4.11: ATP 생물 발광 분석

ATP 생물발광 분석법은 ATP 수치를 정량화하고 살아있는 대사 활성 세포를 검출하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. ATP 또는 아데노신 삼인산은 모든 살아있는 유기체의 주요 에너지원이며, "모든? 우리는 모두를 의미합니다. 세포 수준에서 ATP는 세포 호흡이라고 하는 일련의 대사 과정을 통해 생성됩니다.

오늘은 세포 호흡과 관련된 경로에 대해 간략하게 설명하겠습니다. 다음으로, ATP 생물 발광 분석의 원리를 소개하고 이 방법을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 살펴보겠습니다. 마지막으로, 우리는 과학자들이 현재 연구에서이 기술을 어떻게 적용하고 있는지 볼 것입니다.

먼저 세포 호흡을 소개해 보겠습니다. 이 현상은 여러 가지 대사 과정과 관련이 있지만 포도당 대사를 다루는 과정에 초점을 맞출 것입니다.

세포질에서 해당작용 경로는 포도당을 피루브산으로 전환하고 이 과정에서 두 개의 ATP 분자를 생성합니다. 피루브산은 미토콘드리아로 운반되어 아세틸 코엔자임 A로 전환되며, 이 과정도 이산화탄소를 생성합니다. 미토콘드리아에 있는 동안 아세틸 코엔자임 A는 트리카르복실산 또는 TCA 회로로 들어가며, 이 동안 NADH 및 FADH2의 고에너지 분자와 마찬가지로 이산화탄소가 다시 생성됩니다. 이 분자는 궁극적으로 ?운반합니까? 전자를 전자 수송 사슬 또는 ETC.

ETC 내에서 전자는 산소를 물로 전환하기 전에 내부 미토콘드리아 막의 다른 단백질 복합체 간에 순차적으로 전달됩니다. 이 과정에서 양성자는 "펌핑"됩니다. 미토콘드리아의 막간 공간으로. ATP는 이 양성자가 ATP 합성효소(ATP synthase)라는 단백질을 통과할 때 미토콘드리아 기질로 다시 들어갈 때 실제로 생성됩니다. TCA 회로와 ETC는 함께 36개의 ATP 분자를 합성합니다. 지방 및 단백질과 같은 다른 영양소 분자의 분해도 TCA 회로와 ETC에 공급되어 ATP 생산으로 이어질 수 있습니다.

이제 세포가 ATP를 생성하는 방법을 알았으니 이 분자의 세포 내 수준을 측정하는 데 일반적으로 사용되는 ATP 생물 발광 분석의 원리에 대해 알아보겠습니다.

구조적으로 ATP는 아데닌 염기, 리보오스 당, 그리고 3개의 인산기를 가지고 있으며, 인산기는 고에너지 결합으로 연결되어 있습니다. 이러한 결합은 끊어질 때 에너지를 방출하고 ATP 생물 발광 분석은 이 에너지를 활용합니다.

기본적으로이 분석법은 루시페린 화합물을 필요로하며, 이는 ?빛나는? 반딧불이와 같은 유기체와 루시페라아제(Luciferase)라고 하는 해당 촉매 효소. 산소가 있는 경우 루시퍼라제는 ATP에서 에너지를 추출하고 루시페린을 옥실루시페린으로 변환합니다. 이 반응의 부산물은 피로인산염(pyrophosphate)인데, 이는 ATP에서 얻어진 두 개의 인산기(phosphate group)를 아데노신 일인산(adenosine monophosphate) 또는 AMP 이산화탄소로 변환시키는 것과 빛 또는 발광(luminescence)입니다. 발광은 발광을 정량화하는 기계인 광도계에 의해 판독됩니다. 생성되는 발광의 양은 ATP의 양에 정비례하기 때문에 이는 세포 생존력과 신진대사에 대한 좋은 지표 역할을 합니다.

이제 ATP 생물발광 분석의 원리를 이해했으므로 일반적인 프로토콜에 대해 간략히 설명하겠습니다.

