Name: 마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 학습하세요 마우스 골격 근육에서 ChIP급 크로마틴을 준비하는 향상된 프로토콜을 통해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 근육 위축의 분자 메커니즘 규명에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리 감사 합니다 IGBMC 높은 처리량 시퀀싱 시설, "프랑스 Génomique" 컨소시엄 (ANR10-INBS-09-08)의 회원 및 모든 IGBMC 일반 서비스의 모든 직원 들은 특히 IGBMC 동물 시설 직원을. 이 작품은 CNRS는 INSERM, AFM, 국가 리그 죄수 르 암에서 교부 금에 의해 지원 되었다, 프랑스 프로그램 ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 표시 하는 Investissements d'Avenir에서 ANR 통해 펀드와 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. S.J 지원 했다 국가 리그 죄수 르 암과 ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, V.U Ministère de l'Enseignement에 의해 동부 표준시 드 라 Recherche. ID는 'équipe labellisée' 국가 리그 죄수 르 암입니다.

관리 및 실험 동물의 사용에 관한 기관 지침에 따라 그리고 국가 동물 관리 지침 (유럽 위원회 지시 86/609/CEE;에 따라 마우스 유지 했다 프랑스어 법령 no.87-848). 모든 절차는 프랑스 국가 윤리 위원회에 의해 승인 했다.
 1. 절연의 근육 조직 경부 전위에 의해 <ol><li>희생 한 성인 6 8 주 오래 된 마우스. Sterlise 70% 에탄올과 그것을 rinsing 하 여 사지 및 좋은 포인트가 위와 집게를 사용 하 여 뒷 다리 근육 (Gastrocnemius, Tibialis 앞쪽 허벅지 근육)를 해 부. 
	참고: 하나의 마우스 조직의 약 500 밀리 그램을 산출 해야 한다.</li>
	<li>소규모의 동질적인 준비 얼음 소형 버퍼의 1 mL를 포함 하는 2 mL 테스트 튜브에 있는 근육을 말하다 (&#60; 2-3 m m 3) 조각을 사용 하 여가 위를 잘 하 고 5-10 분 4 ° C에서 벤치 가기 교 반기에 떨고 관 두고</li>
</ol> 2. 조직 세포 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>14 mL 라운드-하단 튜브는 homogenate 전송 및 5 mL 차가운 소형 버퍼 (EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 PMSF)에서 resuspend.
	<li>Homogenise 15-30의 라운드-하단 14 mL 튜브에 대 한 느슨한 dounce (20-30 선 3 분 이내) 또는 기계적 조직 균질 화기를 사용 하 여 다진된 근육 조직 <ol>. 
		참고: 세포의 효율성, 가벼운 현미경에 의해이 단계에서 평가 될 수 있다 하 고, 필요한 경우 추가 중단을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>15 mL 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 10 ml 차가운 소형 버퍼를 사용 하 여 볼륨을 채우기. homogenate 다음 마우스와 함께 진행 하기 전에 아래와 같이 수정.</li>
</ol> 3. 고정 <ol><li>1% 최종 농도에 포름알데히드를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 흔들어.</li>
	<li>고정 및 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 동요를 막으려고 각 관에서 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가.</li>
</ol> 4. 핵 준비 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>고정 lysate 사용 (5-10 스트로크) 느슨한 dounce Homogenise.
	<ol><li>전송 15 mL 튜브와 4 ° C에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기를 핵 및 세포질 파편.</li>
	</ol></li> <li>는 상쾌한을 제거 하 고 신선한 5 mL 소형 버퍼에 펠 릿을 resuspend. 필터링은 lysate 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 튜브에. 다시는 filtrate 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링.</li>
	<li>핵 펠 렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 15 mL 튜브와 1000 x g에서 원심 분리기에는 filtrate 전송. 
	참고:이 단계에서 핵 수 있습니다 sonicated 즉시 수, 또는 건조 한 펠 릿으로 액체 질소에서 냉동 고-80에서 저장 된 스냅인 ° c.</li>
</ol> 5. 쥡니다 <ol><li>핵 펠 릿 (기계와 dounce 이동할 위한 50 µ L)의 볼륨을 평가 하 고 포장된 핵 볼륨의 4 번을 3까지 쥡니다 버퍼에 resuspend sonicate sonicator는을 사용 하 여 4 ° C에서 10-15 분 . 
	참고:는 염색 질 (6) 아래 설명 된 대로 즉시 분석 또는 냉동 고 수-80에 저장 ° c.</li>
</ol> 6. 다음 쥡니다 Chromatin 조각 크기를 평가 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>드 crosslink chromatin의 30 µ L 1.5 mL 테스트 튜브에 고 추가 20 µ L 5 M NaCl. 500 µ L 볼륨을 완료 하 고 65 ° C에서 밤새 품 어.
