Name: 중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 학습하세요 중첩 PCR을 이용한 진드기 내 Borrelia burgdorferi 검출 방법을. OspA와 FlaB 유전자를 표적으로 한 이 기술은 라임병 감시와 위험 지역 식별에 필수적인 민감하고 특이적인 분자 도구입니다.

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뇌관 디자인을 위해 카 미 해리스, 애슐리 McKibbon 촬영, 제시카 토마스 Ebbett 죤 Blakely, 알렉산드라 폴 리-Eby, 크리스 랭 글 리, 줄리 루이스, 켈 시 매 킨 타이어, 애슐리 McKibbon, 크리스 하느님, 그리고로 지에 대 한 개 감사 하고자 하는 저자는 비디오입니다. A. M. K. 캐나다 라임 질병 연구 재단에 의해 지원 되었다 그리고 프로젝트 자금 자연과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 제공 했다. M. K. B. W. 급여 자금 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단 (NBIF)에서 받았다.

1. DNA 별개로 틱
<ol><li>필드 컬렉션, 또는 수 의사와 공중의 구성원에서 수동 감시를 통해 진드기를 취득 합니다. 틱 해야 동결에 의해 살해, 봉인된 된 봉투에 배치 되며 실 온에서 발송.<ol>
<li>제출 양식을 사용 하 여, 날짜와 만남, 틱 부착 상태, 호스트 종, 및 호스트의 최근 여행 역사의 지리적 위치에 대 한 정보를 수집 합니다.</li>
		<li>중첩된 한 PCR 본질적으로 오염에 취약 한 이기 때문에, 실험실 작업 샘플의 크로스-노출을 최소화 하기 위해 설정 되어 확인 합니다. 이 프로토콜의 다른 요소를 철저 하 게 청소 하 고 소독, 서로 잘 분리 별도, 전용 공간에서 실행을 포함 하 고 모든 계측을 보장 하는 것은 오염 물질의 무료.</li>
		<li>시료를 받으면 진드기 사진 하 고 식별 키32 종, 발달 단계, 섹스, 그리고 engorgement 상태를 비교 하 여 결정 합니다.</li>
		<li>무 균 조건 하에서 무 균 면도날 또는 메스를 사용 하 여 눈금을 이등분 고 두 틱 조각 별도 microcentrifuge 관 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 DNA 추출, PCR 호환 서식 파일;을 생성 하 어떤 격리 절차 사용 하 여 이 프로토콜에서는 간단한 chelation 기반 접근 방식을 보여 줍니다.<ol>
<li>진드기 파편 용균성 킬레이트 시 약의 (수시로 50-200 µ L) 사이의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 시작 합니다. 구체적인 금액 표본 크기와 engorgement 상태;에 따라 달라 집니다. 지침 서는 제조 업체에 의해 제공 되어야 한다. 균질 microtube 방 앗 공이 사용 하 여.</li>
		<li>짧게 45 분, 그리고 소용돌이 60 ° C에서 물 욕조에 샘플을 품 어.</li>
		<li>데스크톱 microcentrifuge에서 16,276 x g (13300 rpm)에서 4 분에 대 한 샘플을 원심.</li>
		<li>50 µ L 소 프로 파 놀, 반전, 그리고 다시 (1.2.3)에서 원심에 의해 혼합을 포함 하는 신선한, 레이블이 microtube 상쾌한 전송.</li>
		<li>상쾌한, 가만히 따르다와 DNA 펠 릿의 70% 에탄올 50 µ L와 린스.</li>
		<li>초과 에탄올을 피 펫을 제거 하 고 실 온에서 15 분 동안 건조를 펠 릿을 허용.</li>
		<li>Resuspend DNA, 1 mM Tris pH 7.0의 50 µ L을 추가 하 고 60 ° c.에 1 시간을 위한 물 욕조에 샘플을 품 어 DNA는 이제 미래 분자 분석-20 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 중첩 된 PCR Borrelia OspA FlaB의 탐지.
참고: 일반적인 PCR 원칙 및 관행에 대 한 개요는 로렌스, 201233에 의해 제공 됩니다.
<ol><li>합성 또는 보렐 리아 유전자 특정 외부 및 내부 oligonucleotide 뇌관을 얻을. 뇌관 세트, 그들의 각각 amplicon 크기, 및 녹는 온도 대 한 표 1 을 참조 하십시오.</li>
</ol><table border="1"><tbody>
<tr>
<td>뇌관 이름</td>
			<td>진 대상</td>
			<td colspan="2">시퀀스 (5'-3')</td>
			<td>Amplicon 크기</td>
			<td>어 닐 링 온도</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw 아웃 flaB</td>
			<td>군살</td>
			<td colspan="2">gcatcactttcagggtctca</td>
			<td rowspan="2">503 혈압</td>
			<td rowspan="2">55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv가 밖으로 군살</td>
			<td>군살</td>
			<td colspan="2">tggggaacttgattagcctg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw에 flaB</td>
			<td>군살</td>
			<td colspan="2">ctttaagagttcatgttggag</td>
			<td rowspan="2">447 혈압</td>
			<td rowspan="2">58 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rv에 flaB</td>
			<td>군살</td>
			<td colspan="2">tcattgccattgcagattgt</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA 아웃 Fw</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">cttgaagttttcaaagaagat</td>
			<td rowspan="2">487 혈압</td>
			<td rowspan="2">55 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA 아웃 Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">caactgctgacccctctaat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fw에 OspA</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">acaagagcagacggaaccag</td>
			<td rowspan="2">350 혈압</td>
			<td rowspan="2">58 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>OspA Rv</td>
			<td>OspA</td>
			<td colspan="2">ttggtgccatttgagtcgta</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 내부 및 외부 뇌관 Borrelia burgdorferiFlaB 및 OspA nPCR에 대 한. 실제로, FlaB 뇌관 B. burgdorferi s.s. 등 밀접 한 보렐 리아 genospecies OspA 뇌관만 B. burgdorferi s.s. 캡처 동안 감지 두 loci에서 증폭 B. 나타냅니다 burgdorferi. s.s.
<ol start="2"><li>미리 소독 UV 빛과 70% 에탄올과 PCR 캐비닛. 참고: 잠재적인 샘플 오염을 최소화 하려면이 작업 한다 틱 해 부, DNA 추출의 위치에서 되며 젤 전기 이동 법.<ol>
<li>초기 PCR 실행에 대 한 외부 뇌관을 사용 하 여 DNA 1.0, 위의 단계에서 복구 하 고 반응 혼합물 표 2에 설명 된 대로 템플릿와 함께. 동시에 긍정적인 제어 실행 확인된 보렐 리아 DNA의 구성 하 고 부정적인 제어 없음 템플릿 반응 시 약 및에 어로 졸 오염 감지를 포함 하 여 실행을 수행 합니다. 시 약의 잠재적인 오염을 최소화 하기 위해 끝에 DNA를 추가 합니다. 각 튜브 시 약의 추가 되지 및 DNA 추가 후 즉시 및 다른 튜브 열 전에 튜브를 닫을 때 항상 모든 닫힌 확인 하십시오.</li>
		<li>다음과 같이 열 cycler 프로그램: 95 ° C 5 분; 15 95 ° C의 40 주기 어 닐 링 온도 30 s s, 45 72 ° C s; 72 ° C 5 분; 4 ° c.에서 개최</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 µ L의 첫 번째 PCR 제품 (2.2.2에서 생산)와 내부 뇌관을 사용 하 여 제외 하 고 첫 번째 반응에 유사한 PCR의 두번째 라운드를 수행 합니다. 참고: 반응 볼륨 다시 표 2에 제공 됩니다. 서식 파일 DNA 마지막 추가 되 고 한 번에 하나의 샘플에 해당 하는 관은 오픈 함으로써 amplicons의 교차 오염을 방지 하려면 주의 해야 합니다. 
	 
