Name: 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 학습하세요 미토콘드리아 유래 펩타이드로 세포를 자극하고 인산화 단백질의 신호 전달 및 아세포 내 위치를 평가하는 방법을. 이 기법은 ERK 활성화 경로를 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 일 권, 노화 연구 프로그램에 엘리슨/멀리 박사 친교에 의해 지원 되었다 그리고 글렌 재단 수상 및 NIH PC에 부여 (1P01AG034906, 1R01GM 1R01ES 090311 020812). 모든 저자는 영화에 표시 됩니다.

1. 셀에 펩 티 드 치료 <ol><li>2 백만 SH-SY5Y 접시 또는 10 cm로 HEK293 세포 (2 x 10 6) 요리와 2 일 동안 그들을 성장</li> <li>(선택 사항) 다음 날, 셀 세럼 무료 Dulbecco 씻어 &#39; s 수정 매체 (DMEM) 미디어를 한 번 독수리 및 혈 청 치료 혈 청 무료 미디어에서 일을 해야 하는 경우 무료 DMEM 하룻밤 함께 품 어.</li>
	<li>3 일에 0.2 µ m 필터링, 증류수, 고 1 m m 재고 솔루션으로 그들을 다시 구성에서 S14G humanin 펩 티 드를 분해. 
	참고:는 펩 티 드 (예를 들어, 전체 충전) 펩 티 드의 시퀀스 특성에 의해 결정 될 수 있다 고는 펩 티 드 상업적으로 사용할 수 있는 경우는 제조 업체에 의해 제공 될 수 있습니다 적절 한 용 매에 녹아 해야 합니다. 예를 들어, S14G humanin, SHLP6, SHLP2, 및 태그 c 물에 용 해. Aliquot 동결을 방지 하 고 주기를 해빙 하는 적절 한 볼륨 (예를 들어, 50 μ)에서 펩 티 드. 일단 해 동, 사용 하지 않는 다시.</li>
	<li>미리 데워 진 혈 청 포함 약 수 또는 혈 청-무료 미디어 50 ml 원뿔 튜브 및 실내 온도 1 m m 재고 솔루션 작업 농도 (예를 들어, 1 µ M, 10 μ M)에 그것을 만들기 위해 추가.</li>
	<li>6 mL 펩 티 드 솔루션 단계 1.4에서에서 미디어 바꿉니다. 시간의 적절 한 금액에 대 한 셀을 품 어 고. 
	참고: 선택 ERK 활성화 상태에 따라 보육 시간.</li>
</ol> 2. Cytosol와 핵 subcellular 분별 <ol><li>얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 두 번 셀을 씻고, 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 ml에서 접시에서 셀 긁 고 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.</li>
	<li>4에서 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심 ° c.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운, 분별 버퍼의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 (10 mM HEPES pH 7.6, 3 m m MgCl 2, 10 m m KCl, 5% (v/v) 글리세롤 1% 비 이온 계면 활성 제 (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) = n), 효소/인산 가수분해 효소 억제제). 
	참고: 유지 하기 위해 단백질의 인 산화 상태에, 인산 가수분해 효소 억제 물 뿐만 아니라 프로 테아 제 억제 물 갓 추가 되어야 하 고 샘플 지켜져야 한다 얼음에 모든 시간. 동결과 해 동을 반복 샘플의 주기를 피해 야 한다. -80에 그들을 동결 하기 전에 작은 금액 (예: 50 μ g)으로 aliquot 샘플 ° c.</li>
	<li>다음 4에 5 분 동안 250 x g에서 원심 고 15 분 동안 얼음에 다시 일시 중단 된 펠 릿을 품 어 ° c.</li>
	<li>세포질 분수 상쾌한 수집 하 고 핵 부분을 위해 펠 릿을 유지.</li>
	<li>원심 18000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 다른 오염 물질과 세포 파편을 제거 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송에 상쾌한. 이것은 cytosol 분수.</li>
	<li>200 μ 차가운 워시 버퍼에 펠 릿을 resuspend (10 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 저 해제 =) 및 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한 제거 및 100 μ 얼음 처럼 차가운, 핵 추출 버퍼에 펠 릿을 resuspend (20 mM HEPES pH 7.6, 1.5 m m MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) 글리세롤, 0.2 m m EDTA, 효소/인산 가수분해 효소 억제제 =)와 10 번을 sonicate (5 초, 10 s , 30% 앰프.) 얼음에</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 핵 분수.</li>
