미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

이 실험의 전반적인 목표는 미토콘드리아 유래 펩타이드로 자극된 세포와 관련된 다운스트림 신호 캐스케이드를 식별하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 유래 펩타이드 분야의 주요 질문(예: 어떤 신호 전달 경로가 관련되어 있는지, 어디에서 발생하는지)에 대한 답을 줄 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하며 비교적 수행하기 쉽다는 것입니다.

우리는 다운스트림 사실에 대한 제한된 정보를 제공하는 인간 매개 ERK 신호 전달을 조사했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. Subscale Kersher 방법은 인간 매개 신호의 역할에 대한 더 나은 아이디어를 제공했습니다. 3 일째에는 도금 및 세척 후 2 회 10 회에서 6 일째, SH-SY5Y 또는 HEK293 셀을 텍스트 프로토콜에 따라 사용합니다.

S14G 휴머닌 펩타이드를 영점 2미크론 여과된 증류수에 용해시킵니다. 그리고 이를 1밀리몰 스톡 용액으로 재구성합니다. 15ml 원뿔형 튜브에 미리 데워진 혈청 함유 또는 무혈청 배지를 부분 표본으로 추출하고 실온의 humanin 펩타이드 스톡 용액을 추가하여 작업 농도를 만듭니다.

즉시 세포의 배지를 6 밀리리터의 펩타이드 용액으로 교체하십시오. 그리고 적절한 시간 동안 세포를 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5ml에 플레이트에서 세포를 긁어냅니다. 그리고 셀 현탁액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. G의 500배와 섭씨 4도의 온도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분별 완충액에 다시 현탁시키고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 튜브를 G 250배, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 세포질 분획으로 수집하고 핵 분획을 위해 펠릿을 보관하십시오.

상층액을 원심 분리하여 세포 파편 및 기타 오염 물질을 18000배 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 제거합니다. 그런 다음 상등액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이것이 시티솔 분획입니다.

펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세척 버퍼에 다시 현탁시키고 용액을 G 250배, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵 추출 버퍼를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 얼음에서 샘플을 10 번 초음파 처리합니다.

샘플을 다시 원심분리하십시오. 그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 미토콘드리아 분획을 분리하려면 10cm의 접시에 담긴 세포를 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 사용하여 세척합니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 넣고 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 분리합니다. 세포 현탁액을 단일 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 G의 600배와 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.

PBS를 흡입하고 1ml의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 얼음 위에 폴리테트라플루오로에틸렌으로 코팅된 유봉을 사용하여 2밀리리터 균질화기를 25번 사용하여 세포를 균질화합니다. 균질액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 G 600배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 핵과 끊어지지 않은 세포를 제거합니다.

그런 다음 상층액을 수집하여 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 용액을 7000배 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액으로 다시 현탁시키고 용액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 G 7000회, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

세척을 반복한 후 15마이크로리터의 RIPA 버퍼를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시키고 10분 동안 얼음에서 현탁액을 배양합니다. 그런 다음 16000회 G와 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 미토콘드리아 분획인 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 따라 western blotting을 정량화하고 수행합니다. 이 비디오에서 시연된 절차를 사용하여 HEK293 및 SH-SY5Y 세포는 강력한 휴머닌 유사체인 100마이크로몰 S14 G 휴먼인으로 재처리되었습니다. 그리고 총 단백질 추출물로부터 테아닌 202, 티로신 204에서 ERK12의 총 및 인산화 형태를 분석하였다.

여기에서 볼 수 있듯이, S14G humanin 처리는 ERK12와 이를 조절하는 테아닌-202, 티로신-204 부위의 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다. S14G humanin 매개 ERK12 활성화의 표적을 이해하기 위해 S14G humanin 치료 후 총 및 인산화된 ERK12의 세포 내 국소화를 분석했습니다. 이러한 서부 블롯에서 볼 수 있듯이 HEK293 세포에서 인산화된 ERK는 세포질과 핵 모두에서 증가했지만 미토콘드리아에서는 증가하지 않았습니다.

그러나 SH-SY5Y 세포에서는 세포질 핵과 미토콘드리아에서 인산화된 ERK가 감소했습니다. S14G humanin-mediated ERK phosphorylation이 다른 세포 유형과 다른 조건에서 다른 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 일단 숙달되면 세포 핵 분별은 1시간 안에 완료할 수 있으며 미토콘드리아 분별은 적절하게 수행되면 1시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 샘플을 얼음 위에 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 신호 분자의 다운스트림 표적을 이해하기 위해 co-immunal precipitation 및 mass spectrometry를 포함한 다른 방법을 수행할 수 있습니다.