	<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
				<td>PCR # 1 볼륨</td>
				<td>PCR # 2 볼륨</td>
			</tr>
<tr>
<td>Taq 중 합 효소 마스터 믹스 2 X</td>
				<td>12.5 Μ L</td>
				<td>12.5 Μ L</td>
			</tr>
<tr>
<td>Nuclease 무료 물</td>
				<td>8.5 Μ L</td>
				<td>8.5 Μ L</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 µ M 앞으로 반전 뇌관</td>
				<td>1.0 µ L 외부 뇌관</td>
				<td>1.0 µ L 내부 뇌관</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA 템플렛</td>
				<td>샘플 추출 (1.2.7)에서 2.0 µ L</td>
				<td>PCR (2.2.2)의 1 라운드에서 2.0 µ L</td>
			</tr>
</tbody></table>
표 2: 첫 번째 및 두 번째 확대에 대 한 PCR 반응 혼합물. 
	 
	<ol>
<li>이전, 열 cycler 프로그램 하지만 내부 뇌관 (표 1 참조)에 맞게 어 닐 링 온도 조정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agarose 젤 전기 이동 법 및 이미징
참고: 기본 DNA 전기 이동 법으로 분리, 참조 리 외. 2012,34.
<ol><li>20 X SB 버퍼 (0.2 M NaOH, 0.8 M 붕 소의 산 성 pH 8), 1 X, 희석을 사용 하 여 1.2 %agarose 젤 준비 하 고 바란다면 미리 젤의 얼룩은 따르고, 전에 DNA 얼룩의 약 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 µ L의 각 실험에서 두 번째 (내부) PCR 반응에서 제품 및 제어 샘플 100 bp 사다리 (5 µ L)와 함께 로드 합니다.<ol>
<li>107에서 1 h electrophorese V (5V/cm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>보기 및 문서는 transilluminator와 연결 된 카메라와 소프트웨어를 사용 하 여 젤.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