	<ol><li>다음 날 치료 1 µ L 성분 K (20 mg/mL 증권), 10 µ L 2 M Tris pH 6.8, 및 10 µ L 42 ° C. 수행 된 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 추출에서 1 시간에 0.5 M EDTA의 수행 및 나트륨 acetat의 1 볼륨 DNA를 침전 한 시간 또는 하룻밤-20-80 ° C에서 100% 에탄올의 e (3 M) 및 2 ° c.</li>
	</ol></li> <li>15 분 Decant는 상쾌한 13500 x g에서 원심 분리 하 여 DNA를 작은 찬 70% 에탄올과 5 분 Decant는 상쾌한에 다시 한번 원심 분리기로 깨끗이 펠 릿을 세척 하 고 건조는 펠 릿.</li>
	<li>테 버퍼의 원래 볼륨 (30 µ L)에 펠 릿을 resuspend. 260 nm/280 nm에서 흡 광도 분 광 광도 계에 DNA 농도 측정. 플라스틱 1.5 %agarose 젤의 별도 차선에 DNA 크기 사다리와 DNA의 500-1000은 고 chromatin의 조각 크기를 평가 하기 위해 전기 이동 법을 수행. 
	참고: 조각 크기 200-500의 기본적인 쌍 사이 여야 하 고 아무 감지 높은 분자량 조각 하 비-또는 저조한-조각화 DNA에 해당 되어야 합니다. Chromatin 솔루션 (5 단계)를 다시 긴 시간 sonicated 고 최적 크기를 얻을 때까지 위에서 설명한 대로 다시 분석 수 필요한 경우.</li>
</ol> 7. Chromatin Immunoprecipitation (칩) 참고: 모든 구성 버퍼에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
Aliquoting 1 mL에 에탄올 50% 슬러리의 의해 <ol><li>블록 단백질 G sepharose 구슬. 펠 릿은 벤치탑에서 1 분 400 x g에서 원심 분리 하 여 구슬 원심 400 x g에서 테 버퍼 원심 분리기의 1 mL로 씻어 고 반복 하는 워시
	<li>후 두 번째 원심 분리, 다시 칩 희석 버퍼 BSA (재고 20 mg/mL)의 25 µ L의 1 ml에서를 일시 중단 하 고 20 µ L 효 모 tRNA (재고 10 mg/mL) <ol>. 4 회전 (40-60 rpm) 하 여 적어도 2 사용 전에 h 구슬 차단 ° c.</li>
		<li>Chromatin (5 단계)의 희석 50 µ g 8 ~ 10 배 칩 희석 버퍼를 사용 하 여. 차단 된 비드 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 4에서 2 h (40-60 rpm) 회전에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 사전 허가 chromatin 신선한 튜브 전송 하 4 ° C에 400 x g.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation에 대 한 1 차적인 항 체 (예, chromatin의 10 µ g 당 1-2 µ g)의 적절 한 금액을 추가 하 고 4 회전 밤새 품 어 ° c. 
	참고: 최적의 양의 항 체 공급 업체에서 권장 될 수 있습니다 또는 칩-정량 항 체의 다른 수량으로 최적의 농축 관찰 될 때까지 수행 하 여 실험적으로 결정 될 수 있다. 또한 단백질 G sepharose 사용 하는 항 체의 하위 형식에 따라 단백질 A sepharose에 의해 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>추가 차단된 구슬 다음날 고 4 회전 (40-60 rpm) 1 시간에 대 한 품 어 ° C. 원심 분리기 작은 구슬, 제거 하는 상쾌한 고 시작 칩 20-30 s 400g x 세척.</li>
	<li>세척 칩: 버퍼와 함께 다음 세척을 수행: 낮은 소금 버퍼, 한 번 그리고 높은 소금 버퍼를 두 번 LiCl 버퍼와 두 번 그리고 마지막으로 두 번 테 버퍼와.
	<ol><li>회전 (40-60 rpm) 4 ° C에서 10 분 동안 각 세척을 수행 하 고 작은 벤치 가기 원심 분리기에서 20-30 s 400g x에서 원심 분리 하 여 각 씻어 사이의 구슬.</li>
	</ol></li> <li>차입에 대 한 마지막 세척 제거 하 고 동요 하는 동안 실 온에서 15 분 동안 250 µ L 차입 버퍼 (갓 준비) 구슬 resuspend.</li>
	<li>원심 분리기 g 및 수집 신선한 튜브 eluate x 400. 이 단계를 두 번 및 다음 드 crosslink 20 µ L NaCl 5 M 및 1 µ L RNase A와 하룻밤 eluate 수행 (10mg/mL), 가수분해, K와 페 놀-클로 프롬/클로 프롬 extr 치료단계 6 행동.</li>
	<li>테 버퍼의 50 µ L에서 resuspend를 사용 하 여 aliquots 칩 정량에 대 한 표준 프로토콜 15 당 칩의 품질을 확인.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
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<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기는 성인 마우스 골격 근육이 염색이 질은 근육 섬유 핵 녹음 방송 요인 바인딩 및 화학식 히스톤 수정을 감지 칩 실험에 적합 표시에서 chromatin를 준비 하기 위한 새로운 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 몇 가지 중요 한 단계가 포함 됩니다. 첫 번째는 조직 장애 dounce 또는 기계적인 전단에 의해 수행 될 수 있는. 기계적 전단 빠르고 더 재현 이며 따라서 방법의 선택. 그럼에도 불구 하 고, 아무 적당 한 장치를 사용할 수 있는 경우 중단도 수행할 수 있습니다 세포는 현미경의 효율성의 평가 정착 단계를 진행 하기 전에 권장은 douncing에 의해. 전체 조직 lysates의 고정 보다는 고립 된 핵의 고정 허용 더 재현 쥡니다 작은 볼륨에서 짧은 기간에 대 한. 우리 또한 토마스 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 장애, 전에 조직 수정 보다는 lysates 중단 후 수정 선택 10 미리 조직 고정 이동할의 감소 효율성 귀착되는. 이 프로토콜...

