아넥신 V 및 프로피디움 아이오딘화물 라벨링
부속서 V와 프로피듐 요오드 (PI)로 염색하면 연구자들은 괴사 또는 세포 사멸등 다양한 유형의 세포 사멸을 식별하는 방법을 연구원에게 제공합니다. 이 기술은 두 구성 요소에 의존합니다. 첫 번째, 부속서 V는, 일반적으로 세포의 막의 내부, 세포질 계면 전단지에서만…
세포의 부속서 V 및 프로피듐 요오드(PI) 라벨링은 세포 사멸을 식별하고 다른 경로인 세포 사멸 또는 프로그램된 세포 사멸 및 괴사를 구별하는 데 사용되는 기술입니다. 세포는 통로에 따라 뚜렷한 형태학적 변화를 겪습니다. 세포가 세포 세포 나 괴사를 겪는 것을 이끄는 특정 조건을 확인함으로써 과학자들은 세포 생리학및 질병의 병리 생리학에 대한 통찰력을 얻습니다. 부속서 V 및 PI 라벨링, 유동 세포측정에 이어 세포사멸의 유형을 분류하는 가장 효율적인 방법 중 하나로 확립되었다.
오늘, 우리는 이 분석이 세포 죽음 통로의 확인에 어떻게 도움이 되는지, 이 기술을 능력을 발휘하는 방법 및 세포 생물학 의 분야에서 중요한 질문에 대답하기 위하여 이 방법을 사용하는 몇몇 흥미로운 예 실험을 설명할 것입니다.
먼저, 부속서 V와 PI 염색의 원리를 살펴보겠습니다.
앞에서 언급했듯이, 세포 세포는 독특한 형태학적 특징을 나타낸다. 여기에는 세포 수축, 막 블래빙, 핵 분열 및 세포 세포 의 출현이 포함됩니다. 또한, 세포사멸의 유도에 따라, 즉, 초기 세포 면에서 특정 특성 변화가 막에 나타납니다. 정상 세포막에는 내부 전단지에 모든 포스파디들세린 또는 PS 잔류물이 있습니다. 그러나 초기 세포에서 이러한 PS 잔류물의 일부는 외부 표면으로 전이되지만 어떻게 해야 합니까?
이를 이해하려면 한 걸음 뒤로 물러서겠습니다. 세포사멸 증 시, 세포종 카스파스가 활성화되는 것으로 잘 알려져 있다. 이 효소는 차례로 스크램블라제에게 불린 막 결합 효소를 활성화합니다. 스크램블라세이는 세포질 측에서 외부 표면으로 PS 잔류물을 배분하여 세포막을 "스크램블"한다. 대조적으로, 괴사 PS 잔류물 도중 그(것)들이 어디에 남아 있는 동안, 그러나 막 자체는 파열합니다. 부속서 V 및 PI 라벨링은 세포 사멸의 두 가지 유형의 멤브레인 변경에 있는 이 다름에 활용합니다.
형광염염으로 컨쥬게이징한 부속서 V는 일반적으로 FITC라고도 하는 형광이소이국증과 같은 - PS에 대한 막을 불투과성, 천연 리간드이며, 따라서 외부 PS에 결합하여 초기 세포 세포를 쉽게 식별한다. 그러나 괴사 중에 발생 하며 세포멸의 후반 단계에서 발생하는 멤브레인 파열에 이어, 부속서도 내면에 PS에 결합하여 거짓 긍정을 얻을 수 있습니다.
이를 방지하기 위해 과학자들은 PI를 사용합니다. 이 DNA 결합 염료 분자는 다시 막 불투과성, 그리고 막이 파열 될 때만 세포를 입력 할 수 있습니다. 따라서, 세포가 단지 부속염인 경우 초기 세포는 초기 세포, PI와 부속서 얼룩진 세포는 괴사 또는 후기 세포가 될 수 있다.
이제 이 분석의 기본 원리를 배웠으니 세포 사멸을 염색하고 분석하는 절차를 살펴보겠습니다.