사용의 년간 PCR 기반 기술을 일관 되 게 입증 Borrelia 의 검출에 그들의 가치 arthropod와 포유류 표본에서 보렐 리아 환경 또는 임상에서 온 여부. PCR 감시를 기존의 방법 많은 개선을 제공합니다. 특히, 그것은 개발 및 항 체 시 약의 성능에 의존 하 고 대신 적용할 수 있습니다 쉽게 단순히 뇌관 시퀀스를 수정 하 여 관심의 새로운 목표를 검출 하기. 독립적으로 또는 다중 반응을 통해 PCR는 또한 동시에 여러 개의 loci의 평가 수용 한다. 그것은 신선 하 고 보관 된 틱22, 동물 또는 인간의 체액 및 절제 조직25를 포함 하 여 다양 한 표본 입력에 적용할 수 있습니다. PCR amplicons 처리할 수 있는 추가, 예를 들면 금지 효소 소화, 프로브 교 잡, 또는 시퀀싱, 미생물 정체성21에 증가 된 통찰력을 제공 하 여 생성 됩니다.
임상 도구로 PCR 바람직합니다 개념적으로 표준 혈 청 학적인 진단에 감염의 보조 수단으로 호스트 면역 반응에 의존 하는 것 보다는 세균 존재의 직접적인 표시를 제공 합니다. 그러나, 라임 borreliosis 상대적으로 겸손 한 미생물 부담으로 연결 됩니다 (< 소변 또는 플라즈마의 50 생물/mL) 및 false 네거티브를 야기할 수 있는 일시적인 spirochetemia 결과25. 병원에서이 기법의 감도 조직 유형, 감염, 및 샘플 상태의 단계 12.5%와 혈액, 중추 신 경계, 그리고 biopsied 조직36의 기존 연구에서 62% 사이 떨어지는 상당히 다릅니다. 그러나 분자 감도 제한 되지 않습니다 우려 PCR은 세균성 문화, 이후 착수 하는 경우 복구 가능한 나 선상 세균의 임상 표본에서 마찬가지로 어려운 입증 했다. 최근에 프로토콜 높은 수익률35에 대 한 최적화 되었습니다. 한편, 감염된 된 성인 진드기의 용기 수 항구 평균 어디 2000에서 50000 이상의 보렐 리아37,38,39, 단단하게 nPCR의 감지 범위 내에서입니다. 따라서, 프로토콜은 틱 감시 활동에 적합 합니다.
그 많은 장점에도 불구 하 고 특정 도전과 정확 하 게 보고 진드기 감염 따라서 유전자 그리고 amplicons, 품질 DNA를 복구 하는 세심 한 실험 워크플로의 전략적 선택에 따라이 기술 수 nPCR 포즈지 않습니다. 크로스-노출의 샘플, 그리고 실험실 환경 및 시 약에서 오염 물질을 보고할 수 있는 적절 한 컨트롤의 사용을 최소화 하면서의 표본에서 어떤 실험에 앞서 범위와 조사 의도 정의 되어야 한다 명확 하 게 되도록 적절 한 유전 loci과 지역, 선택할 수 있습니다. 목적은 라임을 일으키는 보렐 리아 burgdorferi s.l. 복잡 한에 대 한 편견된 화면을 제공 하는, 모두 비슷한 선호도와 관련 된 긴장을 검출 하기 위하여 뇌관을 생성 해야 하 고 증폭 효율, 캡처 없이 무관 유기 체25. 새로운 뇌관 디자인 될 수 있다 고 평가 철에 비록 그들은 또한 유효성을 검사 해야 실험적으로 표준 참조에 대 한 뇌관 폭발40, 같은 소프트웨어 도구를 사용 하 여 새롭거나 샘플에 적용 되 고 전에 격리. DNA 추출 절차의 목표 혼합된 환경 샘플 (틱 homogenate)에서 그대로 미생물 서식 파일을 복구 하는 것입니다. PCR 진행 하기 전에 단계는 선택적 추출 된 DNA의 무결성을 평가 하는 것입니다. 또한, 병렬 반응 수 설정할 수 틱에 하우스키핑 유전자를 대상으로. 두 번째 방법은 반응 혼합물, 제공 하 고 증가 자신감을 부정적인 보렐 리아 반응 유기 체, 그리고 하지 억제 오염 물질의 존재 때문에 억제제의 존재를 나타낼 수도 있습니다.
중첩 된 PCR 방법의 감도 증가 거짓 양성 결과 생성 하는 잠재적인 오염 비용으로 온다. 틱 해 부 및 DNA 복구 동안 또는 외부 및 내부 증폭 반응을 설정 하는 과정 외 인 템플릿 샘플 소개 수 있습니다. 그것은 따라서 템플릿이나 amplicon 피하기 위해 PCR 위한 최상의 연습 프로토콜에 따라 특히 중요 한 교차 오염. 이 PCR 및 생물 안전 캐비닛에 독립적인 기류, 봉쇄와 별도 워크 스테이션의 사용을 포함 적절 한, 철저 한 화학 및 물리적 청소와 표면 및 시 약, 살 균 및 DNA 의 신중한 처리 41. 아니-템플릿 컨트롤은 또한 재고 시 약의 오염 식별에 중요 한. NPCR의 특정 취약점을 처리 하는 amplicon 발생 두 번째 PCR 선박에 첫 번째 반응의 제품을 전송 하는 경우입니다. 이후 대상 DNA 이미 긍정적인 샘플 지 수 농축 겪은,이 단계는 교차 오염을, 특히 경향이 그리고 단일 튜브 nPCR 프로토콜이이 한계를 우회 하도록 개발 되었습니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자를 위한 뇌관의 두 세트는 PCR31의 두 라운드 봉인 남아 있는 반응 관에 함께 추가 됩니다. 외부 및 내부 뇌관 쌍 외부 몇 증폭 템플릿의 내부 프라이 머에 대 한 금지는 높은 어 닐 링 온도에서 그런 열역학으로 고유 해야 합니다. 두 번째 라운드에서 어 닐 링 온도 내부 쌍에 맞게 낮 췄 다. 뿐만 아니라이 잠재적으로 혼란 단계를 무시, 그것은 또한 추가의 사용 방지 오염 측정31,42. 그러나,이 수정 일부 시험 감도 희생 수 있습니다. 접근 방식에는 샘플에 독립적으로 수행 하는 기술 복제의 수를 증가 가짜 감염을 식별 하 데 도움이 됩니다.
분자 기술, nPCR의 도입 이후 진화를 계속 하 고 이러한 새로운 접근 선택 이점이 원래 디자인을 제공 하는 금융 비용 증가에 불구 하 고. 마찬가지로 이름이 있듯이, 정량 PCR (정량 또는 진짜 시간 (RT)-PCR) 기존의 기법 자연43질적 동안 샘플, 병원 체의 열거에 대 한 수 있습니다. 정량의 감도가 비슷합니다 보도 nPCR38의 뇌관 특성28에 따라 변동 될 수 있지만. 기존의 TaqMan 프로브 대신 분자 비콘 (MB)를 사용 하 여 정량의 변화는 또한 임상 표본44,,4546에 보렐 리아 의 검출에 약속을 보여주었다. 그들의 독특한 보조 구조 때문 분자 비콘 보도 낮은 배경 형광 및 그로 인하여 제공 탁월한 감도47높은 합법적인 신호를 생성 합니다. 전 임상 평가 제안 하나, 10 나 선상 세균44,45사이 잠재적인 검출 임계값. 또한, 기술은 멀티플렉스 반응을 동시에 포유류 호스트 유전자44 및45의 다른 tick-borne 병원 균 감지는 nPCR과 같이 쉽게 달성에서 성공적으로 적용 되었다. 다른 디자인 수정 포함 표준 곡선39,48를 사용 하지 않고 DNA를 계량 수 방울 디지털 PCR (ddPCR) 기술. 보렐 리아 에 대 한이 기술의 낮은 검출 한계는 똑같이 약 10 나 선상 세균/샘플39이다. NPCR에 비해, 이러한 접근 또한 이점을 오염, 감소 잠재력의 그들은 단일 증폭 프로토콜을 필요로.
감시의 목적은 프로 틱의 다양 한 세균성 내용 대신 경우 16S rRNA metagenomic 심사는 매력적인 옵션49이다. 그것은 정확 하 게 더 많은 미생물의 광범위 한 스펙트럼을 캡처할 수 있습니다 있지만이 이렇게 costlier, 모든 분자 생물학 실험실에서 찾을 수 없는 특수 DNA 시퀀서 필요 필요로 보다 정교한 생물 정보학 기반 해석, 벡터의 병원 체 로드를 나타냅니다.
정량 및 그 유도체는 양적 응용 프로그램에 대 한 선택의 방법 metagenomics 화면 틱 미생물의 광범위 한 재고를 제공 하는 동안 대상된 감시 노력은 종종 염려의 유무의 이진 보고 벡터에 하나 또는 소수의 병원 이러한 상황에서이 최신, 더 정교한 접근 과정에 불필요 한 복잡성과 재정 부담이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, nPCR 틱 테스트에서 중추적인 기법으로 시간 시험을 성장 했다.

