고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아^{2 +} 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

이 실험의 전반적인 목표는 전기 자극에 의해 유도된 정상적인 부비동 리듬 및 심방 부정맥 동안 높은 시간적, 공간적 해상도로 쥐 심방에 대한 상세한 평가를 달성하는 것입니다. 이 방법은 유전적 돌연변이가 심방 부정맥에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 전기생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 심방 부정맥의 시작 및 유지 메커니즘에 초점을 맞춰 심방에서 정확한 광학 매핑을 얻을 수 있다는 것입니다.

관류 회로의 조립을 포함하여 설정된 Langendorff 장치에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 이미징 매개변수도 텍스트에 제공됩니다. 캐뉼레이션을 위해 마우스를 준비하려면 헤파린으로 처리하고 텍스트에 설명 된대로 마취하십시오.

진행하기 전에 반사 검사로 마취를 확인하십시오. 계속하려면 마우스를 작동 보드의 누운 위치에 고정하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 xiphoid 프로세스 수준 아래의 복벽을 엽니다.

다음으로 횡격막을 가로 절개하고 심장을 손상시키지 않고 내측 겨드랑이 라인의 갈비뼈 양쪽을 절단합니다. 그런 다음 인접한 혈관 및 조직과 함께 심장을 빠르게 절제합니다. 다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS 10ml로 심장을 씻고 주변 조직을 제거합니다.

그런 다음 상행 대동맥으로 관류 회로에 연결된 21 게이지 무딘 바늘의 끝을 삽입합니다. 입체경 아래에서 봉합사로 제자리에 고정하십시오. 이제 순수한 산소로 폭기된 Tyrode의 용액을 10분 동안 심장에 주입합니다.

관류하는 동안 관류 압력을 지속적으로 모니터링하십시오. 80에서 100mm 사이의 수은을 유지하십시오. 관류하는 동안 얇은 폴리에틸렌 튜브를 상대정맥에 삽입하고 봉합사를 사용하여 제자리에 고정합니다.

그런 다음 따뜻한 유리 챔버에 심장을 넣습니다. 챔버에 들어가면 심실 정점을 통과하여 24게이지 주거 바늘로 좌심실 구멍을 뚫어 심방 손상을 방지합니다. 그런 다음 내부 바늘을 제거하고 좌심실에 외부 캐뉼라를 남깁니다.

다음으로, 우심방을 자극하기 위해 상대정맥의 튜브를 통해 1-프렌치 맞춤형 사극 전극 카테터를 삽입합니다. 이제 심실 정점에 핀 전극을 삽입하여 핀 전극과 캐럴 바늘 사이의 양극성 심전도를 지속적으로 기록합니다. 전체 연구에서 심전도와 관류 압력을 지속적으로 모니터링합니다.

멤브레인 전압의 단일 기록을 위해 염색하려면 먼저 주변 조명을 최소화하십시오. 관류 용액 온도는 섭씨 37도로 유지되어야 합니다. 관류 경로를 통해 2-5분에 걸쳐 10ml의 얼룩을 전달합니다.

다음으로, 티로드의 용액을 5분 동안 관류하여 얼룩을 제거합니다. 관류 압력을 80mm에서 100mm 사이의 수은 사이로 유지하십시오. 다음으로, 관류 경로를 통해 희석된 블레비스타틴 1ml를 투여합니다.

심장 수축 제거를 확인합니다. 또한 심장이 균일하게 얼룩을 흡수했는지 확인하십시오. 계속하기 전에 페이싱 전극과 자극기를 설정하고 페이싱 임계값을 찾으십시오.

계속 진행하려면 관류된 심장에 커버 유리를 조심스럽게 씌워 심방 표면을 평평하게 하고 용액의 진동으로 인한 모션 아티팩트를 방지합니다. 아트리움이 커버 유리에 적절하게 부착되었는지 확인합니다. 이제 다양한 페이싱 연대를 평가할 수 있습니다.

일정 또는 버스트 페이싱의 경우 150밀리초 또는 고유한 리듬을 능가하지 않는 가장 긴 간격에서 시작하는 페이싱 간격으로 99비트를 제공합니다. 그런 다음 페이싱 간격을 5밀리초 단계씩 점진적으로 줄여 40밀리초까지 또는 간격이 심방을 자극하지 못할 때까지 줄입니다. 단일 추가 자극 페이싱의 경우 기본 드라이브의 페이싱 주기 길이를 설정하거나 120, 100 및 80밀리초와 같이 최소 3개의 S1에서 S1 간격을 테스트해야 하는 S1.At 설정합니다.

다음으로, 기본 사이클 길이에 대해 첫 번째 추가 자극 또는 S2를 음의 10밀리초로 설정하고 기본 드라이브의 마지막 페이싱 자극 후에 S2를 전달합니다. 점차적으로 S2가 심방의 탈분극에 실패할 때까지 S2의 결합 간격을 5밀리초 단계씩 점진적으로 줄입니다. 유효 불응 기간을 심방을 탈분극에 실패하는 가장 긴 S2 간격으로 결정합니다.

환자 역치 또는 유효 불응기를 결정할 때 심전도에서 페이싱을 관찰하여 심방 캡처를 확인하기 어려운 경우가 있습니다. 이러한 경우 광학 매핑을 사용하여 확인해야 합니다. 계속 진행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 심방 빈맥을 유도하기 위해 이중 및 삼중 추가 자극 페이싱을 적용합니다.

Langendorff 심장의 막 전압은 초당 10, 000 프레임으로 di-4-ANEPPs의 형광 신호를 모니터링하여 기록되었습니다. 우심방에서 전달되는 일정한 페이싱에 의해 활성화 맵을 얻었고 작은 쥐 심방의 상세한 전도 패턴을 분석할 수 있었습니다. RH237 및 Rhod2AM은 동일한 일정한 페이싱 프로토콜 동안 좌심방의 칼슘 과도 현상을 모니터링하는 데 사용되었습니다.

초당 1, 000 프레임으로 샘플링하는 것은 칼슘 과도현상의 활동 전위를 비교할 수 있을 만큼 충분히 빨랐습니다. 다음으로, 횡방향 대동맥 수축 시술 후 10일 후에 마우스에서 채취한 심장에서 심방 빈맥맥을 생성하여 심방에 압력 과부하를 가했습니다. 빈맥을 생성하기 위해 120에서 80밀리초까지 3중 추가 자극 페이싱이 사용되었으며 빈맥의 전파가 재진입 회로를 통과하는 것이 관찰되었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 심방의 전기생리학적 특성을 변경할 수 있는 손상이나 스트레스가 없도록 심방을 유지하는 것이 중요합니다.