첫째, 세포는 형태학적 혼란을 방지하기 위해 저속으로 수확및 원심분리되며, PBS라고도 하는 인산염 완충식염과 같은 생리적 세척 완충액에서 재장중단된다. 또 다른 원심분리 단계에 따라, 세포는 PS에 결합하는 부속서에 필요한 칼슘을 함유한 부속서 V 결합 버퍼에서 재장축된 다음 FITC와 결합된 용액에 추가되어, 이는 암흑의 실온에서 배양되어 부속및 PS 협회를 허용한다. 다음 단계에서 PI는 부속서 염색 세포 용액에 직접 첨가되고 어둠 속에서 배양됩니다. 인큐베이션 후, 세포는 원심분리에 의해 PBS로 세척되고, 세척 버퍼에서 재중단되고, 얼음위에 보관됩니다. 이제 분석을 위한 준비가 되었습니다.
세포의 형광 활성은 유체의 흐름에 매달린 단일 세포로부터 형광 데이터를 캡처하는 레이저 기반 기술인 유동 세포측정법에 의해 분석됩니다. 각 염료로 별도로 염색된 세포를 이용한 형광 보정 후 이중 염색 된 세포로부터의 데이터가 수집됩니다. 세포 집단으로부터의 형광 신호는 부속서 결합 FITC 강도가 로개심 X축에 플롯되는 플롯을 만들고, 로개스믹 Y축의 PI를 만드는 데 사용됩니다. 부속-FITC 양성 및 PI 네거티브인 세포는 초기 세포 세포를 나타내는 플롯의 오른쪽 하단에 클러스터되며, 부속서-FITC 및 PI에 대한 이중 양성 세포는 오른쪽 상단에 발생하며, 후기 세포 또는 괴사 세포를 나타냅니다. 부속서와 PI 모두에 대해 얼룩지지 않거나 현저하게 얼룩진 채로 남아 있는 세포는 살아있는 세포입니다.
세포 생물학자가 세포 죽음을 연구하기 위해이 기술에 의존하는 이유를 지금 알고 있기 때문에, 왜 우리는 그것의 응용 프로그램의 일부를 검토하지 않습니다.
이 절차를 사용하여 과학자들은 세포 내 단백질이 세포 내 단백질이 세포 세포 증에 관여하는 것을 따를 수 있습니다. 이 비디오에서, 연구원은 cisplatin의 효력을 분석했습니다, 항암 약, 일반적인 신장 세포에 세포멸을 유도하는지 보기 위하여. 세포의 한 세트는 효소 단백질 키나아제 C 또는 PKC의 활성 형태를 과발현하도록 유도되었고, 다른 세트는 비기능성 형태-지배적인 음성 PKC로 변형되었다. PKC를 발현하고 시스플라틴으로 처리된 세포는 시간이 지남에 따라 세포멸을 겪었지만, 비활성 지배적인 음성 PKC를 발현하는 세포는 세포에 내성이 있었으며, 이는 효소가 시스플라틴 유도 세포증 통로의 핵심 플레이어임을 나타낸다.
연구원은 또한 특정 T 세포의 세포 독성 잠재력을 테스트 하기 위해 이러한 얼룩을 사용. Cyto독성 T 세포는 표적 세포에 특정 막 단백질을 인식할 수 있고, 그것에 결합할 때 그것의 죽음을 유도할 수 있습니다. 여기서, 연구원은 표적 종양 세포 및 부속서 V를 가진 항원 특이적 T 세포를 배양하고, 그 후 T 세포 참여에 의한 종양 세포 세포 의 유도를 관찰하였다. 유동 세포측정 데이터는 세포 독성 T 세포의 존재와 부재에서 표적 세포 죽음의 백분율을 밝혔다.
마지막으로, 과학자들은 유전자 전달 에 따라 세포 생존 가능성을 평가하기 위해이 방법을 사용합니다. 이 경우, 연구원은 핵형성 후 세포 생존을 평가하고 싶었는데, 이는 화학 물질과 적용된 전기장의 조합을 사용하여 세포막과 핵막에 일시적인 모공을 만들어 유전자 전달을 용이하게 하는 방법입니다. 부속서 V 플러스 7-aminoactinomycin D 또는 7-AAD라는 염료를 사용 하 여, PI와 유사 하 게 DNA에 결합, 그들은 핵 세포 죽음 apoptosis 또는 괴사에 의해 낮은 세포 죽음을 발생 하는 것으로 나타났다.