Lyme 질병 (LD), 북반구에서 가장 널리 퍼진 벡터 품 어진 감염 이며 그 발생률1증가 하 고. 이 쇠 약 질병은 라임 borreliosis (파운드) 복잡 한 (흔히 보렐 리아 burgdorferi sensu lato, 또는 s.l.), 역사적으로 지배적인 북미 병원 체, B. 구성의 spirocheteal 병원 균에 의해 발생 burgdorferi sensu stricto (s.s), B. afzelii 및 B. garinii, 유럽 및 아시아에 걸쳐 널리 고 신흥 임상 관련성2,3종의. 이 박테리아는 감염된 Ixodes 틱2. 의 바이트를 통해 인 간에 게 전달 주요 북미 벡터는 I. scapularis 그리고 I. pacificus, 항구 박테리아4전송 하이 속 내의 여러 종 발견 되었습니다. 인간에서는, B. burgdorferi 피부, 관절, 심장, 신 경계, 내 분 비 땀 샘, 위장, 그리고 내부 장기5,6,7에 영향을 미치는 multisystem 증상을 일으킬 수 있습니다. 8,,910. 질병 통제 및 예방 센터는 현재 미국11,12에서 매년 30만 이상의 새로운 인간의 경우를 견적 한다. 연구와 치료 후 증상이 계속 권장된 항생제 처방을 받은 환자의 60% 10% 사이 아무 데도 그 때 질병 진단 및 초기 단계에서 치료 예 후를 유리한 자주 동안 제안 정지, 현상에서 게시물 치료 Lyme 질병 증후군 (PTLDS)13,,1415되 나. 또한, 임상 개입에 지연 진드기 바이트의 인식, 초기 질병의 일반적인 프레 젠 테이 션 및 감염의 발병에서 사용 될 때 전통적인 혈 청 학 기반 진단의 낮은 감도의 부족으로 인해 발생할 수 있습니다. 신속 하 고 적절 하 게 치료 하지 않으면 합병증16,17를 점점 더 쇠 약에서 증명할 수 있는 증상 진행을 수 있습니다. Lyme 질병 예방은 따라서 리스크 관리의 초석입니다. 이 성장 위협에 대처 하기 위해 전략 틱, 병원 체 보급을 나타내는 강력한 감시 조치를 포함 하 고 관심사의 지리적 영역을 식별.
이 문서에서는 감염 된 진드기를 식별 하는 분자 검사 도구로 중첩된 연쇄 반응 (nPCR)의 유틸리티를 보여줍니다. 특이성을 높이기 위해 두 보렐 리아 유전자 병렬 증폭에 사용 됩니다. Flagellin B (군살) 편18의 주요 필 라 멘 트 단백질 인코딩하고 외부 표면 단백질 A (OspA)의 단백 제품 틱 midgut 중재 동안 단일 선형 염색체에 있는 유전자 식민, 플라스 미드로 인코딩된19,20. 워크플로 구성 틱 컬렉션, DNA 추출, 그리고 보렐 리아를 검출 하는 PCR의 초기 라운드-특정 loci. 이후 PCR 작고, 내부 증폭 조각을 생성 하 새 템플릿으로 첫 번째 반응의 제품을 사용 합니다. 진드기는으로 간주 긍정적인 보렐 리아 burgdorferi 때 두 보렐 리아 유전자에서 내부 amplicons agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검출 될 수 있다.
NPCR 기술 그리고 FlaB 및 OspA 유전자 대상, 널리 사용 된 생태 감시 및 초기 1990 년대21,,2223 이후 라임 spirochete의 임상 탐지 ,2425. 분자 프로토콜 개발, 이전 틱 subjecting 본질적인 내용을 안티-보렐 리아 면역 형광 검사 (면) 얼룩, 미생물 문화, 또는 조합을26평가 됐다. 이러한 접근 한계, 느린 성장 및 보렐 리아27, 항 체 성능 문제 및 IF 처리21라이브 틱의 요구의 까다로운 성격 등에서 고통. PCR 감염된 벡터의 빠른, 민감한, 그리고 특정 식별 제공 하기 위해 연속적으로 채택 되었다. 그것은 그렇지 않으면 될 하지 테스트21,22 적합 죽은 및 보관 된 틱 등 다양 한 견본 유형에 문화권 직접 응용 프로그램을 포함 한 전통적인 방법론 표시 된 개선 제안 . 중첩 된 실험적인 디자인 더 증폭25,28의 두 연속 라운드에서 유전자 특정 뇌관의 두 가지 세트를 채용 하 여 고전 PCR의 민감도와 특이성 향상.
실험 성공 비판적 amplicon 디자인과 전략적 유전자 선택에 따라 달라 집니다. 보렐 리아 burgdorferi의 존재를 정확 하 게 예측 하려면 뇌관 보렐 리아 속에 또한 회귀 열 나 선상 세균을 cross-reacting 없이 관련 병원 체를 탐지 해야 합니다. 군살, 경우이 특이성 유전자, 보다는 오히려 공유 하는 다양 한 박테리아 (그림 1)24,29 에 의해 상대적으로 보존된 측면에 서 시퀀스의 변수 내부 영역을 대상으로 이루어집니다. , 30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig1.jpg"> 그림 1: nPCR, 같이 사용 하 여의 개념 보렐 리아 FlaB 유전자를 대상으로. 유전자의 5'과 3' 테르미니가이 지역 라임을 일으키는 병원 체의 특정 평가 대 한 부적 절 한 렌더링 보렐 리아 burgdorferi s.l. 넘어 생물에 공통 됩니다. 덜 보존 인테리어 시퀀스를 사용 하 여 뇌관 대상으로, PCR의 2 라운드 최종, 내부 amplicon 검색 실행 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그들의 차별 능력의 시험에서 인테리어 FlaB 뇌관 80 개 이상의 다른 Borrelia 격리와 평가 되었고만 그 라임 병24와 관련 된 식별을 발견. NPCR의 낮은 검출 한계 문서화 되었습니다에서 624 사이의 순수한 문화에서 1031 박테리아 비록 감도 amplicon blotting 남쪽과 radiolabelled 교배 시키기에 의해 더욱 향상 시킬 수 있습니다 또는 chemiluminescent 프로브입니다. 커플링 기술 단일 spirochete31검출 임계값을 줄일 수 있습니다. 직접 비교 하 여 기존의 unprobed 단일 라운드 PCR 104 나 선상 세균31의 최소의 존재를 보고 발견 됐다. 그러나 그것은,, 복잡 한 환경 및 임상 샘플 없는 DNA 및 잠재적인 억제 물질의 압도적인 존재 때문에 작업할 때 분석 결과 감도 낮은 것 이다 주목 해야한다. 이러한 과제는 크게 nPCR의 사용에 의해 피할 수 있습니다.
지난 수십 년간에서 분자 기술 발전에 불구 하 고 nPCR 현대 감시 노력에 주식 기법을 남아 있습니다. 주의 디자인 및 실행이이 프로토콜의 경우 틱 벡터에 병원 체의 존재를 캡처, 적응력, 강력 하 고 비교적 간단 접근 이다.

