Name: 세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 암세포에서 세포막 확장과 접착력의 상관관계를 정량적으로 분석하는 방법을. DKK3가 로보포디아 형성을 촉진하여 세포 접착성을 증가시키는 과정을 이해할 수 있습니다.

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타다 부여 재단 자금이 작품.

1. 셀 확장 특성
<ol><li>SW-13, SW-신, 그리고 남서 DKK3 세포는 표준 습도 인큐베이터 37.0 ° c, 5% CO2 Dulbecco의 수정이 글 중간에 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 10000 U/mL 페니실린과 스 ('성장 매체'로 지정)에 유지 합니다.<ol>
<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 별도 6 잘 플레이트에 SW, SW-신, 그리고 남서 DKK3 라인에 대 한 잘 당 5000 셀 접시 하룻밤 불 임 유리 coverslips에 성장 매체에 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 잘 하룻밤 성장 성장 매체 발음, 후 따뜻한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 1 mL로 세포 세척 하 고 10 분 동안 3.7% 포름알데히드의 1 mL와 함께 셀을 수정.</li>
	<li>30 분 세척 초과 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL와 함께 각 잘에서 aspirate 포름알데히드와 얼룩 셀 멀리 1 mL 이온된 물 3 세척을 사용 하 여 염료. 참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 배경 셀 시각화 홍보 얼룩을 제거 하려면 필요할 수 있습니다.<ol>
<li>잘 밀고 집게를 사용 하 여 coverslips를 검색 하 고 그들에 게 아래로 얼굴을 배치 분명 장착 시 약의 방울으로 레이블이 지정 된 유리 슬라이드에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 현미경 임의로 셀 확장 분석 결과 대 한 각 coverslip에서 겹치지 않는 셀의 20 조회를 선택 합니다.<ol>
<li>보기의 각 필드의 400 배 확대에서 photomicrographs를 받아. 직접 각 20 대표 셀의 확장의 각 종류의 수를 계산. 참고: 이와 같이, 20 고립된 세포 시험 되어야 한다 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 각 시험된 조건에 대 한. Filopodia 5 미크론 이하의 기지와 단일 정점 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lobopodia는 여러 개의 apices로 길이 포함 된 확장의 5 ~ 20 미크론의 기지와 세포 확장에 의해 정의 되었다. Lamellipodia는 길이 및 또는 없이 apices 20 미크론 보다 큰 셀 확장에 의해 정의 되었다. 테스트 셀 유형에 따라 셀 확장의 크기는 다를 수 있습니다와 조정 매개 변수를 식별 해야 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>검사 6 우물에 걸쳐 각 셀 형식 (즉, 소프트웨어-13, 남서-네오, 남서 DDK)에서 각 셀 확장의 평균 수를 확인 합니다.</li>
	<li>단방향 분산 분석 (ANOVA) 통계 테스트를 사용 하 여 다른 테스트 세포 유형 사이 세포 막 확장의 평균 비율에 차이 비교 합니다.</li>
</ol>2. 접착 시험
<ol><li>SW-13, SW-신, 그리고 성장 매체에서 37.0 ° C, 5% CO2 표준 습도 인큐베이터에서 남서 DKK3 셀 유지 합니다.<ol>
<li>hemocytometer를 사용 하 여 계산 별도 6 잘 플레이트에 잘 당 SW, SW-신, 그리고 소프트웨어-DKK3의 100000 세포를 플레이트와 하룻밤 성장 매체에 성장.</li>
		<li>아래 테스트 6 시간 포인트의 각 한 격판덮개를 사용 하 여 각 세포 유형에 씨앗 6 잘 플레이트 테스트. 참고: 시간 포인트는 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>야간 보육, 따뜻한 PBS 가진 셀을 한 번 씻어 후 각 우물에 비 효소 세포 분리 솔루션 x 1의 0.5 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>세포 분리 솔루션 확산 판을 소용돌이 친다. 정의 된 시간 점 (즉, 1, 2, 3, 5, 10 및 15 분)에 지정 된 접시를 발음 하 고 1 mL 따뜻한 PBS 솔루션 세 번 씻어.</li>
		<li>세척, 사이 부드럽게 느슨하게 연결 된 셀을 분리할 접시를 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 남아 있는 PBS와 3.7% 포름알데히드 10 분의 1 mL와 함께 접시에 남은 셀 첨부 수정 발음.</li>
	<li>30 분에 대 한 0.05% 크리스탈 바이올렛의 1 mL로 세포를 얼룩이 다음 과잉 염료 이온된 물 1 mL로 멀리 세척. 셀 시각화를 촉진 하는 세척 적정 참고: 염료의 통풍 관의 수준에 따라 몇 가지 추가 세척 셀 시각화를 홍보 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>100 x 확대 가벼운 현미경을 사용 하 여, 각 잘 각 접시에 나머지 연결 된 셀을 계산 합니다. 참고: 투명 눈금자 또는 좋은 펜 접시의 하단 측면에 가이드 표시의 사용을 동일한 세포의 반복 계산을 피하기 위해 도움이 됩니다.</li>
	<li>각 접시에 잘 당 연결 된 셀의 평균 수를 확인 합니다.</li>
	<li>양방향 ANOVA 통계 테스트를 사용 하 여 주어진된 시간 동안 SW, SW-신, 그리고 남서 DDK3 셀 사이의 셀 분리의 속도 비교 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+cancer%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li>
<li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer%3A+the+emerging+role+of+Dickkopf-3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297(2016).</li>
<li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin%3A+Invasive+filopodia+promoting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li>
<li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164(2017).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 생체 외에서 양적 방법 용이성, 몇 구 덩이-폭포, 그리고 다양 한 테스트 조건에 대 한 적용할 수 있는 안정적인 재현성 셀 확장의 특성을 설명 합니다. 또한, 간단 하 고, 정량 접착 및 운동 성 분석 실험 세포 막 확장에 관찰된 변경의 잠재적인 기능적 중요성을 상관 관계를 동시에 수행할 수 있습니다.
그러나, 이러한 방법을 몇 가지 잠재적인 제한이 발생할 수 있습니다. 첫째, 여기 셀 확장의 종류를 식별 하기 위해 지정 된 표준 adrenocortical 소프트웨어-13 셀 형태학에 기초 하 고 따라서 가능성이 필요한 분류 매개 변수 다른 세포 유형 및 실험 조건에 적용 될 때에 구체화. 또한, 연장된 시간 과정 실험, 세포 주기 세포 죽음에 세포 막 확장 변경의 잠재적인 영향 간주 해야 합니다.
둘째, 프로토콜 간 관찰자 유사 인해 분석 결과 재현성을 제한할 수 있는 심사 관에 의해 잠재적인 개별...