별관 V와 PI 라벨링에서 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오에서는 apoptotic 및 괴사 세포의 구별되는 특징에 대해 간략하게 논의하고, 이 방법의 원리를 검토하고, 일반적으로 사용되는 이 기술에 대한 일반화된 절차를 시청하고, 일부 응용 프로그램을 미리 보았습니다. 다른 조건하에서 어떻게 다른 세포가 죽는지 이해하는 중요성을 감안할 때, 부속서 V 및 PI 라벨링은 이 현상에 관심이 있는 세포 생물학자를 위한 중요한 공구 역할을 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
세포의 부속서 V 및 프로피듐 요오드(PI) 라벨링은 세포 사멸을 식별하고 다른 경로인 세포 사멸 또는 프로그램된 세포 사멸 및 괴사를 구별하는 데 사용되는 기술입니다. 세포는 통로에 따라 뚜렷한 형태학적 변화를 겪습니다. 세포가 세포 세포 나 괴사를 겪는 것을 이끄는 특정 조건을 확인함으로써 과학자들은 세포 생리학및 질병의 병리 생리학에 대한 통찰력을 얻습니다. 부속서 V 및 PI 라벨링, 유동 세포측정에 이어 세포사멸의 유형을 분류하는 가장 효율적인 방법 중 하나로 확립되었다.
오늘, 우리는 이 분석이 세포 죽음 통로의 확인에 어떻게 도움이 되는지, 이 기술을 능력을 발휘하는 방법 및 세포 생물학 의 분야에서 중요한 질문에 대답하기 위하여 이 방법을 사용하는 몇몇 흥미로운 예 실험을 설명할 것입니다.
먼저, 부속서 V와 PI 염색의 원리를 살펴보겠습니다.
앞에서 언급했듯이, 세포 세포는 독특한 형태학적 특징을 나타낸다. 여기에는 세포 수축, 막 블래빙, 핵 분열 및 세포 세포 의 출현이 포함됩니다. 또한, 세포사멸의 유도에 따라, 즉, 초기 세포 면에서 특정 특성 변화가 막에 나타납니다. 정상 세포막에는 내부 전단지에 모든 포스파디들세린 또는 PS 잔류물이 있습니다. 그러나 초기 세포에서 이러한 PS 잔류물의 일부는 외부 표면으로 전이되지만 어떻게 해야 합니까?
이를 이해하려면 한 걸음 뒤로 물러서겠습니다. 세포사멸 증 시, 세포종 카스파스가 활성화되는 것으로 잘 알려져 있다. 이 효소는 차례로 스크램블라제에게 불린 막 결합 효소를 활성화합니다. 스크램블라세이는 세포질 측에서 외부 표면으로 PS 잔류물을 배분하여 세포막을 "스크램블"한다. 대조적으로, 괴사 PS 잔류물 도중 그(것)들이 어디에 남아 있는 동안, 그러나 막 자체는 파열합니다. 부속서 V 및 PI 라벨링은 세포 사멸의 두 가지 유형의 멤브레인 변경에 있는 이 다름에 활용합니다.
형광염염으로 컨쥬게이징한 부속서 V는 일반적으로 FITC라고도 하는 형광이소이국증과 같은 - PS에 대한 막을 불투과성, 천연 리간드이며, 따라서 외부 PS에 결합하여 초기 세포 세포를 쉽게 식별한다. 그러나 괴사 중에 발생 하며 세포멸의 후반 단계에서 발생하는 멤브레인 파열에 이어, 부속서도 내면에 PS에 결합하여 거짓 긍정을 얻을 수 있습니다.
이를 방지하기 위해 과학자들은 PI를 사용합니다. 이 DNA 결합 염료 분자는 다시 막 불투과성, 그리고 막이 파열 될 때만 세포를 입력 할 수 있습니다. 따라서, 세포가 단지 부속염인 경우 초기 세포는 초기 세포, PI와 부속서 얼룩진 세포는 괴사 또는 후기 세포가 될 수 있다.