<table><tbody><tr><td>LabGard Class II, Type A2 생물 안전 캐비닛</td><td>Nuaire</td><td>ES AIR NU-543&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>0.22 mm 두께</td></tr>의 <tr><td>마이크로퓨지 튜브 (마이크로튜브 1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>AquaGenomic&nbsp;</td><td>MultiTarget Pharmaceuticals</td><td>2030</td><td>DNA 추출 시약</td></tr><tr><td>마이크로튜브 유봉</td><td>Diamed</td><td>DIATEC610-1551</td><td>1.5ml 튜브용으로 설계</td></tr><tr><td>수조 - Isotemp 202</td><td>Fishse Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Labnet</td><td>S0100 CAN</td><td></td></tr><tr><td>Spectrafuge 24D 디지털 마이크로 원심분리기</td><td>Labnet</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 합성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO</td><td></td></tr><tr><td>PCR 캐비닛</td><td>Misonix</td><td>PCR6-482</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브(플랫 캡 포함) 0.2mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix 2x</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>물은 GTG</td></tr><tr><td>Spectrafuge Mini</td><td>Labnet</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration</td><td>EDVOTEK</td><td>608</td><td></td></tr><tr><td>Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose)</td><td>FroggaBio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>GD 100 bp DNA Ladder</td><td>FroggaBio</td><td>DM001-R500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 파워팩&nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR 105</td><td>EC Apparatus Corporation</td></tr><tr><td>Fluor-S MultiImager&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-7700 (일련 번호 433B0154)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 분석 소프트웨어 (V. 4.5.2)</td><td>BioRad</td><td>1709600</td><td></td></tr></tbody></table>

