세포 표면 비오틴일화 분석

비오틴을 곁들인 세포 표면 단백질의 라벨링은 막 단백질 조절에 관여하는 세포 수송 경로를 연구하는 강력한 도구를 제시합니다. 세포는 표면에 단백질의 단단히 통제된 세트를 유지합니다, 그래서 수신하고 몇몇 신호 통로를 통해 세포외 정보에 반응할 수 있습니다. 내분비증, 침몰의 과정, 그들의 내면화를 일으키는 원인이 되 면 이러한 세포 표면 단백질의 조절에 관여 하는 것이 좋습니다. 따라서 비오틴과 같은 제제로 내분비작용제되기 전에 이러한 단백질을 라벨링하면 과학자들이 내면화를 정량화하고 세포 경로에서 자신의 역할을 연구할 수 있습니다.

이 비디오에서는 세포 표면 생물자극 성 소의 원리와 방법론에 대해 논의하고 과학자들이 오늘날이 방법을 적응시키는 몇 가지 방법을 모색 할 것입니다.

먼저 세포 표면 생물자극 분석의 원리를 검토해 봅시다.

앞에서 언급했듯이, 세포는 실시성 경로를 사용하여 표면 단백질의 현면 밀도 및 분포를 조절합니다. 내화 된 단백질은 특정 세포 경로를 통해 운반되며, 그 다음에는 분해를 위해 리소좀으로 피하거나 지속적인 활성을 위해 세포 표면으로 다시 재활용 될 수 있습니다. 세포 표면 생물학적 재화는 이러한 공정을 측정하도록 설계되었습니다.

이 분석, 비오틴 (비타민 H라고도 함)에 사용되는 태그는 작고 수용성 분자입니다. 표면 라벨링 실험을 위해 일반적으로 사용되는 비오틴 유도체는 설포 군, N-하이드록시 수치니미드 에스테르 군, 이설화물 결합 및 물론 비오틴으로 구성된 sulfo-NHS-SS-biotin입니다. 비오틴을 문자 "B"로 대체하여 이 거대한 구조를 단순화합시다.

이 구조의 sulfo 그룹은 바이오틴 멤브레인의 이 형태를 무의미하게 만드는 강력한 전하를 부여합니다. 세포 표면 단백질의 라벨링은 내분비증에 제한적인 온도에서 유지되는 세포에 설포-NHS-SS-비오틴을 첨가함으로써 수행됩니다. NHS 그룹은 표면 단백질에 1 차적인 아민과 반응하여 공유 결합을 형성합니다.

그런 다음, 표지된 세포는 내분비증에 허용되는 온도로 이동하며, 그 동안 일부 표지된 단백질은 내면화될 것이다. 마지막으로, 세포는 내분비증을 멈추기 위해 제한 온도로 다시 이동됩니다. 내재화된 단백질을 구체적으로 정량화하기 위해 L-글루타티온과 같은 친수성 멤브레인 불굴의 감소제가 추가됩니다. 이것은 endocytosed 설포-NHS-SS 비오틴에 이황화물 결합과 반응하고, 비오틴 그룹을 갈라. 이 시점에서, 남아 있는 biotinylated 단백질은 그 레이블이 이전에 내면화되었기 때문에 감소 에이전트에서 보호된 사람들입니다.

세포는 그 때 lysed되고, 내분비성 biotinylated 단백질은 정량화될 수 있는 단정화될 수 있습니다. 격리는 일반적으로 연쇄타비딘으로 코팅 합성 구슬에 세포 lysates를 추가하여 수행됩니다. 스트렙타비딘은 비오틴에 대한 매우 높은 친화력을 가지고 있기 때문에, 바이오티니지 단백질은 코팅 된 구슬에 자신을 부착합니다. 오염된 단백질을 제거하기 위한 일련의 세척 단계와 마지막으로 용출 단계는 결합된 단백질을 방출하기 위해 수행됩니다. 표적 단백질은 서양 블로팅과 같은 기술에 의해 분석될 수 있습니다.

지금부터 당신은 생체 자극 분석의 뒤에 개념을 알고, 표면 단백질의 내분비증을 측정하기 위해이 절차를 수행하는 방법을 보여주는 일반화 된 프로토콜을 살펴 보자.

