Name: RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 마우스 골수에서 파골세포를 분리 배양하고 mTORC1이 파골세포 형성에 미치는 역할을 연구하는 방법을. 이 기술은 일주일 내에 대량의 거대 파골세포를 생성하여 골다공증 치료 연구에 활용됩니다.

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저자는 친절 하 게 제공 하는 시 약 및 마우스에 대 한 박사 Minghan 통 및 미 카토를 감사합니다. 우리는 유용한 토론 Zou 실험실의 구성원 감사. 이 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 973에서 9 사람들의 병원, 상해 Jiao 집게 대학의 학부의 임상 연구 프로그램은 중국 교육부의 과학 및 기술 (대부분) [2014CB964704, 2015CB964503]에서 프로그램. 세포 생물학 및 화학 생물학에 대 한 핵심 시설, 분자 세포 과학, 상하이 연구소 생화학 및 세포 생물학, 과학의 중국 아카데미의 우수성에 대 한 CAS 센터에 대 한 핵심 시설의 도움 주셔서 감사.

동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.
1입니다. 준비
<ol><li>Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터플로리다/플로리다; 생성 Ctsk-cre, 향후 랩Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터플로리다/플로리다 쥐를 교배 하 여. 랩 터플로리다/플로리다 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.</li>
	<li>고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.</li>
	<li>
문화 매체를 준비 합니다.
	<ol>
<li>최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.</li>
		<li>골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.</li>
		<li>Osteoclast 유도 매체 구성 된 M-CSF RANKL 20 ng/mL에서 각각, α-MEM 매체의 50 ml에서를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랩 얼룩이 지기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>아세톤, 시트르산 솔루션 및 37% (vol/vol) 포름알데히드 용액의 0.8 mL 2.5 mL의 6.5 mL의 구성 수정 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>트랩 솔루션 얼룩을 준비 합니다.<ol>
<li>37 ° c.에 prewarm 이온된 수</li>
			<li>1.5 mL microtube에 빠른 가닛 GBC 기본 솔루션의 100 µ L 및 나트륨 아 질산염 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 혼합 30 미 허가 부드러운 반전 하 여 2 분 동안 서 서 혼합물.</li>
			<li>37 ° c 이온된 물 9 mL prewarm 단계 1.4.2.2, naphthol AS 비 인산 염 솔루션, 아세테이트 솔루션의 400 µ L 및 주석산 솔루션의 200 µ L의 100 µ L에서에서 빨리 가닛 diazotized GBC 기본 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c.에 물 욕조에 혼합 솔루션 얼룩 트랩을 유지</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 매체의 트랩 활동 정량화 하기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>주석산 버퍼 (50 mL) 준비: 0.33 M L tartaric 산 성, 염기 0.33 M 나트륨 주석산의 48 mL의 2 mL 탈수. 4.9에 pH 값을 조정 합니다.</li>
		<li>4-Nitrophenyl 인산 disodium (pNPP) 버퍼 (200 mL) 준비: 글리신의 1.502 g, MgCl2의 41 밀리 그램, ZnCl2, 27.2 mg 및 이온된 물 180 mL. 3 M NaOH와 10.4 pH 값 및 이온 물 200 mL을 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>PNPP 버퍼 인산 가수분해 효소 기질 (한 96 잘 접시)에 대 한 준비: 인산 가수분해 효소 기질과 단계 1.5.2의 pNPP 버퍼의 175 µ L의 49.37 mg.</li>
		<li>기판 버퍼 (9 mL/96 잘 접시) 준비: 이온된 수, 아세테이트 솔루션의 360 μ, 주석산 버퍼의 2.4 mL 6.24 mL. 소용돌이 의해 혼합 하 고 사용 하기 전에 37 ° C에서 예 열.</li>
		<li>기판 혼합물 및 10에 대 한 소용돌이를 데워 기판 buffer(1.5.4)의 9 ml에 추가할 인산 가수분해 효소 substrate(1.5.3)와 pNPP 버퍼의 90 μ s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. (주-1) 해 부
<ol><li>CO2 3 1 달 오래 된 여성 WT 및 랩Ctsk 마우스를 별도로 안락사. 훈련 된 직원에 의해 적절 한 장비와 CO2 흡입을 수행 합니다.</li>
	<li>6 마우스의 세균 오염을 방지 하기 다음 부정사 위치에 해 부 보드에 장소를 5 분 동안 75% 에탄올 (vol/vol) 100 mL를 비 커에 담가. 경골의 원심에 세로로 절 개를 확인 하 고 안과 위 뒷 다리를 따라 피부를 해 부.</li>
	<li>고관절의 관절 인 대가 위로 잘라 고 트렁크에서 뒷 다리 사지를 탈 구.</li>
	<li>무릎 관절의 관절 인 대를 절단 하 고 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 신중 하 게 끊을. 부드럽게가 위로 부드러운 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>얼음에 α-MEM의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트의 각 음에 한 마우스에 하나의 유전자의 모든 뼈를 배치 합니다. 참고: 세포 생존 능력을 유지 하는 뼈는 미만 1 시간에 대 한 이러한 조건에서 유지 되어야 한다.</li>
</ol>3입니다. 절연 (주-1)
<ol><li>Α-MEM 매체 (3 mL)와 75% 에탄올 (3 mL) 6 잘 플레이트 한 우물 및 다른 5 웰 스 작성.</li>
	<li>5 번 10 α-MEM 매체와 15 s 및 세척 뼈에 대 한 에탄올 세척에 한 유전자 형의 모든 뼈를 넣어 s 각 시간.</li>
	<li>시저와 epiphyses에서 잘라내어 구멍 및 플러시 골 밖으로 50 mL 원심 분리기 관으로 α-MEM 매체와 0.45 m m 주사기 바늘을 삽입.</li>
	<li>뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용 하 여 뼈 구멍을 플러시. 뼈는 창백한 될 때까지 철저 하 게 뼈 구멍을 씻어 두 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>800 x g와 4 ° C 5 분 Aspirate는 상쾌한 셀 펠 렛을 얻기 위해 골 원심</li>