	<li>계량 BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 금액</li></ol>
 3. 원유 미토 콘 드 리아 분수 <ol><li>얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL와 함께 각 10 cm 접시에 셀을 씻어 5 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS, 추가 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 분리. 
	참고: 서 럽에 대 한 미토 콘 드리 아의 좋은 수확량을 셀의 3 10 cm 요리 사용.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 한 15 ml 원뿔 튜브에 세 10 cm 요리에서 모든 결합.</li>
	<li>4 시 10 분 600 x g에서 세포를 원심 ° c.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 다시 얼음 처럼 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 1 mL에 펠 릿을 일시 중지 (10 mM Tris MOPS, pH를 조정 하는 1mm EGTA/트리 스, 자당, 200mm = 7.4).</li>
	<li>얼음에 소계 코팅된 유 봉과 2 mL 균질 화기의 25 선 셀 균질 
	참고:이 단계는 미토 콘 드 리아 무결성을 유지 하 고 미토 콘 드리 아 분수의 수익률을 극대화 하는 중요 한. 획 수는 각 세포 유형에 최적화 되어야 합니다. 절차를 시작 하기 전에 균질 화기를 쿨.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 핵 및 손상 되지 않은 세포 제거 하 4 ° C에서 10 분 600 x g에서 원심.</li>
	<li>는 상쾌한 수집 하 고 새로운 microcentrifuge 관에 그것을 전송 하 고, 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 원심 ° c. 
	참고: 펠 릿은 느슨한 관리와 함께 상쾌한을 수집 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않으려고.</li>
	<li>는 상쾌한을 제거, 다시 차가운 미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 200 μ와 펠 릿을 일시 중단 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브에 솔루션을 전송. 4에서 10 분 동안 7000 x g에서 튜브를 원심 ° c.</li>
	<li>반복 단계 3.8 펠 릿을 세척입니다. 이 단계에서 새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송할 필요는 없습니다.</li>
	<li>는 상쾌한 씻어 펠 릿에서 제거 하 고 다시 RIPA 버퍼의 50 μ와 미토 콘 드리 아를 포함 하는 펠 릿을 일시 중지.</li>
	<li>품 10 분에 대 한 얼음에 서 스 펜 션</li>
	<li>4에서 16000 x g 15 분 동안에 현 탁 액을 원심 ° c.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송. 이것은 미토 콘 드리 아 분수.</li>
	<li>BCA 분석 결과 사용 하 여 단백질 양을 계량.</li>
</ol> 4. 인 특정 단백질을 위한 서쪽 Blotting <ol><li>는 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (8-16% 들어찬 젤)를 수행 하 고 전송 단백질 PVDF 막 4.</li>
	<li>TBST에 5 %BSA 막 품 어 (0.1% 폴 20) 배경 비 특정 바인딩 사이트 차단에 실 온에서 30 분. 
	참고: phosphorylated 단백질 검출을 위한 BSA 하지 우유와 막을 차단 합니다. 우유 카 세 인, 높은 일반적인 신호는 풍부한 phosphoprotein 포함.</li>
	<li>하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 (안티-인-ERK1/2)와 막 품 어.</li>
	<li>다음 날 씻어 TBST 가진 멤브레인 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.</li>
	<li>품 어 실 온에서 1 h에 대 한 이차 항 체 (항 토끼 HRP)와 막.</li>
	<li>TBST 가진 막 세척 (0.1% 폴 20) 세 번 실 온에서 5 분.</li>
	<li>ECL 솔루션 막 품 어 및 이미지 분석기에서 막 이미지.</li>
	<li>스트립 스트립 실내 온도 및 세척 5 분에 대 한 세 번 TBST 가진 막에 15 분에 대 한 버퍼와 막</li>
	<li>4.2-4.7 안티 총 ERK1/2 항 체를 사용 하 여 단계를 반복.</li>
	<li>각 분수의 순도 확인, SDS 페이지를 실행 하 고 immunoblots (예: 핵, 미토 콘 드리 아에 대 한 TOM20 및 GAPDH cytosol에 대 한 대 한 Lamin B1) 각 구획에 대 한 마커를 인식 하는 항 체를 사용 하 여 수행.</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