Chromatin immunoprecipitation (칩) 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 결합 하 고 높은 처리량 시퀀싱 (칩 seq) 전사를 공부 하는 선택의 방법 및 다양 한 조직에서 유전자 발현의 후 성적인 규정 되 그리고 세포 유형1. 이 기술은 화학식 chromatin 수정, 히스톤 변형 인, 및 녹음 방송 요인 바인딩2,3의 프로 파일링 게놈 넓은 수 있습니다.
배양된 세포에서 칩을 수행 하는 것이 잘 설립 동안 포유류 조직에서 칩 더 도전 남아 있다. Chromatin 칩에 대 한 준비 하 고 모든 조직 및 세포 유형에 대 한 최적화 하는 데 필요한 몇 가지 중요 한 단계를 포함 한다. Chromatin는 경작된 한 세포의 세포 lysates 또는 그들의 핵의 다음 정화에서 준비 될 수 있습니다. 포유류 직물의 경우 효율적인 세포, 포름알데히드 고정, 그리고 핵의 정화는 chromatin의 복구를 보장 하기 위해 중요 하다. 또한, 그들의 정화 전후 핵 해결을 선택 실험적으로 결정 될 수 있다. 이러한 장애물에도 불구 하 고 칩은 간, 고환, 또는 뇌4,,56같은 조직에서 성공적으로 수행 되었습니다. 골격 근육의 경우 같은 물리적으로 저항 조직, 구조 단백질의 높은 콘텐츠 및 그것의 핵의 절연 전시 중단은 특히 도전적 이다. 이 특이성을 감안할 때, 다른 조직에 대 한 최적화 된 프로토콜 주지 않는다 만족 스러운 결과 골격 근육에 대 한.
여기는 칩-학년 chromatin 물리적 조직, 포름알데히드 고정, 그리고 핵 및 쥡니다의 방해를 포함 하는 마우스 골격 근육 조직에서 분리 하는 프로토콜에 설명 합니다. 염색 질이이 조직에서 적합 한 칩에 대 한 준비를이 방법의 효율성은 다양 한 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정7칩 정량 및 칩 seq를 수행 하 여 시연 했다.
이 새로운 기술은 이전에 보고 된 프로토콜8 시간, 녹음 방송 요인의 게놈 현지화에 변화 하는 동안 오래 콜라 소화 단계를 구성 보다 훨씬 빠른 고 유전자 발현에 변경 자리를 차지할 수 있습니다. 핵은 분리 하 고 고정 속도 여기에 설명 된 메서드를 특히 매력적인 chromatin 네이티브 게놈 인 상태를 더 충실 하 게 준비 하 게 만듭니다. 또한, 비록 근육 조직에서 chromatin 격리 또는 단백질 추출에 대 한 다른 방법 설명된8,,910 되었고 선택 된 유전자, 아니 칩 seq에 칩 정량 실험을 위해 사용 그들을 사용 하 여 데이터 보고 되었습니다. 여기 보고 메서드는 전사 인자와 히스톤 수정 칩 seq에 적합 하 고 따라서 또한 적합 해야한다 3/4 C 또는 HiC chromatin 구조 캡처 응용 프로그램.