먼저, 배양 배지가 들어 있는 96웰 플레이트에 세포를 파종합니다. 세포는 밀도에 따른 변화를 설명하기 위해 다양한 밀도로 3회씩 도금됩니다. 가장 바깥쪽에 있는 우물은 4면 모두에 다른 우물로 둘러싸여 있지 않기 때문에 이 우물의 온도와 증발 속도는 가변적일 수 있습니다. 따라서 세포는 외부 웰에 도금되지 않고 대신 물로 채워져 반응에 영향을 줄 수 있는 플레이트 전체의 증발 및 온도 변화를 방지합니다. 그런 다음 플레이트는 37? C를 사용하여 세포가 배양 플레이트에 부착할 수 있도록 합니다.

그런 다음, 배지를 제거하고, 루시페라아제와 루시페린을 각 웰에 첨가하고, 반응을 촉진하기 위해 플레이트를 5-15분 동안 셰이커에 올려 놓습니다. 다음으로, 각 웰로부터의 혼합물의 일부를 백색 96웰 플레이트로 이송하고; 백색 플레이트는 빛을 위쪽으로 반사하여 보다 정확한 발광 판독을 가능하게 하기 때문에 자주 사용됩니다. 또한 기포는 후속 분석을 방해할 수 있으므로 피해야 합니다. 발광 신호는 시간이 지남에 따라 감소할 수 있으므로 광도계에서 10분 12초 이내에 플레이트를 읽습니다.

광도계 결과를 분석하기 위해 동일한 셀 밀도를 가진 웰에서 평균 발광 값을 계산합니다. 건강한 대조군 샘플과 처리된 세포 모두에서 이러한 방식으로 수집된 발광 데이터를 비교함으로써 연구자들은 실험군에서 발광이 감소된 것을 찾아 생존력 및 신진대사에 대한 특정 처리의 효과를 평가할 수 있습니다.

ATP 생물 발광 분석을 수행하는 방법을 살펴보았으므로 이제 연구 응용 프로그램에 대해 논의해 보겠습니다.

과학자들은 숙주 세포에 해를 끼치거나 죽이지 않는 새로운 항바이러스제를 개발하기 위해 항상 노력하고 있습니다. 이 연구에서는 포유류 세포를 멀티웰 플레이트에 파종하고 특정 바이러스에 감염시켰습니다. 이 샘플에 다양한 항바이러스 화합물을 첨가하고 로그 농도-반응 곡선을 생성하여 유효 농도 50 또는 EC50을 계산했습니다. EC50은 세포 생존율이 50%인 화합물의 농도입니다. 이것은 화합물의 세포 독성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 매개 변수입니다.

ATP 수치는 또한 다양한 조건에서 미토콘드리아 활동에 대한 단서를 제공할 수 있습니다. 여기에서 ATP 생물 발광 분석은 설치류의 간과 근육 세포에서 유래한 미토콘드리아 제제에 대해 수행되었으며, 이는 연구자들이 정상 조직에서 미토콘드리아 기능의 정도를 평가하는 데 도움이 되었습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 질병 상태에서 미토콘드리아 기능을 검사하는 방법을 제공하도록 확장될 수 있다는 것입니다.

과학자들은 또한 이 분석을 사용하여 생체 내 시스템에서 잠재적인 암 치료를 조사하고 있습니다. 이 예에서는 인간 종양 세포를 루시페라아제를 발현하도록 변형하고 살아있는 쥐의 뇌에 주입했습니다. 이 동물에서 종양 세포가 확립된 후 항암제로 치료했습니다. 후속 생체 내 ATP 생물 발광 분석에서는 약물에 노출된 마우스의 종양 세포가 ATP 수치가 더 낮다는 것이 밝혀졌습니다.

ATP 생물 발광 분석에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 세포 호흡 경로와 이러한 경로의 최종 산물인 ATP를 측정하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 잘 알게 되었을 것입니다. ATP 생물발광 분석법은 생리학적 및 병리학적 요인이 세포 대사 및 생존력에 미치는 영향을 연구하는 데 관심이 있는 세포 생물학자를 위한 훌륭한 스크리닝 도구 역할을 합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!