중첩된 한 pcr를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 burgdorferi, 감지

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme 질병 나 선상 세균 감염된 Ixodes 의 진드기에 물린 상처를 통해 인 간에 게 전송의 보렐 리아 burgdorferi sensu lato 가족에 의해 발생 한 심각한 벡터 품 어진 감염 이다. 북미 지역에서 1 차 etiological 대리인 보렐 리아 burgdorferi sensu stricto 이다. 지리적 위험 지역 확장, 그것은 진드기 감염 속도 측정 임상, 수 의사, 그리고 일반 대 중에 결과 전달할 수 있는 강력한 감시 프로그램을 지 원하는 것이 좋습니다. 중첩 된 중 합 효소 연쇄 반응 (nPCR)의 분자 기술을 오래이 목적을 위해 사용 되었습니다 그리고 그것 진드기와 야생 동물에 보렐 리아 의 검출에 중앙, 저렴 한, 그리고 강력한 접근 남아 있다.
이 문서에서는 감염된 표본 식별을 DNA 추출 틱 nPCR의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 두 개의 독립적인 B. burgdorferi 대상, 유전자 인코딩 Flagellin B (군살) 및 외부 표면 단백질 A (OspA), 이 기법으로 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 프로토콜 관련 틱 컬렉션, DNA 추출, 그리고 두 Borrelia의 각을 검출 하는 PCR의 초기 라운드-특정 loci. 이후 연쇄 반응 (PCR) 작고, 내부 증폭 조각을 생성 하 새 템플릿으로 첫 번째 반응의 제품을 사용 합니다. 중첩 된 접근 특이성 및 기존의 PCR의 민감도 향상 시킵니다. 틱 때 두 보렐 리아 유전자에서 내부 amplicons agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검출 될 수 있다 병원 체에 대 한 긍정적으로 간주 됩니다.

nPCR 복잡 한 환경 샘플 조사를 받고 있을 때 특히 특이성 및 병원 체 검출의 감도 증가 하는 우아한 접근 이다. 그림 1에서 같이, 보렐 리아 FlaB 로커 스 (및 OspA, 사진 안)의 전략적 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드 짧은 내부의 세대를 통해 보렐 리아 burgdorferi 박테리아의 존재를 보고할 수 있습니다. amplicons입니다. 젤 전기 이동 법으로 해결 하는 경우 각 틱에서 FlaB 와 OspA 반응 제품 시각적으로 득점 고 컨트롤에 대 한 비교. 그림 2를 독특한 견본 식별자 각 젤 상단의 제공 되며 노 템플릿과 졸 컨트롤 표시 됩니다 맨 왼쪽 및 오른쪽, 각각, 사다리에 인접 한.
강력한 amplicon 밴드 선택 실험 샘플에서 명확 하 게 볼 수 있습니다 그리고 그들은 쉽게 과잉 뇌관 및 잔여 DNA (그림 2)에서 고유. 명시 된 실험 설계 원칙에 따라, 진드기가 여겨진다 긍정적인 보렐 리아 때 부정적인 컨트롤 설명 없음 증폭, 및 내부 amplicons FlaB 와 OspA 뇌관에서 생산 됩니다에 병렬에 대 한. 이 경우에, T907, T604, 및 T606 표본 라임 병원 체 (그림 2)에 대 한 감시 기준을 만났다. By contrast, T923 OspA, 결과는 여러 가지 이유가 있다에 대 한 긍정적인만 했다: A) 원래 틱 보렐 리아에 대 한 부정적인 했지만 외부 또는 내부 OspA PCR 준비 가짜로 오염 된 서식 파일 DNA (참고 시 약의 전신 오염 부정적인 컨트롤을 통해 밖으로 지배 되었다), B) 진드기 수행 라임 보렐 리아, 하지만 낮은 템플릿 금액 또는 실험 오류 방지 FlaB또는 C의 증폭) 유기 체는 그 보존된 OspA 시퀀스를 포함 하지만 Flagellin 부족 또는 뇌관을 anneal 하 FlaB 의 대상된 지역에서 부족 정체성을 했다. 실제로, OspA 시퀀스 유사 생물, 식물 및 동물28등의 다양 한 지적 되었습니다. 대화 상황, 더 증폭 Flagellin 유전자, 하지만 하지 OspA 유전자 보존, 관련된 보렐 리아 종족을 나타낼 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜 FlaB 뇌관, 시나리오 'A'가 가장 가능성이 설명 제안 하는 것 보다 더 많은 OspA 단일 긍정적인 결과 생성 합니다. 그러나 논쟁 적인 견본의 추가 실험 분석, 없이, 아니다 단일 긍정적인 결과의 소스를 확인할 수 없습니다. 가짜로 이전 반응에 도입 된 어떤 오염 물질 보관 된 DNA에 존재 하지 않을 것 이다 이후 그들의 진정한 상태를 조정 하 모호 샘플에 수행 하는 기술 복제의 수를 증가 도움이 됩니다. 그러나, 이러한 뇌관으로 후속 반응 결정적인 결과 제공 하지, 다른 Borrelia loci PCR에 의해 조사 될 수 있습니다. 이 반응에서 생성 된 Amplicons 또한 시퀀싱 하 고 격리 id를 할당 하 고 스트레인 분기의 정도 추정 하 중 비교 수 있습니다. Sapi와 동료 인간의 임상 샘플35를 사용 하 여이 워크플로의 예를 제공 합니다.
모든 요인을 고려, 개요 프로토콜 및 해석 조건을 각각 0.0063%와 0.17%의 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금을 생성 견적 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56471/56471fig2.jpg"> 그림 2 :의 보렐 리아 burgdorferi nPCR의 의해 개별 틱 군살 그리고 OspA. 각 눈금에 할당 된 코드는 젤의 위쪽에 표시 되 고 정체성 각 표본에서 OspA FlaB 의 탐지를 보고 맞춤. 레인 (오른쪽 차선)는 실험실 환경 오염을 잡으려고 졸 컨트롤 이미지 대표 노-템플릿 컨트롤의 왼쪽에서 B를 받을 수 있습니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56471/56471fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