Dysregulated WNT 신호 adrenocortical 악성1에 중요 한 역할을 한다. 이 연구에 사용 하는 방법 조사 여부 DKK3의 입을, WNT 신호의 부정적인 레 귤 레이 터 부 신 피 질에서 dedifferentiation 이벤트 나타내고 셀 확장 레 퍼 토리 변화의 맥락에서 종양의 형성을 촉진 한다. DKK3 38 kDa 분 비는 N 맨끝 신호 펩 티 드와 당단백질 이며 그 적용된 식 세포 주기 검거 귀착되 공격적인 악성 행동을 저해 및 엽 상피 반전 이전 학문은 설명 했다 전환2.
Adrenocortical 암 (ACC) 및 다른 암 악성 동작, 부분에서 주변 표면으로 인터페이스 하는 종양 세포의 기능에 의해 영향을 포함 하 여 기질에 종양 세포 내 습을 촉진 하 고 마이그레이션3. 암 진행에 특정 세포 막 확장의 역할은 filopodia 형성을 통해 주로 다양 한 문맥에서 점점 시연 되 고. 예를 들어 L-타입 칼슘 채널의 overexpression filopodia 형성을 유도 하 여 종양 세포 침공4홍보 발견 되었습니다. 마찬가지로, Fascin, 최소한 단백질 바인딩 하는 걸 정상 조직에서 표현 이기도 overexpressed filopodia 형성5와 협회에서 암 세포에 합니다. 그러나 Lobopodia 대형 엑스트라 세포 매트릭스를 통해 효과적으로 마이그레이션할 비 악성 섬유 아 세포,, 그것은 보였다 fibrosarcoma 셀 셀 마이그레이션을 촉진 하기 위하여 lobopodia 대신 metalloproteinase 활동에 의존 하 고 침략6. 우리는 종양으로 나타났습니다 진압, Ras 연결 도메인 가족 1 isoform (RASSF1A)를 포함 하 여 및 DKK3, 함수 cytoskeletal 요소를 변경 하 고 lamellipodia 형성 증진과 침략 속성7,8방해 구를 두 다 수 있습니다.
이와 같이, 그것은 발암 및 세포 막 확장 변경, 특히 filopodia, lobopodia, 및 lamellipodia 테스트 조건 하에서 형성 평가의 관계에 관련 된 유전자의 영향을 특성에 중요 한. 현재 상태-최첨단 기술을 데이터 수집 및 해석에 대 한 점점 더 정교한 현미경 방법, 형광 라벨, 복잡 한 컴퓨터 알고리즘의 사용을 포함 합니다. 이러한 방법은 새롭고 강력한 분석 도구를 제공 하는 동안 그들의 광범위 한 사용과 세포 생물학 실험에 그들의 복잡도 제한 합니다. 또한, 정확한 정량화 및 셀 확장 형태에 변화의 관찰 아니다 일반적으로 측정된9,10. 반면, 여기 셀 확장 변경 표준 현미경 기술과 쉽게 적응할 수 있는 생체 외에서 메서드를 사용 하 여 정확 하 게 단정 하는 기술을 소개 합니다. 이러한 메서드는 또한 동시에 분석 하는 각 셀에 대 한 각 셀 확장 종류 계량 하 고 세포 막 확장 레 퍼 토리에 전반적인 변화를 결정 합니다. 우리는 또한 어떻게 이러한 변화 세포 접착 속성에 관련 된 수 보여줍니다.
실험 예를 들어, 우리는 소프트웨어-13, SW-DDK3, pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터와 안정적으로 페 되었습니다 하 고 constitutively DKK3, 아드레날린 선에 차별화 요소를 overexpresses 지정의 이전에 만든된 셀 라인을 사용 합니다. 비 페 SW-13 셀과 남서-13 셀 안정적으로 빈 벡터 (pCMV6-항목), 소프트웨어-네오, 지정 된 페 실험 컨트롤 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 수정된 독수리 매체 (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td>는 <td>태아 소 세럼과 페니클린 및 스트렙토마이신으로 보충</td></tr>되었습니다<tr><td>. Deulbeco의 인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X 용액, 직접</td></tr><tr><td>사용 3.7% 포름알데히드&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>희석 주식 용액</td></tr><tr><td>0.05% 크리스탈 바이올렛&nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>희석 원료 용액</td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA 현미경 400X 배율&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NA 세포 해리 용액 비효소 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&nbsp;</td><td>1X 솔루션, 직접 사용</td></tr></tbody></table>