<table><tbody><tr><td>T 25 디지털 ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>시그마-알드리치 치미 SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무료</td><td>Roche 진단</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G 세파로스 비드</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해효소 K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 EM 등급</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>시그마-알드리치 CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐 블루</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP 항체</td><td>활성 모티프</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP 항체</td><td>Aviva 시스템 생물학</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 집속 초음파기</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>추가 항목</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 및 50 ml 팔콘 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>14 ml 라운드 바닥 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>1.5 ml 및 2 ml, Eppendorf 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 및 40 &mu; m cell 스트레이너 (코닝)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 골격 근육에서 chromatin immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

우리는 성인 마우스 골격 근육, 구조 단백질의 높은 내용 가진 물리적으로 저항 조직에서에서 chromatin의 준비에 대 한 효율적이 고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다. 성인 쥐에서 해 부 다리 근육은 육체적으로 기계 이동할 또는 닦지 세포 lysate의 포름알데히드 고정 하기 전에 당뇨 버퍼에 douncing의 조합에 의해 중단 됩니다. 고정된 핵 더 사이클 기계 이동할 또는 douncing 및 순차 filtrations 세포 파편을 제거 하 여 정화 됩니다. 순화 핵 동결 후 즉시 또는 나중에 무대에서 sonicated 수 수 있습니다. chromatin를 효율적으로 sonicated 수 있습니다 그리고는 프로필에서 볼 수 있듯이 chromatin immunoprecipitation 실험에 적합 전사 인자와 RNA 중 합 효소 II, 화학식 히스톤 수정에 대 한. 이 프로토콜에 의해 준비 하는 chromatin를 사용 하 여 검출 바인딩 이벤트는 주로 다른 섬유 관련 위성 및 내 피 세포에서 chromatin의 존재에도 불구 하 고 근육 섬유 핵에서 그. 이 프로토콜은 따라서 성인 쥐 골격 근육에 있는 유전자 규칙을 공부에 적응.

핵을, 우리는 15 또는 45 s, 18000 및 22, 000 rpm ( 재료의 표참조)에 대 한 해 부와 다진 근육 조직의 기계적 균질 수행. 모든 조건에서 핵에서 조직, 분리 될 수 있었다 하지만 수익률은 낮은 속도 (그림 1A-B)를 사용 하 여 최적의. Douncing 3-5 분 (그림 1A및 데이터 표시 되지 않음), 핵 수 또한 준비 하지만 기계적 균질 화 방법의 선택, 15로 작은 핵의 최적의 수율을 달성 될 수 있다 s, 특히 시간의 중요 한 증가 허용 여러 샘플 해야 처리 (그림 1B). 2.7 x 10까지이 프로토콜을 사용 하 여 조직 (1 마우스의 조직에 해당)의 500 mg에서7 핵 chromatin의 100 ...