라임병은 스피로헤탈 병원균인 Borrelia burgdorferi sensu lato에 의해 발생하는 쇠약해지는 질병입니다. 이 박테리아는 감염된 진드기에 물린 것을 통해 인간에게 전염되며 피부, 관절, 심장 및 신경계에 영향을 줄 수 있는 다계통 증상을 유발합니다. 개 산책이나 하이킹과 같은 일상 활동은 사람들을 라임병에 걸릴 위험을 증가시킬 수 있습니다.따라서 이렇게 증가하는 위협에 대처하기 위한 전략에는 진드기의 병원체 유병률을 표시하고 우려되는 지리적 지역을 식별할 수 있는 강력한 감시 조치가 포함됩니다. 이 비디오는 Borrelia의 분자 스크리닝 도구로서 중첩 고분자 연쇄 반응의 유용성을 보여줍니다. 구체적으로 증가시키기 위해, 외부 표면 단백질 A와 편모 B 유전자 모두 증폭 대상입니다.워크플로우는 진드기 채취, DNA 추출, 그리고 Borrelia 특이적 유전자좌를 검출하기 위한 초기 PCR 라운드로 시작됩니다. 2차 PCR은 첫 번째 반응의 생성물을 새로운 템플릿으로 사용하여 더 작은 내부 증폭 단편을 생성합니다. 진드기는 두 Borrelia 유전자의 내부 앰플리콘이 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출될 수 있을 때 병원체에 대해 양성으로 간주됩니다.수동적 감시는 시민과 수의사의 도움을 받아 진드기를 수집하고 검사를 위해 제출합니다. 이 프로세스의 일환으로 진드기 숙주, 날짜 및 만남 위치와 같은 정보를 캡처하는 것이 중요합니다. 실험실에서는 먼저 진드기를 촬영하고 표준 키와의 형태학적 비교를 기반으로 식별해야 합니다.중첩 PCR의 민감도로 인해 이 기술은 오염에 취약하므로 시료 처리의 각 단계는 별도의 깨끗한 위치에서 이루어져야 하며 시약과 환경에 오염 물질이 없는지 확인하기 위해 여러 대조군을 포함해야 합니다. 작업 공간이 적절하게 준비되면 멸균된 생물 안전 캐비닛에서 진드기를 이등분하고 절반을 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. PCR 호환 템플릿을 생성하는 모든 DNA 분리 절차를 사용할 수 있습니다.이 동영상은 간단한 킬레이트 기반 DNA 추출을 보여줍니다. 먼저 진드기 단편의 크기에 따라 적절한 부피의 용해 킬레이트화 완충액을 추가하고 마이크로튜브 유봉을 사용하여 균질화합니다. 섭씨 60도의 수조에서 45분 동안 샘플을 배양하고 와류를 일으킨 다음 내용물을 원심분리합니다.기다리는 동안 50마이크로미터의 이소프로판올을 분취하여 각 검체에 대해 새로운 마이크로 원심분리 튜브를 준비합니다. 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 반전으로 혼합한 다음 이전과 같이 다시 원심분리합니다. 이번에는 상등액을 버리고 DNA 펠릿을 70 % 에탄올로 헹굽니다.피펫을 사용하여 잔류 액체를 제거하고 펠릿을 실온에서 15분 동안 자연 건조합니다. 마지막으로 각 펠릿에 50마이크로미터의 1밀리몰 트리스를 추가하고 60도 수조에서 1시간 동안 배양하여 DNA를 재현탁합니다. 이제 향후 분자 분석을 위해 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.자외선과 70% 에탄올을 사용하여 PCR 캐비닛을 살균하는 것으로 시작합니다. 반응 칵테일은 중합효소, 물, 정방향 및 역방향 외부 프라이머, 이전 절차에서 추출한 DNA를 포함하는 마스터 믹스로 구성됩니다. 각 진드기 검체에서 OspA 및 FlaB를 독립적으로 검출하기 위해 별도의 반응이 설정됩니다.샘플을 펄스 원심 분리하여 열 순환기에 넣고 기계를 프로그래밍합니다. 초기 PCR 실험은 긴 앰플리콘을 생성하는 유전자 특이적 외부 프라이머를 사용합니다. 그런 다음 첫 번째 반응의 PCR 산물은 후속 증폭을 위한 템플릿이 됩니다.이 중첩 PCR은 첫 번째 앰플리콘 내에서 어닐링되는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 새롭고 더 짧은 DNA 단편을 생성합니다. 두 번째 반응의 생성물은 이제 1.2% 아가로스 겔의 분자 질량 참조 사다리 옆에 로드하고 1시간 동안 전기영동할 수 있습니다. 마지막으로, transilluminator를 사용하여 겔을 봅니다.이 예에서 각 레인은 OspA와 FlaB 모두에 대해 분석된 다른 틱 표본을 나타냅니다. 앰플리콘은 일부 차선에만 존재합니다. 이 두 샘플은 모두 OspA에 대한 PCR 산물을 생성했지만 그 중 하나만 FlaB를 검출했습니다.샘플은 두 유전자 모두 양성으로 간주되기 위해 밴드를 생성해야 합니다. 따라서 PCR 산물의 육안 검사를 통해 각 진드기의 Borrelia 상태를 결정할 수 있습니다. 전반적으로 중첩 PCR은 Borrelia 감시에 적용할 수 있는 민감하고 특이적이며 비교적 간단한 기술입니다.이러한 이니셔티브에서 생성된 데이터는 라임병에 대한 지리적 우려 지역을 식별하고 자연에서 이 병원체의 유병률을 추정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