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

세포 막의 확장 레 퍼 토리 그들의 접착제와 철새 잠재력을 포함 하 여 암 세포의 다양 한 악성 동작을 조절 한다. 정확 하 게 분류 셀 확장을 계량 하 고 세포의 접착 능력에 미치는 영향을 측정 하는 능력은 어떻게 셀 신호 이벤트 영향 암 세포 행동 및 공격 성을 결정 하는 중요 한. 여기, 우리가 시험관에서 설계 및 방법의 사용은 셀 확장 정량화 함께에서 설립 체 외에 모델에 접착 용량 분석 결과와 adrenocortical 암 (ACC)에 대 한 설명. 특히, 우리는 효과 DKK3의 putative 종양 억제기와 프로 차별화 요소, ACC 셀 라인, 소프트웨어-13의 막 확장 표현 형에 테스트합니다. 비교적 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 제공 하기 위해 이러한 분석을 제안 하 고 쉽게 해석할 통계를 다양 한 실험 조건에서 이러한 특성을 측정 합니다.

위의 분석 실험을 사용 하 여 셀 확장 형태학 및 세포 접착 속성에 DKK3 overexpression의 효과 설립된 ACC 셀 라인 SW-13, 체 외에서테스트 되었습니다. 셀 DKK3 overexpressing는 안정적으로 남서 13 셀 Myc DDK 태그 pCMV6-항목/DKK3 플라스 미드 벡터 및 소프트웨어 DKK3로 지정 된 transfecting에 의해 생성 되었다. 마찬가지로, 안정적으로 빈 벡터 pCMV6 항목과 transfected 세포 transfection 고 뿌리고 컨트롤로 생성 되었고 SW-네오로 정의. SW-13 셀 추가 부모 셀 컨트롤로 사용 되었다. SW-DKK3에서 DKK3의 overexpression 양적 실시간 PCR에 의해 확인 되었다 그리고 서쪽 오 점 기술8.
간단...