느 코헨은 주주 및 CohBar, Inc. 켈빈 엔 CohBar, i n c.에 대 한 컨설턴트 역임 했다에 대 한 컨설턴트

여기, 우리가 보여주는 두 가지 서로 다른 세포 유형, 발생 하는 humanin 펩 티 드-중재 ERK1/2 활성화 및 활성화 ERK1/2의 subcellular 지 방화 (예를 들면, 펩 티 드, 시간 및 셀의 조건에 따라 다를 수 있습니다. 입력) 합니다. 그것은 보였다 그 humanin 두 개의 다른 수용 체22,23, humanin의 다른 복용량에 대 한 요구 사항 뿐 아니라 두 셀 라인 신호에 차이점을 설명할 수 통해 신호. 이의 생리 적인 의미 완벽 하 게 공부 하지 않은 하지만 그것은 하나의 가능한 메커니즘 HN 조직 종속 응답을 제안할 수 있습니다.
ERK1/2 신호에 중요 한 역할을 담당 하는 ERK1/2의 인 산화 그리고 ERK1/2의 인 산화 상태 동적인 변화를 보여줍니다. ERK1/2 특정 조건/자극 아래 phosphorylated 찾을 ...

신흥 연구는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) cytoprotection 및 대사1,2,3중요 한 역할을 재생을 보여줍니다. 신호 변환 통로 MDPs의 존재 이해는 MDPs는 다양 한 기능을 조절 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 제공. 첫 번째 확인 된 민주당 humanin, extracellular 신호 통제 키 1/2 (ERK1/2)을 증가 표시 되었습니다4,5바인딩 그것의 수용 체를 통해 인 산화. 그러나, ERK1/2 활성화의 다운스트림 효과 여전히 underexplored.
ERK1/2 캐스케이드 다양 한 확산, 셀 이동, 세포 물질 대사, 생존, 및 apoptosis6,,78을 포함 하 여 세포질 과정에에서 필수적인 중재자 역할을 합니다. 모든을 통합 하는 것을이 다른 세포질 과정, 활동 및 ERK1/2의 subcellular 지 방화는 단단히 통제 가수분해 및 비 계 단백질9,10. 포스트 번역 상 수정 뿐 아니라 그것의 신호 기능, 활동, 및 특이성11,12조절 또한 ERK1/2의 동적 였죠. ERK1/2 주로 cytosol13에서 지역화 됩니다. 고정 및 비 계 단백질의 세트, 세포의 표면 또는 세포질13확산에 cytoskeletal 요소에 ERK1/2을 유지 도움이. 자극, ERK1/2은 phosphorylated 고 핵, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀14, 등 다른 subcellular 구획에 ERK1/2의 전 수 있도록 그 정박 단백질에서 해리 된다 15 , 16.
비록 humanin는 ERK1/2 신호 전달 경로 활성화, ERK1/2의 활성화만 총 세포 lysates에서 관찰 됩니다. ERK1/2 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과, 모두 subcellular 지 방화의 분석 및의 총 수준에 중요 한 역할 때문에 이전에 설명한 대로 phosphorylated ERK1/2는 포괄적인 이해를 제공 하는 데 필요한 ERK1/2 활성화 humanin 유도 및 다운스트림 목표의 활성화.
활성화 ERK1/2의 대상 세포를 이해 하려면 뒤에 phosphorylated ERK1/2 서 부 럽 subcellular 분류 수행 되었다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시 약 사용으로 쉽게 구현할 수 있습니다. 격리 된 subcellular 구획 straightforwardly 해석 결과 허용 하는 고 순도의 있습니다. ERK1/2 Immunostaining의 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 subcellular 구획은 상대적으로 시각화 하 고 특별 한 고정 및 permeabilization 방법이 필요로 어렵습니다. ERK1/2 레벨 subcellular 구획에 변화 하 고 전체 세포 lysates 볼 때이 변화 거짓 긍정과 거짓 부정적인 신호를 발생할 수 있습니다. 따라서, 격리 된 subcellular 구획을 사용 하 여 한 immunoblot 우리가 ERK1/2 지역화의 더 나은 이해를 제공 합니다.
방법의 다양성에 다른 MDPs 또는 STAT3 같은 다른 신호 분자의 전 좌를 포함 하 여 다른 자극의 효과 조사 하는 프로토콜의 수정 수 있습니다. 최근 발견 된 작은 humanin와 같은 펩 티 드 (SHLPs) 16S rRNA 지구 humanin 인코딩 및 HN17에 비해 유사 하지만 개별 속성에서 인코딩됩니다. 예를 들어 SHLP2 및 SHLP3에 8 h humanin 검토 다른 펩 티 드에 대 한 응답에서 ERK1/2의 subcellular 지 방화 5 분 이내 ERK1/2를 활성화 하는 있지만 우리가 줄 것 이다 이러한 펩 티이 드의 생물학의 더 나은 이해 후 ERK1/2를 활성화 해야 합니다. 증거를 신흥 신호 분자의 subcellular 지 방화의 다운스트림 효과에 중요 한 역할을 담당 했다. 예를 들어, STAT3 전통적으로 주로 휴식 셀에 cytosol에서 지역화는 알려져 있으며 다음 응답 cytokines18으로 유전자 발현을 활성화 하는 핵으로 translocates. 또한 STAT3 미토 콘 드리 아를 translocates 하 고 TCA 주기 및 ATP 생산19. Autophagy 규제에 관한 STAT3의 다른 subcellular 지 방화 다양 한 방법으로20에서 autophagy를 조절 한다. 예를 들어 핵 STAT3 transcriptionally autophagy 관련 유전자를 조절 하 고 autophagy 변조기 역할. 세포질 STAT3 constitutively autophagy 신호 분자와 상호 작용 하 여 autophagy를 억제. 미토 콘 드 리아 STAT3 억제 하 고 산화 스트레스 유발 autophagy를 억제 하 여 mitophagy를 방지 합니다. 따라서,이 subcellular 구획 격리 방법은 다른 신호 분자로 ERK1/2의 역할을 이해 하기 위한 중요 한입니다.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Cell signaling</td><td>9102</td><td>Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Cell signaling</td><td>4370</td><td>Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>Cell signaling</td><td>12586</td><td>Nuclear marker, Dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Cell signaling</td><td>5174</td><td>세포질 마커, Dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>미토콘드리아 마커, 희석 1:2,000</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP conjugated</td><td>Cell signaling</td><td>7074</td><td>희석 1:30,000</td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 배양 접시</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG 펩타이드</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm 실링 필터</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>시그마</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>홀트&트레이드; 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>부드러운 유봉이 있는 Thomas Pestle 조직 분쇄기 어셈블리</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 모듈</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot 터보 전송 시스템</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF 전송 키트</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 블로팅 기판</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>복원 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 erk 활성화에 대 한 subcellular 분류

