트랜스웰 이동 측정

트랜스웰 마이그레이션 분석법은 과학자들이 세포 움직임을 정량화할 수 있는 고전적인 기술입니다. 마이그레이션은 셀이 개별적으로 또는 클러스터에서 이동하는 기능을 말합니다. 세포 운동은 그들의 세포 골격의 정확한 구조 조정을 통해 가능하게 되고 이주는 일반적으로 단서로 작용하는 자극에 응하여 생깁니다.

오늘, 우리는 단서를 유치에 대한 응답으로 마이그레이션을 평가하기 위해 간단한 챔버 설정을 활용하는 트랜스 웰 마이그레이션 분석에 대해 논의 할 것이다.

우리는 트랜스 웰 챔버에 몇 가지 배경 정보를 제공함으로써 시작합니다.

이 장치는 1961년에 스티븐 보이덴 박사가 처음으로 설계했으며, 이들은 백혈구 이주를 연구하는 데 사용했습니다. 따라서,이 방법은 또한 보이든 챔버 분석으로 알려져있다.

간단한 보이든 챔버에서 외벽은 96웰 플레이트와 같은 우물입니다. 각 우물 안에는 원통형 인서트인 트랜스웰이 배치됩니다. 인서트는 정의된 공공 크기의 폴리카보네이트 멤브레인을 가지고 있습니다. 우물에 놓으면 챔버를 두 개의 구획으로 나눕니다. 상단 구획은 철새 동작을 연구하는 세포가 시드되고 하단 저장소가 화학 요법의 용액이 배치되는 곳입니다. 정의에 따르면, 화학 요법은 "세포 유치"에 의해 세포 운동성을 촉진 할 수있는 능력을 가지고있는 분자입니다.

이러한 매력적인 힘으로 인해 상단 구획의 세포가 모공을 통해 아래 저수지로 이동합니다. 세포가 일부 흑색종 세포와 같은 부착 특성을 가지고 있다면, 다음 운동은 막의 밑면에 "붙어"것입니다. 이 경우 멤브레인을 고정, 염색 및 세포는 현미경으로 계산할 수 있다. 다른 한편으로는, 비 신봉성 세포, 정자 같이, 바닥 저수지로 이동합니다. 이 경우, 저수지 용액의 세포는 혈종계의 도움으로 계산될 수 있다.

이 분석에 대한 설정은 간단하지만 실험 전에 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 그들 중 일부를 검토해 봅시다.

시드 용액부터 시작하여 밀도가 셀 마이그레이션을 관찰하도록 최적화되었는지 확인해야 합니다. 셀이 너무 적으면 감지할 수 없는 마이그레이션이 발생할 수 있으며 밀도가 커져 멤브레인이 과도하게 채워져 마이그레이션을 열거하기가 어렵습니다. 두 번째 고려 사항은 인서트가 모공 크기입니다. 셀 유형에 따라 신중하게 선택해야 합니다. 공공 크기가 너무 작으면 세포가 통과할 수 없습니다.

또는 공공 크기가 너무 크면 셀이 이동되지 않는 지저분하게 떨어집니다. 마지막으로, 이들은 상호 의존하기 때문에, 화학 요법 농도 및 이주를 허용하는 잠복기의 염두에 두어야 합니다. 농도 그라데이션이 구획 사이에 유지되는 동안 적절한 인큐베이션 시간을 가진 최적의 농도는 화학 요법으로 인한 세포 이동을 유도합니다. 반대로, 장기간 인큐베이션은 챔버 전체에 화학적 그라데이션의 손실을 초래하여 얻어진 결과의 분석을 혼동할 수 있는 화학적 그라데이션의 평형을 동반할 수 있다.

이러한 고려 사항을 염두에 두고 준수 셀의 마이그레이션을 측정하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 살펴보겠습니다.

분석할 세포는 프로테아제없는 배지에서 제조되며, 프로테아제는 중요한 막 수용체를 변성시킬 수 있으며 궁극적으로 이주에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 세포가 준비된 후에, 현탁액은 최적 파종 밀도로 희석되어야 합니다. 챔버를 준비하기 위해, 트랜스웰은 멀티 웰 플레이트에 우물에 배치됩니다. 셀 서스펜션은 멤브레인을 만지거나 기포를 도입하지 않고 트랜스웰에 파이프를 주입해야합니다.