이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

전반적인 목표는 세포 확장 레퍼토리에 대한 실험적 변경의 영향과 이것이 암의 세포 접착 기능과 어떤 관련이 있는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 세포 부착, 운동성 및 침입과 같은 세포 행동을 조절하는 데 있어 세포막 확장 레퍼토리의 주요 역할을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행이 비교적 간단하고 다양한 실험 조건에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 국소 진행성 또는 전이성 암의 치료 또는 진단으로 확장되는데, 이는 접착 및 침습적 능력에서 종양 세포의 변화와 관련된 세포 확장 레퍼토리의 변화를 정확하게 정량화하는 데 도움이 되기 때문입니다. 또한 세포 확장 형성 및 정상적인 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 이온 채널 조절과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연 및 기록은 세포 확장 단계의 계수가 때때로 모양의 미묘함 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.이미징 하루 전에 혈구계를 사용하여 섭씨 37도의 인큐베이터와 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 자란 SW 13, SW Neo 및 SW DKK3 세포를 계수합니다. 멸균 유리 커버 슬립을 3 개의 6 웰 플레이트로 구성된 개별 웰에 놓습니다. 각 세포주에 대해 별도의 플레이트를 사용하고 웰당 5, 000개의 세포 밀도로 3개의 세포주를 이 6개의 웰 플레이트에 플레이트화합니다.세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%를 하룻밤 동안 넣습니다. 다음날, 각 우물에서 성장 배지를 흡인합니다. 그런 다음 1ml의 따뜻한 PBS로 세포를 씻습니다.그런 다음 3.7% 포름알데히드 1ml를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정합니다. 세포를 정착액에 10분 동안 그대로 두십시오. 고정이 완료되면 포름 알데히드를 흡인하십시오.각 웰에 0.05% 크리스탈 바이올렛 1밀리리터를 첨가하여 30분 동안 세포를 염색합니다. 다음으로, 우물당 1ml의 탈이온수로 세포를 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다. 다음으로, 라벨이 붙은 유리 슬라이드에 투명 장착 시약 한 방울을 놓습니다.그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 꺼내 장착 시약 위에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 슬라이드에 얼룩진 모든 커버슬립을 장착한 후 광학 현미경으로 각 커버슬립에서 겹치지 않는 셀에 대한 20개의 무작위 보기를 선택합니다. 각 시야에 대해 400 강도 배율의 사진 현미경 사진을 찍습니다.그런 다음 20개의 대표 셀 각각에서 확장 유형의 수를 관찰하고 계산합니다. 정의와 텍스트 프로토콜을 사용하여 막 확장을 filopodia, lobopodia 또는 lamellipodia로 분류하는 방법을 안내합니다. 셀 확장 유형을 처음 계산할 때 검토를 위해 참조 이미지를 유지하는 것이 도움이 될 수 있습니다.가능한 경우, 실험 표본에 대해 맹검 방식으로 계수하면 추가적인 객관성을 제공할 수 있습니다. 조사된 3개의 세포주 각각에서 세포당 각 유형의 평균 확장 수를 결정합니다. 일원 분산 분석을 사용하여 서로 다른 세포 유형 간의 세포막 확장의 평균 백분율 차이가 통계적으로 유의한지 검정합니다.분석 하루 전에 혈구계를 사용하여 SW 13, SW Neo 및 SW DKK3 세포를 계수합니다. 웰당 100, 000개의 세포 밀도로 이러한 세포를 테스트할 6개의 지정된 시점 각각에 대해 하나의 플레이트를 사용하여 6개의 웰 플레이트에 플레이트합니다. 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%를 하룻밤 동안 넣습니다.