라임 질병 연구 조사는 종종 병원체 Borrelia burgdorferi, 일반적으로 몇 주 정도 소요 프로세스에 감염된 진드기의 생성을 필요로합니다. 여기 시간 이내에 수행할 수 있습니다 microinjection 기반 틱 감염 절차를 보여줍니다. 우리는 또한 진드기 이내 B. burgdorferi의 현장 지방화에 대한 immunofluorescence 방법을 보여줍니다.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

시험관 내 전사 분석은 Borreliella burgdorferi의 전사 조절 메커니즘을 해독할 수 있습니다. 이 프로토콜은 B. burgdorferi RNA 중합효소를 정제하고 시험관 내 전사 반응을 수행하는 단계를 설명합니다. 시험관 전사 분석을 사용하는 실험적 접근법은 활성 RNA 중합효소의 신뢰할 수 있는 정제 및 보관을 필요로 합니다.

Borreliella (Borrelia) burgdorferi의 필수 성분 In Vitro Transcription Assays

박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.

라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의  배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.

Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex 및 재발 발열 Borrelia의 Spirochetes 재배 방법

유럽과 북미에서 라임 보렐리아증을 유발하는 다양한 보렐리아 종의 여러 항원에 대해 유도된 IgG 및 IgM에 대한 혈청 샘플을 동시에 평가하는 비드 기반 다중 면역분석을 개발하기 위해 3채널 이중 리포터 형광 흐름 분석 시스템을 사용했습니다.

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

이 연구에서는 물 샘플의 세 가지 주요 clade에서 Leptospira 를 검출하도록 dot-blot 응용 프로그램을 설계했습니다. 이 방법을 사용하면 항-디곡시제닌 항체에 의해 쉽게 검출되는 디곡시제닌 표지 프로브에 의해 특이적으로 표적화된 최소 DNA 양을 식별할 수 있습니다. 이 접근 방식은 스크리닝 목적에 유용하고 만족스러운 도구입니다.

물 샘플에서 Leptospira 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응 및 점-블롯 혼성화

이 기사에서는 임상 연구를 위해 인간을 유충 Ixodes scapularis 에 노출시키는 방법을 제시합니다. 이 기술은 비교적 간단하고 연구 지원자가 견딜 수 있으며 실험적 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 인간 피험자를 대상으로 하는 이러한 연구는 해당 규제 당국이 승인한 임상 연구 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다.

유충 Ixodes scapularis 진드기에 대한 인간의 실험적 노출을 위한 모델

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써모 과학 솔라리스 qPCR 어세를 사용하여 정량 실시간 PCR

정량 실시간 PCR (qRT - PCR)은 다른 곤충의 조직 및 발달 단계에서 mRNA 수준을 진단하는 효과적인 도구입니다. 이 보고서에서 우리는 다른 애벌레 조직에서 확인할 mRNA 레벨 및 침입 곤충의 종, 에메랄드 애쉬 송곳의 발달 단계에 qRT - PCR의 사용을 보여줍니다.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

학습하세요 중첩 PCR을 이용한 진드기 내 Borrelia burgdorferi 검출 방법을. OspA와 FlaB 유전자를 표적으로 한 이 기술은 라임병 감시와 위험 지역 식별에 필수적인 민감하고 특이적인 분자 도구입니다.

중첩된 한 PCR를 사용 하 여 틱에서 라임 질병 스피로, 보렐 리아 Burgdorferi, 감지

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