	<li>원심 분리기 튜브와 골 수를 resuspend를 부드럽게 피 펫에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브 8 분 붉은 혈액 세포를 lyse 얼음에 계속.</li>
	<li>세포 세포의 용 해를 막으려고 원심 분리기 튜브에 α-MEM 매체의 6 mL를 추가 합니다. G와 10 분 동안 4 ° C x 500에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 3 ml에서 resuspend 고 셀 6 잘 플레이트 (일반적으로 하나의 마우스 잘 당) 합니다.</li>
	<li>5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>4입니다. 도금 (0 일)
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브 다음날 아침 첨부 되지 않은 세포를 수집 하는 상쾌한 전송.</li>
	<li>G와 5 분 동안 4 ° C x 800 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>셀 솔루션의 20 µ L 고 20 µ L Trypan 파랑의 혼합. 세 실로 혼합물의 10 µ L을 추가 하 고 솔루션의 mL 당 셀 수를 얻을.</li>
	<li>500, 000 셀/mL의 셀 솔루션을 얻기 위해 α-MEM 문화 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>추가 500 µ L 골 대 식 세포 유도 매체의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>추가 500 µ L 셀 솔루션의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>3 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
</ol>5. 차별화 (3-7 일)
<ol><li>도금, 후 3 일 96 잘 접시의 각 우물에서 50 µ L 매체를 수집 하 고-20 ° C에서 동결 후 잔여 중간 발음.</li>
	<li>추가 1 mL 및 100 µ L osteoclast 유도 매체는 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>2 일 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 하 고 잔여 중간 발음.</li>
	<li>각 우물에 osteoclast 유도 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>1 일 37 ° C에서 품 어. 참고:이 시간 포인트에서 큰, multinucleated osteoclasts 보여야 한다 거꾸로 현미경 (그림 2A).</li>
	<li>Osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 유도 매체를 변경 하 고 osteoclasts 볼 수 있습니다 때까지 매일 관찰.</li>
	<li>Osteoclasts 형성 후 96 잘 접시의 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 합니다.</li>
</ol>6. 주석산 얼룩 저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정)
참고: 성숙한 osteoclasts 생체 외에서 문화 (4 단계)의 6-7 일 후 존재할 수 있습니다.
<ol><li>중간 발음 하 고 부드럽게 1 x PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>30에 대 한 수정 프로그램 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 잘 셀 수정 실 온에서 s.</li>
	<li>고정, 후 수정 솔루션을 발음 하 고 37 ° c.에 prewarmed 이온된 수 3 번 부드럽게 씻어 이온된 수 발음</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 트랩 얼룩의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 30 분 한 빛에서 방패는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>얼룩, 후 발음 트랩 얼룩 하 고 부드럽게 이온된 물으로 3 회 세척.</li>
	<li>이미지 osteoclasts 40 X 확대는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여.</li>
</ol>7. 트랩 활동 부 량의 문화 매체
<ol><li>표면에 뜨는 30 µ L 문화 단계 5.1, 5.4, 5.8; 96 잘 접시의 각 우물에서 수집 비 경작 osteoclast 유도 매체의 30 µ L를 사용 하 여 부정적인 제어. 샘플을 새로운 96 잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 기판 mixture(1.5.5)의 90 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>1 h와 빛 으로부터 방패에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 3 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>405의 파장에서 theabsorbance 측정 nm.</li>
</ol>8. 서 부 럽
참고: 6-7 일 후 24-잘 접시에 생체 외에서 문화, 성숙한 osteoclasts 표시 되어야 합니다.
<ol><li>매체 발음</li>
	<li>부드럽게 씻어 미리 PBS 3 시간 x 1 냉각.</li>
	<li>PBS 발음</li>
	<li>SDS 세포의 용 해 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 105 ° C에서 열 lysates 및 12000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 단백질을 포함 하는 supernatants 수집 합니다.</li>
	<li>Lysates 10 %SDS 페이지11 30 µ g의 단백질을 포함 하 고 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 합니다.</li>
	<li>반대로 랩 터, 안티-P-S6, S6 안티, 안티-β-말라 4 ° C에서 5% 탈지 우유에 1:1,000 희석 하룻밤에 막 품 어.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 Tris 버퍼 염 트윈 20 (TBST)와 함께 막 씻으십시오.</li>
	<li>단계 8.9 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-실 온에서 1 h 5% 탈지 우유에 1:5,000 희석에 반대로 마우스 또는 토끼 IgG 항 체를 활용.</li>
	<li>실 온에서 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막을 씻어.</li>
	<li>Chemiluminescent 탐지에 대 한 세포 막에 서쪽 chemiluminescent HRP 기질을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 초과 기판 배수와 x 선 필름에도 말을 폭로.</li>
</ol>