이제 이 분석의 기본 원리를 배웠으니 세포 사멸을 염색하고 분석하는 절차를 살펴보겠습니다.
첫째, 세포는 형태학적 혼란을 방지하기 위해 저속으로 수확및 원심분리되며, PBS라고도 하는 인산염 완충식염과 같은 생리적 세척 완충액에서 재장중단된다. 또 다른 원심분리 단계에 따라, 세포는 PS에 결합하는 부속서에 필요한 칼슘을 함유한 부속서 V 결합 버퍼에서 재장축된 다음 FITC와 결합된 용액에 추가되어, 이는 암흑의 실온에서 배양되어 부속및 PS 협회를 허용한다. 다음 단계에서 PI는 부속서 염색 세포 용액에 직접 첨가되고 어둠 속에서 배양됩니다. 인큐베이션 후, 세포는 원심분리에 의해 PBS로 세척되고, 세척 버퍼에서 재중단되고, 얼음위에 보관됩니다. 이제 분석을 위한 준비가 되었습니다.
세포의 형광 활성은 유체의 흐름에 매달린 단일 세포로부터 형광 데이터를 캡처하는 레이저 기반 기술인 유동 세포측정법에 의해 분석됩니다. 각 염료로 별도로 염색된 세포를 이용한 형광 보정 후 이중 염색 된 세포로부터의 데이터가 수집됩니다. 세포 집단으로부터의 형광 신호는 부속서 결합 FITC 강도가 로개심 X축에 플롯되는 플롯을 만들고, 로개스믹 Y축의 PI를 만드는 데 사용됩니다. 부속-FITC 양성 및 PI 네거티브인 세포는 초기 세포 세포를 나타내는 플롯의 오른쪽 하단에 클러스터되며, 부속서-FITC 및 PI에 대한 이중 양성 세포는 오른쪽 상단에 발생하며, 후기 세포 또는 괴사 세포를 나타냅니다. 부속서와 PI 모두에 대해 얼룩지지 않거나 현저하게 얼룩진 채로 남아 있는 세포는 살아있는 세포입니다.
세포 생물학자가 세포 죽음을 연구하기 위해이 기술에 의존하는 이유를 지금 알고 있기 때문에, 왜 우리는 그것의 응용 프로그램의 일부를 검토하지 않습니다.
이 절차를 사용하여 과학자들은 세포 내 단백질이 세포 내 단백질이 세포 세포 증에 관여하는 것을 따를 수 있습니다. 이 비디오에서, 연구원은 cisplatin의 효력을 분석했습니다, 항암 약, 일반적인 신장 세포에 세포멸을 유도하는지 보기 위하여. 세포의 한 세트는 효소 단백질 키나아제 C 또는 PKC의 활성 형태를 과발현하도록 유도되었고, 다른 세트는 비기능성 형태-지배적인 음성 PKC로 변형되었다. PKC를 발현하고 시스플라틴으로 처리된 세포는 시간이 지남에 따라 세포멸을 겪었지만, 비활성 지배적인 음성 PKC를 발현하는 세포는 세포에 내성이 있었으며, 이는 효소가 시스플라틴 유도 세포증 통로의 핵심 플레이어임을 나타낸다.
연구원은 또한 특정 T 세포의 세포 독성 잠재력을 테스트 하기 위해 이러한 얼룩을 사용. Cyto독성 T 세포는 표적 세포에 특정 막 단백질을 인식할 수 있고, 그것에 결합할 때 그것의 죽음을 유도할 수 있습니다. 여기서, 연구원은 표적 종양 세포 및 부속서 V를 가진 항원 특이적 T 세포를 배양하고, 그 후 T 세포 참여에 의한 종양 세포 세포 의 유도를 관찰하였다. 유동 세포측정 데이터는 세포 독성 T 세포의 존재와 부재에서 표적 세포 죽음의 백분율을 밝혔다.
