동이 아닙니다. 마지막으로, 화학유인물질의 농도와 이동을 위해 허용되는 잠복기는 상호 의존적이기 때문에 염두에 두어야 합니다. 구획 사이에서 농도 구배가 유지되는 적절한 배양 시간을 통한 최적의 농도는 화학 인력으로 인한 세포 이동을 유도합니다. 반대로, 장기간의 배양은 챔버 전체에 걸쳐 화학유인제의 평형을 동반할 수 있으며, 이는 화학적 구배의 손실로 이어질 수 있으며, 이는 얻어진 결과의 분석을 혼란스럽게 할 수 있습니다.

이러한 고려 사항을 염두에 두고 부착 세포의 이동을 측정하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 논의해 보겠습니다.

분석할 세포는 프로테아제가 없는 배지에서 제조되는데, 프로테아제는 중요한 막 수용체를 변성시키고 궁극적으로 이동에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 세포가 준비된 후 현탁액을 최적의 파종 밀도로 희석해야 합니다. 챔버를 준비하기 위해 트랜스웰은 멀티웰 플레이트의 웰에 배치됩니다. 세포 현탁액은 멤브레인을 건드리거나 기포를 유입하지 않고 트랜스웰에 피펫으로 삽입해야 합니다.

화학유인제 용액을 피펫으로 하부 저장소에 주입하여 용액이 인서트의 멤브레인에 닿도록 합니다. 이동을 위한 배양 시간은 실험적 고려 사항에 따라 달라집니다. 배양 후 멤브레인은 인서트를 70% 에탄올에 담그어 고정됩니다. 삽입물을 건조시킨 후 세포 염색 용액을 첨가합니다.

다음으로, 세포를 실온에서 약 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 인서트는 세척 버퍼의 도움으로 세척됩니다. 마지막으로, 멤브레인을 절제하여 현미경 슬라이드에 놓을 수 있습니다. 막의 아래쪽에 있는 세포는 화학유인물질의 존재 유무에 따라 이동한 세포의 수를 나타냅니다.

이제 프로토콜에 대해 감을 잡았으므로 연구자들이 이 방법을 탐색에 어떻게 사용하고 있는지 간략하게 살펴보겠습니다.

이 분석의 가장 일반적인 응용 분야 중 하나는 미확인 화합물의 화학유인 특성을 평가하는 것입니다. 여기서 과학자들은 양서류 알에서 분비되는 물질인 알루린이 있는 상태에서 개구리 정자의 수영 경로를 조사하는 데 관심이 있었습니다. 이를 위해 그들은 먼저 활성 개구리 정자를 트랜스웰 삽입물 상단에 피펫으로 주입했습니다. 맨 아래에, 그들은 알루린을 첨가했습니다. 세포가 이동하도록 허용한 후, 그들은 현미경으로 저장 용액에 있는 정자를 세었습니다. 이 기술을 사용하여 그들은 정자 이동에 대한 알루린 농도의 효과를 묘사하는 농도-반응 곡선을 생성할 수 있었습니다.

세포가 병원체의 공격을 받으면 화학유인물질을 방출하여 면역 세포를 모집하여 이동하고, 부착하고, 이후에 감염을 해결합니다. 이 현상을 테스트하기 위해 이 과학자들은 삽입물 아래쪽에 있는 상피 세포를 배양했습니다. 그 후, 그들은 이 세포들을 다른 종류의 박테리아로 감염시켰다. 마지막으로, 그들은 면역 세포를 상부 챔버에 도입했습니다. 감염된 세포는 면역 세포의 이동을 유도하는 여러 가지 화학유인물질을 생산하는 것으로 알려져 있습니다. 이 실험의 결과는 다양한 유형의 박테리아 감염에 대한 반응으로 호중구 이동의 정도가 다르다는 것을 보여주었습니다.

마지막으로, 세포외 기질을 통한 암세포의 침입과 전이는 항상 세포 생물학자들의 흥미를 불러일으켰습니다. 여기서 과학자들은 특정 화학유인 물질이 3D 매트릭스를 통한 이동에 어떻게 기여할 수 있는지 확인하고자 했습니다. 그들은 두 개의 분리된 세포 풀을 유전적으로 조작했는데, 하나는 녹색 형광 단백질을 발현하고 다른 하나는 빨간색 형광 단백질을 발현했습니다. 그런 다음 그들은 트랜스웰 상단에 세포외 기질 모방을 피펫으로 삽입했습니다.

일단 응고되면, 그들은 트랜스웰을 반전시키고 두 개의 세포 풀을 막 아래쪽에 파종했습니다. 다음으로, 그들은 멀티웰 플레이트에 삽입물을 교체하고 화학유인 용액을 상단 챔버에 피펫으로 주입했습니다. 이로 인해 아래쪽에 있는 셀이 3D 매트릭스를 통해 위로 이동했습니다. 이 연구진은 컨포칼 이미징의 도움으로 세포 이동을 3D로 재구성하고 두 세포 그룹의 이동 패턴을 구별했습니다.

트랜스웰 마이그레이션 분석에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이 방법의 구성 요소와 프로토콜에 대한 이해를 통해 이제 세포 생물학자들에 의해 널리 사용되는 이유를 알게 되었습니다. 이 설정의 단순성에도 불구하고 이 방법이 조정할 수 있는 구성의 범위는 세포 운동성 연구에 필수적입니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!