다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 따뜻한 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 0.5ml의 단일 강도 비효소 세포 해리 용액을 각 웰에 추가합니다. 접시를 부드럽게 휘젓어 첨가된 용액이 고르게 펴 바릅니다.정의된 시간 동안 용액으로 플레이트를 배양합니다. 각 시점의 끝에서 지정된 플레이트를 흡인합니다. 각 흡인 직후 1ml의 따뜻한 PBS로 세포를 씻으십시오.그런 다음 플레이트를 부드럽게 두드려 느슨하게 부착된 셀을 분리합니다. 간헐적으로 두 번 더 두드리면서 세탁을 반복합니다. 마지막으로, 남아있는 PBS를 흡인하고 플레이트에 남아있는 세포를 1 밀리리터의 3.7 % 포름 알데히드로 고정합니다.고정이 완료되면 포름 알데히드를 흡인하십시오. 그런 다음 각 웰에 0.05% 크리스탈 바이올렛 1밀리리터를 첨가하여 세포를 염색합니다. 염색이 완료되면 우물당 1ml의 탈이온수로 세포를 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다.100 강도 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 플레이트에 대해 각 웰에 남아 있는 부착된 세포를 계산합니다. 그런 다음 테스트된 3개의 세포주에 대해 서로 다른 시점 동안 분리된 상태로 남아 있는 세포의 비율을 결정합니다. 양방향 분산분석을 사용하여 세 세포주 간의 차이와 세포 분리 속도를 검정하면 통계적으로 유의합니다.크리스털 바이올렛 염색 대조군 SW 13 및 SW Neo 세포는 대부분 필로포디아(filopodia)와 라멜리포디아(lamellipodia)를 형성했습니다. 대조적으로, DKK3 발현 세포는 얇은 판골이 거의 완전히 없고 필로포디아가 거의 없는 더 많은 전두엽을 형성했습니다. 또한 DKK3 발현 세포와 대조 세포주 사이의 극성 차이에 주목하십시오.그래프는 테스트된 3개의 세포주에서 서로 다른 세포 확장의 비율을 보여줍니다. DKK3 발현 세포에서 엽족의 비율이 현저히 높다는 점에 주목하십시오. 선 그래프는 X축에 표시된 시점에 대해 해리 용액으로 처리한 후 플레이트에 부착된 상태로 남아 있는 세포의 백분율을 보여줍니다.최대 10분까지의 모든 시점에서 DKK3 발현 세포는 대조 세포에 비해 상당히 높은 세포 부착 강도를 보여주었습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되는지 여부에 따라 실험 설정에 따라 하루에서 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 확장 형태의 변화가 접착 용량에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 동영상을 시청한 후에는 암세포 접착 특성의 변화와 관련하여 세포 확장을 정확하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 행운을 빌며 시청해 주셔서 감사합니다.

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Cancer Research

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방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.

MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

이 프로토콜에서, 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법을 기반으로 하는 세포 퍼지는 분석의 실험 절차를 제시합니다. 당사는 형광으로 표지된 세포의 편견없는 세분화와 세포 확산 중 라멜리포디아 역학의 정량적 분석을 위한 오픈 소스 계산 도구를 제공합니다.

셀 확산 시 셀 엣지 역학의 정량적 분석

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

배우세요 암세포에서 세포막 확장과 접착력의 상관관계를 정량적으로 분석하는 방법을. DKK3가 로보포디아 형성을 촉진하여 세포 접착성을 증가시키는 과정을 이해할 수 있습니다.

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

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