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

이 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 골격근에서 염색질을 준비하는 것입니다. 이 방법은 유전자 조절 및 골격근 섬유에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 마우스 골격근에서 ChIP 등급 염색질을 준비할 수 있다는 것입니다.구조 단백질이 많이 함유된 물리적 저항성이 있는 조직입니다. 우리는 쥐 골격근 섬유에서 포도당 관절 수용체, DNA 결합 부위를 식별해야 하는 포도당 관절 사용 근육 위축의 기저에 있는 분자 메커니즘을 특성화하려고 할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사후 연구원인 Shilpy Joshi입니다.이 절차를 시작하려면 얼거나 갓 절개한 뒷다리 근육을 회복하십시오. 그런 다음 1ml의 얼음처럼 차가운 저장계 완충액이 들어 있는 2밀리리터 시험관에서 근육을 다져 가는 가위를 사용하여 작은 조각의 균일한 준비를 합니다. 그런 다음 섭씨 4도의 벤치 탑 교반기에서 튜브를 5-10분 동안 흔든 상태로 둡니다.다음으로, 절개된 조직을 4ml의 차가운 저장성 완충액이 들어 있는 14ml 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 기계적 조직 균질화기를 사용하여 15-30초 동안 다진 조직을 균질화합니다. 그런 다음 균질산염을 15ml 튜브로 옮깁니다.차가운 저장성 완충액을 추가하여 10ml의 샘플을 생성하고 다음 마우스로 진행하기 전에 균질액을 고정합니다. 이 절차에서 샘플에 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도가 1%가 되도록 합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 흔듭니다.다음으로, 글리신을 첨가하여 각 튜브에서 최종 농도가 0.125 몰이 되도록 하여 고정을 중지합니다. 그리고 실온에서 5-10분 동안 흔듭니다. 그 후, 느슨한 dounce를 사용하여 고정 용해물을 균질화하십시오.그런 다음 15ml 튜브에 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 1000g으로 원심분리하여 핵과 세포 파편을 얻습니다. 5분 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 5ml의 새로운 저장성 완충액에 다시 현탁시킵니다. 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용해물을 50ml 튜브로 여과합니다.피펫 팁을 사용하여 1ml의 차가운 저장성 완충액으로 필터를 세척합니다. 그런 다음 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 여과액을 다시 여과합니다. 그런 다음 여과액을 15ml 튜브로 옮깁니다.그리고 1000g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 핵 펠릿을 얻습니다. 상등액을 버린 후 1ml의 저장성 완충액을 사용하여 3개의 펠릿을 모으고 1.5-2ml 튜브로 옮깁니다. 1000g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.다음으로, 알려진 부피의 액체를 포함하는 튜브와 비교하여 핵 펠릿의 부피를 평가하고 충전된 핵 부피의 최대 3-4배까지 초음파 처리 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 초음파 처리기를 사용하여 섭씨 4도에서 10-15분 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다. 초음파 처리된 샘플을 원심분리하고 염색질 상등액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다.가교결합을 제거하려면 1.5ml 시험관에 30마이크로리터의 염색질을 넣고 20마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 450마이크로리터의 물을 추가합니다. 부피를 500마이크로리터로 완성하고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 1 μl의 Proteinase K, 10 μl의 pH 6.8의 2 molar tris 및 10 μl의 0.5 molar EDTA로 섭씨 42도에서 1 시간 동안 치료를 수행합니다.그런 다음 규칙적인 페놀-클로로포름 클로로포름 추출을 수행하고 DNA에 1 부피의 아세테이트 나트륨과 2 부피의 100% 에탄올을 섭씨 음의 80도에서 1시간 동안 또는 섭씨 음의 20도에서 하룻밤 동안 침전시킵니다. 다음으로, 13, 500g에서 15분 동안 원심분리하여 DNA를 펠렛화합니다. 상층액을 디캔팅하고 펠릿을 차가운 70% 에탄올로 철저히 세척하고 다시 5분 동안 원심분리합니다.그런 다음 상등액을 디캔팅하고 펠릿을 자연 건조시킵니다. 그 후, 트리스 HCl EDTA 버퍼의 원래 부피에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 260 나노 미터, 280 나노 미터에서 흡수제에 의해 분광 광도계에서 DNA 농도를 측정합니다.그 후, 500-1000 나노그램의 DNA를 DNA 크기의 사다리와 함께 1.5% 아가로스 겔의 별도 레인에 피펫으로 주입합니다. 그리고 염색질의 단편 크기를 평가하기 위해 전기영동을 수행합니다. 최적화를 위해 균질화는 18, 000 및 22, 000 RPM의 두 가지 속도에서 15초 또는 45초 동안 수행되었습니다.모든 조건에서 핵은 조직 파편에서 분리될 수 있었지만 수율은 더 낮은 속도를 사용할 때 최적이었습니다. 핵은 또한 3분에서 5분 동안 도운싱하여 준비할 수 있습니다. 그러나 기계적 균질화는 15초 이내에 최적의 핵 수율을 달성할 수 있기 때문에 선택되는 방법이며, 특히 여러 샘플을 처리해야 하는 경우 중요한 시간 이득을 얻을 수 있습니다.이 프로토콜을 사용하면 500mg의 조직에서 7개의 핵에 최대 2.7배의 10을 분리하여 100마이크로그램의 염색질을 생성할 수 있습니다. 이러한 방식으로 제조된 크로마틴은 ChIP 염기서열분석 실험에서 깨끗하고 고품질의 결과를 제공합니다. 근육 발현 데스몬드 자리에서 히스톤 H3 및 RNA 중합효소 2의 높은 수준의 아세틸화 K27에 의해 설명되었습니다.근섬유에 대한 특이성은 근육에서 발현되지 않는 Pecam1 및 Vcam1 유전자좌에서 신호가 낮거나 없는 것으로 나타납니다. 이 절차를 시도하는 동안 거품을 방지하기 위해 균질화 프로브를 샘플에 적절하게 담그고, 샘플 사이의 프로브를 청소하고, 염색질 단편화를 최적화하는 것이 중요합니다. 이러한 방식으로 제조된 크로마틴은 ChIP를 위해 게놈 전체의 전사 인자 점유를 매핑하는 데 성공적으로 사용되었으며 염색질 확인 캡처 기술에도 적합해야 합니다.개발 후, 이 기술은 생쥐의 골격근에서 유전자 조절을 탐구하기 위한 유전체학 분야의 연구를 위한 길을 열었습니다. 이 절차는 쥐의 근육과 인간 환자의 생검에도 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기계적 균질화를 사용한 다음 포름알데히드 고정 핵을 정제하여 면역 침전을 위해 골격근에서 염색질을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.포름알데히드, 페놀, 클로로포름 및 프로테라아제 K를 사용하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 장갑과 안경 착용과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이러한 시약과 관련된 단계는 후드 아래에서 수행해야 합니다.