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</ol>

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Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.
이전 연구에서 BMMs는 절연14,15직후 도금 했다. BMMs 중간 엽 줄기 세포를 즉시 접시에 준수는 섬유 아 세포 BMMs를 분리 하는 도금 전에 하룻밤 기본 매체와 경작 했다 하는 것이 좋습니다. M...

뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스1분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts4의 생물학을 이해 하는 중요 한.
Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족1에 속한다. Ibbotson K. J. 외. 1, 25-dihydroxy-비타민 D35를 포함 하는 매체와 osteoclast 같은 세포에서 생체 외에서 생성 하는 방법을 보고. Osteoclast 형성의 필수적인 요인으로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 및 핵 요인-κ B ligand (RANKL)에 대 한 수용 체 활성의 식별 극적으로 osteoclastogenesis 체 외 의 효율성 증가 1 , 6 , 7. 수 문화 osteoclasts에서 생체 외에서 세대의 우리의 이해와 osteoclasts의 규제 개선 했다.
2 구조적 및 기능적으로 뚜렷한 단지, 즉 mTORC1 및 mTORC28,9rapamycin (mTOR) 함수의 포유류/기계적 대상. 두 다 단백질 복합물은 다릅니다 서로 그들의 서로 다른 구성 요소와 다운스트림 기판. mTORC1 mTORC2 포함 mTOR (Rictor)9의 rapamycin을 구분 하지 않는 동반자 mTOR (랩 터)의 독특한 규정 관련 단백질을 포함 합니다. mTORC1 통합 하 고 통제 세포 성장, 증식 및 분화에 중요 한 신호를 전송할 수 있습니다. 최근에, 우리는 mTORC1 중요 한 역할 catabolic 뼈 재흡수의 네트워크에서 랩 터 osteoclasts10에서 mTORC1을 비활성화에 삭제에 의해 입증. 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 야생-타입 (WT) 및 랩Ctsk 마우스의 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 osteoclasts를 생성 하 고 mTORC1 비활성화 osteoclast에의 영향을 공부 RANKL 기반 osteoclastogenic 메서드 사용 되었다 형성입니다.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre 마우스</td><td></td><td></td><td>S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>기비코</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 M-CSF 단백질</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 RANKL 단백질</td><td>R& D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구연산염 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr>, <tr><td>포름 알데히드 용액</td>, <td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>산성 인산분해효소, 백혈구(TRAP) 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC 기본 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>나프톨 AS-BI 인산염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>아세테이트 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>주석산염 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr>, <tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td>,</tr><tr><td>L- 타르타르산</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr>, <tr><td>주석산 나트륨, 이염기성 탈수,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>, Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd. (영어)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd. (주)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>상하이 화학 Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산가수분해효소 기질</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>P4744</td><td></td></tr>, <tr><td>항랩터</td><td>세포 신호 기술</td>, <td>2280</td><td></td></tr>, <tr><td>항-P-리보솜 단백질, S6 (S235/236)</td><td>세포 신호 기술</td>, <td>2317</td><td></td></tr><tr><td>항-리보솜 단백질, S6</td><td>세포 신호 기술</td>, <td>2211</td><td></td></tr>, <tr><td>항-베타;-액틴</td><td>산타크루즈 생명 공학</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Xilong Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45mm 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>모기 집게</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rankl 기반 osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mtorc1 osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (그림 4A)에서 96 잘 접시의 각 우물에서 얻은 했다.
랩 터 의 삭제는 서쪽 더 럽 히 분석에 의해 확인 되었다, mTORC1의 비활성화는 S6 ribosom...