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 (MDPs) 미토 콘 드리 아 게놈의 다른 알려진된 유전자 내의 작은 열려있는 독서 프레임으로 인코딩됩니다 펩 티 드의 새로운 클래스는. MDPs는 apoptosis에서 신경 세포를 보호, 개선 신진 대사 마커, 화학요법에서 세포를 보호 등 생물학적 효과의 다양 한이 있다. Humanin 발견 첫 번째 민주당 고 민주당 가족 중 가장 공부 펩 티 드 이다. 막 수용 체와 humanin의 하류 신호 경로 신중 하 게 특징 되었습니다. 태그 c와 SHLP1-6 등 추가 MDPs 최근에 발견 되었습니다 고 신호 메커니즘 아직 해명 될. 여기이 펩 티이 드의 기능을 결정 하는 셀 문화 기반 방법을 설명 합니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 셀 분류 기법 활성화의 양적 결정 및 중요 한 신호 분자의 전 좌 허용. 세포 분별 법의 다른 방법이 있다, 하는 동안 여기에 설명 된 하나 쉽고 간단한 방법입니다. 이러한 방법은 더 명료이 펩 티이 드 및 다른 치료제의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 우리 1 μ M와 100 μ M HEK293와 SH SY5Y 셀 치료 S14G-humanin, 강력한 humanin 아날로그21, 각각, 완료 미디어 (그림 1 및 그림 1 지정 된 기간에 대 한 B). 우리는 다음 세202총 단백질 추출 물에서 /Tyr204 에서 ERK1/2의 총 및 phosphorylated 형태 검사. S14G humanin 치료의 규제 세202/Tyr204 사이트에서 ERK1/2의 인 산화의 증가 보였다. ERK1/2의 subcellular 지 방화의 특이성에 특히 그것의 신호 전달 기능에 중요 한 역할을 한다. ERK1/...

이 프로토콜에는 미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드와 세포 신호 캐스케이드 인 단백질의 지 방화를 평가 하는 방법을 설명 합니다.