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

크로마틴 면역 침전 (ChIP)은 유전자 조절의 분자 메커니즘을 이해하는 강력한 도구입니다. 그러나, 이 방법은 기계적 전단에 의한 재현가능한 크로마틴 단편화를 얻는 데 어려움을 수반한다. 여기서, 우리는 효소 소화를 사용하여 ChIP 분석에 대한 향상된 프로토콜을 제공한다.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&amp;RUN).

FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&amp;RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

후성유전학 분야를 처음 접하는 연구자들은 CUT&amp;Tag가 ChIP 분석에 대한 훨씬 더 쉬운 대안임을 알게 될 것입니다. CUT&amp;Tag는 희귀 및 원발성 세포 집단에 대한 후성유전학 연구에 큰 도움을 주어 극소수의 세포에서 고품질 데이터를 생성했습니다. 이 프로토콜은 마우스 뒷다리 근육에서 분리된 마우스 근아세포에 대해 H3K4me1 CUT&amp;Tag 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

마우스 근모세포 연구에서 Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&#38;Tagmentation) 분석 사용

학습하세요 마우스 골격 근육에서 ChIP급 크로마틴을 준비하는 향상된 프로토콜을 통해 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 근육 위축의 분자 메커니즘 규명에 필수적인 도구를 제공합니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

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