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생쥐 골수에서 파골세포를 in vitro에서 분리 및 배양하고 파골세포 형성에서 라파마이신 복합체 1의 포유류 표적의 역할을 연구하는 것입니다. 이 방법은 파골세포 분화에서 mTORC1의 역할과 같은 파골세포 형성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 일주일 이내에 많은 수의 거대 파골세포를 만들 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 골다공증 치료로 확장되는데, 이는 파골세포가 전구체와 구별되는 메커니즘을 연구하는 데 도움이 되기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 안락사된 쥐의 경골 원위 끝을 수직으로 절개하고 뒷다리를 따라 피부를 절개합니다. 다음으로 고관절의 관절 인대를 가위로 자르고 몸통에서 뒷다리를 탈구합니다.무릎 관절의 관절 인대를 자르고 경골과 대퇴골을 조심스럽게 분리합니다. 가위로 연조직을 부드럽게 제거합니다. 한 마리의 쥐의 모든 뼈를 얼음 위에 2ml의 알파-MEM이 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 놓습니다.분리를 위해 6웰 플레이트의 한 웰에 75% 에탄올을 채우고 다른 5웰에 알파-MEM을 채웁니다. 한 쥐의 모든 뼈를 에탄올 세척제에 15초 동안 넣은 다음 매번 10초 동안 알파-MEM으로 뼈를 5회 세척합니다. 가위로 골단을 잘라내고 0.45mm 주사기 바늘을 골강에 삽입합니다.알파-MEM으로 골수를 50ml 원심분리기 튜브로 씻어냅니다. 다음으로, 뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용하여 골강을 세척합니다. 뼈가 창백해질 때까지 골강을 철저히 씻기 위해 최소 두 번 반복합니다.그런 다음 골수를 원심 분리하여 5분 동안 섭씨 4도에서 세포 펠릿을 얻습니다. 그 후, 상층액을 흡인합니다. 원심분리 튜브에 적혈구 용해 완충액 3ml를 추가하고 골수를 다시 부유시키기 위해 부드럽게 피펫을 주입합니다.그런 다음 원심분리기 튜브를 얼음 위에 8분 동안 올려 놓고 적혈구를 용해시킵니다. 8분 후, 6ml의 알파-MEM을 원심분리기 튜브에 주입하여 세포 용해를 멈춥니다. 800g과 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡인합니다.그런 다음 3 밀리리터의 알파 -MEM 배양 배지에 재현탁하고 세포를 6 웰 플레이트에 놓습니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이 단계에서는 상등액을 15ml 원심분리 튜브로 옮겨 다음날 아침에 부착되지 않은 세포를 수집합니다.그 후, 800g과 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 4 밀리리터의 알파 -MEM 배양 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 20마이크로리터의 세포 용액을 20마이크로리터의 트리판 블루와 섞습니다.그런 다음 혼합물 10마이크로리터를 계수 챔버에 추가하고 용액 밀리리터당 세포 수를 얻습니다. 그 후, 적절한 부피의 알파 -MEM 배양 배지를 첨가하여 밀리리터 당 500, 000 세포의 세포 용액을 얻습니다. 다음으로, 500마이크로리터 및 50마이크로리터의 골수 대식세포 유도 배지를 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.그런 다음 500마이크로리터 및 50마이크로리터의 셀 용액을 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 3일 동안 배양합니다. 도금 3일 후 96웰 플레이트의 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 수집하고 섭씨 영하 20도에서 동결합니다.그런 다음 잔류 매체를 흡인합니다. 1밀리리터 및 100마이크로리터의 파골세포 유도 배지를 각각 24웰 플레이트와 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 이틀 동안 배양합니다.이틀 후 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 수집하고 잔류 배지를 흡인합니다. 그런 다음 각 웰에 파골세포 유도 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 하루 동안 배양합니다. 파골세포가 형성된 후 96웰 플레이트의 각 웰에서 50마이크로리터의 배지를 수집합니다.이 단계에서 배지를 흡인하고 1X PBS로 샘플을 부드럽게 세 번 세척합니다. 다음으로, 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 셀을 100마이크로리터의 고정 용액으로 실온에서 30초 동안 고정합니다. 고정 후 고정 용액을 흡인하고 섭씨 37도로 예열된 탈이온수로 세포를 부드럽게 3회 세척합니다.그런 다음 탈이온수를 흡인하고 100웰 플레이트의 각 웰에 96마이크로리터의 TRAP 염색을 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 놓고 빛을 차단합니다. 염색 후 TRAP 얼룩을 흡인하고 탈이온수로 3회 부드럽게 씻어냅니다.그런 다음 도립 현미경에서 40X 배율로 파골세포를 이미지화합니다. 그런 다음 이전에 수집된 배지 30마이크로리터를 새 96웰 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 96-웰 플레이트의 각 웰에 90마이크로리터의 기질 혼합물을 추가합니다.접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 놓고 빛을 차단합니다. 한 시간 후, 30마이크로리터의 3몰 수산화나트륨을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 EnVision Multilabel Plate Reader로 405나노미터 파장에서 흡광도를 측정합니다.다음은 6일째 brightfield에서 관찰된 파골세포의 대표적인 모습입니다. 빨간 선은 파골세포의 경계를 나타냈다. 그리고 여기에 보이는 것은 전형적으로 거대하고, 다핵을 가진 TRAP-양성 파골세포입니다.검은색 화살표는 다핵 파골세포의 두 핵을 나타냅니다. 이 그림은 6일째 BMM의 TRAP 염색을 보여줍니다. 야생형 및 Ctsk-Cre Raptor 녹아웃 그룹의 사각형의 고배율 이미지가 각각 표시됩니다.이들은 야생형 그룹에 비해 Ctsk-Cre Raptor 녹아웃 BMM에서 형성된 덜 거대하고 TRAP 양성 파골세포였습니다. 이 그림은 배양 야생형 및 Ctsk-Cre Raptor 녹아웃 BMM의 TRAP 활성을 보여줍니다. 이 기술은 일단 숙달되면 제대로 수행되면 일주일 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안에는 생존 가능한 골수 대식세포의 최적 파종 밀도가 중요하므로 골수 대식세포의 생존력을 유지하는 것이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 뼈를 얼음 위에 1시간 이상 두지 말고 세포를 부드럽게 다시 부유시키는 것이 좋습니다. 이 절차는 뼈 절편을 사용한 파골세포 흡수 분석과 같은 다른 방법과 결합하여 파골세포의 정상 및 병리학적 생리학을 연구할 수 있습니다.이 방법을 통해 mTORC1이 파골세포 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었으며, 이는 향후 골다공증과 같은 뼈 대사 질환 치료를 위한 잠재적인 약리학적 표적으로 작용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