마지막으로, 과학자들은 유전자 전달 에 따라 세포 생존 가능성을 평가하기 위해이 방법을 사용합니다. 이 경우, 연구원은 핵형성 후 세포 생존을 평가하고 싶었는데, 이는 화학 물질과 적용된 전기장의 조합을 사용하여 세포막과 핵막에 일시적인 모공을 만들어 유전자 전달을 용이하게 하는 방법입니다. 부속서 V 플러스 7-aminoactinomycin D 또는 7-AAD라는 염료를 사용 하 여, PI와 유사 하 게 DNA에 결합, 그들은 핵 세포 죽음 apoptosis 또는 괴사에 의해 낮은 세포 죽음을 발생 하는 것으로 나타났다.
별관 V와 PI 라벨링에서 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오에서는 apoptotic 및 괴사 세포의 구별되는 특징에 대해 간략하게 논의하고, 이 방법의 원리를 검토하고, 일반적으로 사용되는 이 기술에 대한 일반화된 절차를 시청하고, 일부 응용 프로그램을 미리 보았습니다. 다른 조건하에서 어떻게 다른 세포가 죽는지 이해하는 중요성을 감안할 때, 부속서 V 및 PI 라벨링은 이 현상에 관심이 있는 세포 생물학자를 위한 중요한 공구 역할을 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!
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Q1: How does phosphatidylserine translocation distinguish apoptotic cells from necrotic cells?
During apoptosis, cytosolic caspases activate scramblase, an enzyme that translocates phosphatidylserine (PS) residues from the inner cell membrane to the outer surface. In necrosis, PS remains internal but the membrane ruptures. Annexin V binds externalized PS in early apoptotic cells, while propidium iodide enters only when membranes rupture, allowing researchers to differentiate between these death pathways.
Q2: Why is propidium iodide used alongside annexin V in cell death assays?
Propidium iodide (PI) is a membrane-impermeable DNA-binding dye that enters cells only when membranes rupture. Since annexin V alone cannot distinguish early apoptosis from late apoptosis or necrosis, PI provides critical differentiation. Cells positive for annexin V but negative for PI indicate early apoptosis, while double-positive cells represent late apoptotic or necrotic cells.
Q3: What are the key steps in preparing cells for annexin V and propidium iodide staining?
Cells are harvested and centrifuged at low speed, then resuspended in phosphate-buffered saline (PBS). After centrifugation, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to phosphatidylserine. Annexin V conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) is added and incubated in the dark, followed by propidium iodide addition and another dark incubation.
Q4: How does flow cytometry interpret annexin V and propidium iodide staining patterns?
Flow cytometry plots annexin-FITC intensity on the logarithmic X-axis and PI on the Y-axis. Cells positive for annexin-FITC but negative for PI cluster in the lower right quadrant, representing early apoptotic cells. Double-positive cells appear in the upper right, indicating late apoptotic or necrotic cells. Unstained or insignificantly stained cells in the lower left represent live cells.
Q5: How have researchers used annexin V and PI labeling to study protein kinase C in cisplatin-induced apoptosis?
Researchers compared kidney cells overexpressing active protein kinase C (PKC) with cells expressing inactive dominant-negative PKC. When treated with cisplatin, cells with active PKC underwent apoptosis over time, while dominant-negative PKC cells resisted apoptosis. This demonstrated that PKC is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway, revealing important mechanisms of an introduction to cell death.
Q6: What do annexin V and PI staining reveal about cytotoxic T cell function?
Researchers incubate antigen-specific cytotoxic T cells with target tumor cells in the presence of annexin V and PI. Flow cytometry data reveals the percentage of target cell death induced by T cell engagement. This method demonstrates how cytotoxic T cells recognize specific membrane proteins on target cells and induce apoptosis upon binding.
Q7: How is annexin V and PI staining used to assess cell viability after nucleofection?
Nucleofection uses chemicals and electric fields to create transient pores in cell membranes for gene delivery. Researchers use annexin V plus 7-aminoactinomycin D (7-AAD), a DNA-binding dye similar to PI, to evaluate cell survival post-nucleofection. This staining approach quantifies cell death by apoptosis or necrosis, demonstrating nucleofection's impact on cell viability.