화학용액은 하부 저수지에 파이프를 공급하여 용액이 인서트의 멤브레인에 닿도록 합니다. 마이그레이션의 인큐베이션 시간은 실험적인 고려 사항에 따라 달라집니다. 인큐베이션에 이어, 멤브레인은 인서트를 70% 에탄올에 담그어 고정됩니다. 인서트가 건조할 수 있게 한 후 세포 염색 용액이 추가됩니다.

다음으로, 세포는 실온에서 약 30 분 동안 배양됩니다. 인큐베이션후, 인서트가 버퍼 세척의 도움으로 세척됩니다. 마지막으로 멤브레인을 절제하고 현미경 슬라이드에 놓을 수 있습니다. 막의 밑면에 있는 세포는 화학요법제의 존재 그리고 부재에서 마이그레이션한 세포의 수를 나타냅니다.

이후, 지금 당신은 프로토콜에 대 한 느낌을 했습니다., 연구원은 그들의 탐험에이 방법을 사용 하는 방법을 간단 히 살펴보겠습니다.

이 분석의 가장 일반적인 응용 프로그램 중 하나는 알 수 없는 화합물의 화학 속성을 평가 하는. 여기서 과학자들은 수륙 양용 계란에 의해 분비되는 물질인 알루린의 존재하에 개구리 정자의 수영 경로를 조사하는 데 관심이 있었습니다. 이렇게하기 위해, 그들은 먼저 트랜스 웰 삽입의 상단에 활성 개구리 정자를 피펫. 바닥에는 알루린을 추가했습니다. 세포가 이동하는 것을 허용한 후에, 현미경의 밑에 저수지 용액에 있는 정액을 계산했습니다. 이 기술을 사용하여, 그들은 정자 이동에 알린 농도의 효과를 묘사 하는 농도 응답 곡선을 생성할 수 있었다.

세포가 병원체에 의해 공격될 때, 그것은 이동, 연결 및 그 후에 감염을 해결하는 면역 세포를 모집하기 위하여 화학요법제를 보냅니다. 이 현상을 시험하기 위하여는, 이 과학자는 삽입의 밑면에 상피 세포를 배양했습니다. 그 후, 그들은 박테리아의 다른 긴장으로 이 세포를 감염했습니다. 마지막으로, 그들은 상단 챔버에 면역 세포를 도입. 감염된 세포가 면역 세포 이동을 유도하는 여러 화학 요법을 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 이 실험의 결과는 세균성 감염의 다른 모형에 응하여 호중구 이주의 다른 정도를 보여주었습니다.

마지막으로, 세포외 매트릭스를 통한 암세포 침입 및 전이는 항상 세포 생물학자들에게 호기심을 불러 일으켰습니다. 여기서 과학자들은 특정 화학 요법이 3D 매트릭스를 통해 이러한 마이그레이션에 어떻게 기여할 수 있는지 결정하고 싶었습니다. 그(것)들은 유전자로 세포의 2개의 개별적인 풀을, 녹색 형광을 표현하는 하나, 또 다른 빨간 형광, 단백질을 설계했습니다. 그런 다음 세포외 매트릭스 모방을 트랜스웰 의 상단에 파이프화했습니다.

일단 고화되면, 그들은 트랜스웰을 반전시키고 막의 밑면에 세포의 두 개의 풀을 시드. 다음으로, 그들은 멀티웰 플레이트에 삽입을 교체하고 상부 챔버에 화학 용액을 피펫. 이로 인해 하단의 셀이 3D 행렬을 위아래로 이동하게 되었습니다. 공초점 화상 진찰의 도움으로, 이 연구원은 3D에 있는 세포 이주를 재구성하고, 세포의 2개의 단의 이동 패턴을 구별했습니다.

당신은 트랜스 웰 마이그레이션 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 구성 요소의 이해와이 방법의 프로토콜, 당신은 지금 세포 생물학자에 의해 그렇게 널리 사용되는 이유를 알고있다. 이 설정의 단순함에도 불구하고 이 방법이 적용할 수 있는 구성 범위는 세포 운동성 연구에 필수적입니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!