레티노 산으로 기본 마우스 조골 세포의 치료는 골 세포의 형태 학적 및 분자 기능 베어링 분지 세포의 균일 한 인구를 생산하고 있습니다. 방법은 획득 및 배양 주 골 세포를 유지의 어려움을 극복하고, 형질 전환 모델 유래 세포를 연구하는 것이 유리할 수있다.

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

전구세포의 파골세포로의 분화는 사이토카인과 성장인자에 의해 조절됩니다. 여기에서는 사이토카인이 파골세포형성에 미치는 영향을 연구하는 방법으로서 in vivo에서 파골세포를 파골세포로 분화하기 위한 새로운 유전자 전달 기술과 전구세포를 in vitro에서 파골세포로 분화하기 위한 세포 배양 프로토콜에 대해 설명합니다.

소설 생체 유전자 전달 기술과 시험관 셀 기반 분석 실험

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

노치 신호는 세포 간의 직접 접촉에 의존하는 셀룰러 통신의 한 형태입니다. 체외에서 Notch 신호를 적절하게 유도하려면 Notch 리간드를 고정된 상태의 세포에 제공해야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 파골세포 전구체에서 Notch 신호의 체외 자극 방법을 설명합니다.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

이 프로토콜은 생체 내에서 골세포 활성을 제어하는 중요한 유전자를 이해하는 정식 방법을 설명합니다. 이 방법은 형질 형형과 일부 표준 기술을 사용하여 골격 표현형을 분석합니다.

조건부 Stat3 삭제 마우스 모델의 골격 표현형 분석

여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

배우세요 마우스 골수에서 파골세포를 분리 배양하고 mTORC1이 파골세포 형성에 미치는 역할을 연구하는 방법을. 이 기술은 일주일 내에 대량의 거대 파골세포를 생성하여 골다공증 치료 연구에 활용됩니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

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