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

이 실험의 전반적인 목표는 미토콘드리아 유래 펩타이드로 자극된 세포와 관련된 다운스트림 신호 캐스케이드를 식별하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 유래 펩타이드 분야의 주요 질문(예: 어떤 신호 전달 경로가 관련되어 있는지, 어디에서 발생하는지)에 대한 답을 줄 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 간단하며 비교적 수행하기 쉽다는 것입니다.우리는 다운스트림 사실에 대한 제한된 정보를 제공하는 인간 매개 ERK 신호 전달을 조사했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. Subscale Kersher 방법은 인간 매개 신호의 역할에 대한 더 나은 아이디어를 제공했습니다. 3 일째에는 도금 및 세척 후 2 회 10 회에서 6 일째, SH-SY5Y 또는 HEK293 셀을 텍스트 프로토콜에 따라 사용합니다.S14G 휴머닌 펩타이드를 영점 2미크론 여과된 증류수에 용해시킵니다. 그리고 이를 1밀리몰 스톡 용액으로 재구성합니다. 15ml 원뿔형 튜브에 미리 데워진 혈청 함유 또는 무혈청 배지를 부분 표본으로 추출하고 실온의 humanin 펩타이드 스톡 용액을 추가하여 작업 농도를 만듭니다.즉시 세포의 배지를 6 밀리리터의 펩타이드 용액으로 교체하십시오. 그리고 적절한 시간 동안 세포를 배양합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5ml에 플레이트에서 세포를 긁어냅니다. 그리고 셀 현탁액을 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. G의 500배와 섭씨 4도의 온도에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분별 완충액에 다시 현탁시키고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 튜브를 G 250배, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 세포질 분획으로 수집하고 핵 분획을 위해 펠릿을 보관하십시오.상층액을 원심 분리하여 세포 파편 및 기타 오염 물질을 18000배 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 제거합니다. 그런 다음 상등액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이것이 시티솔 분획입니다.펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세척 버퍼에 다시 현탁시키고 용액을 G 250배, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 핵 추출 버퍼를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 얼음에서 샘플을 10 번 초음파 처리합니다.샘플을 다시 원심분리하십시오. 그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 미토콘드리아 분획을 분리하려면 10cm의 접시에 담긴 세포를 얼음처럼 차가운 PBS 10ml를 사용하여 세척합니다.그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 넣고 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 분리합니다. 세포 현탁액을 단일 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 G의 600배와 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.PBS를 흡입하고 1ml의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 얼음 위에 폴리테트라플루오로에틸렌으로 코팅된 유봉을 사용하여 2밀리리터 균질화기를 25번 사용하여 세포를 균질화합니다. 균질액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 G 600배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 핵과 끊어지지 않은 세포를 제거합니다.그런 다음 상층액을 수집하여 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 용액을 7000배 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 분리 완충액으로 다시 현탁시키고 용액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 G 7000회, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.세척을 반복한 후 15마이크로리터의 RIPA 버퍼를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시키고 10분 동안 얼음에서 현탁액을 배양합니다. 그런 다음 16000회 G와 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 미토콘드리아 분획인 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.텍스트 프로토콜에 따라 western blotting을 정량화하고 수행합니다. 이 비디오에서 시연된 절차를 사용하여 HEK293 및 SH-SY5Y 세포는 강력한 휴머닌 유사체인 100마이크로몰 S14 G 휴먼인으로 재처리되었습니다. 그리고 총 단백질 추출물로부터 테아닌 202, 티로신 204에서 ERK12의 총 및 인산화 형태를 분석하였다.여기에서 볼 수 있듯이, S14G humanin 처리는 ERK12와 이를 조절하는 테아닌-202, 티로신-204 부위의 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다. S14G humanin 매개 ERK12 활성화의 표적을 이해하기 위해 S14G humanin 치료 후 총 및 인산화된 ERK12의 세포 내 국소화를 분석했습니다. 이러한 서부 블롯에서 볼 수 있듯이 HEK293 세포에서 인산화된 ERK는 세포질과 핵 모두에서 증가했지만 미토콘드리아에서는 증가하지 않았습니다.그러나 SH-SY5Y 세포에서는 세포질 핵과 미토콘드리아에서 인산화된 ERK가 감소했습니다. S14G humanin-mediated ERK phosphorylation이 다른 세포 유형과 다른 조건에서 다른 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 일단 숙달되면 세포 핵 분별은 1시간 안에 완료할 수 있으며 미토콘드리아 분별은 적절하게 수행되면 1시간 30분 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 모든 샘플을 얼음 위에 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 신호 분자의 다운스트림 표적을 이해하기 위해 co-immunal precipitation 및 mass spectrometry를 포함한 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

이 절차는 성인 마우스 뇌 미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 또는 MAMs 및 MAMs과 mitochondrial 준비에서 glycosphingolipid 강화 microdomain 분수에서 분리하는 방법을 보여줍니다.

미토콘드리아 - 관련 ER의 멤브레인 (MAMs)와 Glycosphingolipid 강화 Microdomains (보석) : 마우스 뇌에서 절연

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

학습하세요 미토콘드리아 유래 펩타이드로 세포를 자극하고 인산화 단백질의 신호 전달 및 아세포 내 위치를 평가하는 방법을. 이 기법은 ERK 활성화 경로를 연구하는 데 활용됩니다.

미토 콘 드리 아에서 파생 된 펩 티 드 치료 시 ERK 활성화에 대 한 subcellular 분류

더 많은 동영상 탐색