4°C로 냉각된 배양 된 세포로 시작합니다. 내분비증에 제한되는 온도를 유지하기 위해 얼음위에 놓습니다. 다음으로, 막 불투과성 설포-NHS-SS-비오틴 시약이 첨가되고, 세포는 약 30분 동안 어둠 속에서 배양된다. 이를 통해 비오틴 라벨이 표면 단백질에 공유적으로 부착할 수 있는 충분한 시간을 할수 있습니다. 그런 다음 세포는 얼음에서 제거되고 약 30 분 동안 37 ° C에서 배양됩니다. 이 온도에서 생체 화 표면 단백질은 내분비화됩니다. 인큐베이션에 이어, 세포는 4°C로 냉각되고 L-글루타티온과 같은 친수성 감소제가 첨가됩니다. 이것은 이황화 결합과 반응하고 표지된, endocytosed 단백질에서 비오틴 단을 풀어 놓습니다.

다음으로, 세포는 원심분리에 의해 lysed, 따라서 세포막을 깨고 생물자극성 단백질을 노출합니다. 이에 따라, 리스는 스트렙타비딘 코팅 구슬에 첨가되고 생물화 단백질은 결합할 수 있습니다. 구슬은 차가운 인산염 완충식식염으로 세척하고 세제및 환원제를 포함하는 완충제로 용출됩니다. 이러한 시약은 비드 떨어져 단백질을 결합하고 용황에서 그들의 회복을 가능하게 합니다. 용루에 있는 단백질은 젤 전기포고증에 의하여 그들의 분자 질량에 근거를 두어 분리됩니다. 마지막으로, 단백질 특이적 항체를 가진 blot의 서양 블로팅 및 프로빙은 표적 단백질의 시각화를 허용합니다. 백분율 내세포 단백질은 결과 밴드 밀도로부터 정량화될 수 있다.

이제 세포 생물자극제의 방법론을 이해하게 되었으므로 특정 실험에서 어떻게 사용되는지 살펴보겠습니다.

이 생체 자극 프로토콜의 가장 일반적인 적용은 특정 세포 표면 단백질의 내분비 속도를 측정하는 것입니다. 여기, 과학자들은 도파민 수송기 또는 DAT의 내면화를 평가하는 데 관심이 있었다. 표준 프로토콜을 따라 과학자들은 내분비성 DA의 비율을 측정할 수 있었습니다. 이는 내화 전에 단백질의 "총" 양에 대응하는 레인 T를 나타내는 대표적인 면역블롯이며, 레인 S는 세포가 내분비증을 통해 진행되지 는 않았지만 감소제로 처리된 "박탈" 샘플에 대한 것이며, 차선 나는 "내면화" 단백질의 결과를 나타낸다.

과학자들은 표면 단백질의 내분비증을 측정하는 것 외에도 이 과정에 대한 약물의 영향을 검사합니다. 이 연구에서, 연구원은 단백질 키나아제 C (PKC)의 활성화기를 가진 처리에 응하여 DAT의 표면 조밀도를 평가했습니다, 누구의 행동은 DAT 내산화를 유도하기 위하여 건의되었습니다. 과학자들은 마우스 뇌 조직에 대한 전 생체 분석에서 사용하기 위해 체외 생체 자극 프로토콜을 적용하여 이를 확인했습니다. 데이터는 PKC 활성화에 응하여 세포막에서 DAT의 대략 30% 손실을 밝혔습니다.

마지막으로, 생물학적 분석서를 조정함으로써 과학자들은 막 단백질의 재활용을 측정할 수도 있습니다. 여기서, 연구원은 염화물 이온을 전하기위한 책임이 표면 채널 단백질, CFTR을 조사하고 있었다. 재활용을 평가하기 위해 연구원은 한 세포 그룹에서 표준 생체 자극 프로토콜을 수행하고, 비내세포 표면 단백질에서 비오틴을 떠난 후 단계를 추가하여 두 번째 세포 그룹에 대한 프로토콜을 수정했습니다. 이러한 추가 단계는 내부화 된 비오틴 태그 수용체 단백질의 일부를 재활용 할 수 있도록 다시 37 °C로 온도를 올리는 것을 포함했다. 재활용 전후에 내부화된 단백질의 차이를 계산함으로써, 이들 과학자들은 암막으로 재활용된 CFTR%를 정량화할 수 있었습니다.

당신은 방금 세포 표면 생물 자극 분석에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 비디오는 이 분석의 절차 단계를 설명하고 각 단계에서 발생하는 반응을 설명했습니다. 마지막으로, 우리는이 방법의 적용가능성을 보여 준 몇 가지 예제 실험을 탐구했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!