세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

전반적인 목표는 세포 확장 레퍼토리에 대한 실험적 변경의 영향과 이것이 암의 세포 접착 기능과 어떤 관련이 있는지 확인하는 것입니다. 이 방법은 세포 부착, 운동성 및 침입과 같은 세포 행동을 조절하는 데 있어 세포막 확장 레퍼토리의 주요 역할을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행이 비교적 간단하고 다양한 실험 조건에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 국소 진행성 또는 전이성 암의 치료 또는 진단으로 확장되는데, 이는 접착 및 침습적 능력에서 종양 세포의 변화와 관련된 세포 확장 레퍼토리의 변화를 정확하게 정량화하는 데 도움이 되기 때문입니다. 또한 세포 확장 형성 및 정상적인 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 이온 채널 조절과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연 및 기록은 세포 확장 단계의 계수가 때때로 모양의 미묘함 때문에 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

이미징 하루 전에 혈구계를 사용하여 섭씨 37도의 인큐베이터와 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 자란 SW 13, SW Neo 및 SW DKK3 세포를 계수합니다. 멸균 유리 커버 슬립을 3 개의 6 웰 플레이트로 구성된 개별 웰에 놓습니다. 각 세포주에 대해 별도의 플레이트를 사용하고 웰당 5, 000개의 세포 밀도로 3개의 세포주를 이 6개의 웰 플레이트에 플레이트화합니다.

세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%를 하룻밤 동안 넣습니다. 다음날, 각 우물에서 성장 배지를 흡인합니다. 그런 다음 1ml의 따뜻한 PBS로 세포를 씻습니다.

그런 다음 3.7% 포름알데히드 1ml를 각 웰에 첨가하여 세포를 고정합니다. 세포를 정착액에 10분 동안 그대로 두십시오. 고정이 완료되면 포름 알데히드를 흡인하십시오.

각 웰에 0.05% 크리스탈 바이올렛 1밀리리터를 첨가하여 30분 동안 세포를 염색합니다. 다음으로, 우물당 1ml의 탈이온수로 세포를 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다. 다음으로, 라벨이 붙은 유리 슬라이드에 투명 장착 시약 한 방울을 놓습니다.

그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 꺼내 장착 시약 위에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 슬라이드에 얼룩진 모든 커버슬립을 장착한 후 광학 현미경으로 각 커버슬립에서 겹치지 않는 셀에 대한 20개의 무작위 보기를 선택합니다. 각 시야에 대해 400 강도 배율의 사진 현미경 사진을 찍습니다.

그런 다음 20개의 대표 셀 각각에서 확장 유형의 수를 관찰하고 계산합니다. 정의와 텍스트 프로토콜을 사용하여 막 확장을 filopodia, lobopodia 또는 lamellipodia로 분류하는 방법을 안내합니다. 셀 확장 유형을 처음 계산할 때 검토를 위해 참조 이미지를 유지하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

가능한 경우, 실험 표본에 대해 맹검 방식으로 계수하면 추가적인 객관성을 제공할 수 있습니다. 조사된 3개의 세포주 각각에서 세포당 각 유형의 평균 확장 수를 결정합니다. 일원 분산 분석을 사용하여 서로 다른 세포 유형 간의 세포막 확장의 평균 백분율 차이가 통계적으로 유의한지 검정합니다.

분석 하루 전에 혈구계를 사용하여 SW 13, SW Neo 및 SW DKK3 세포를 계수합니다. 웰당 100, 000개의 세포 밀도로 이러한 세포를 테스트할 6개의 지정된 시점 각각에 대해 하나의 플레이트를 사용하여 6개의 웰 플레이트에 플레이트합니다. 세포를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 이산화탄소 5%를 하룻밤 동안 넣습니다.

다음 날, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 따뜻한 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 0.5ml의 단일 강도 비효소 세포 해리 용액을 각 웰에 추가합니다. 접시를 부드럽게 휘젓어 첨가된 용액이 고르게 펴 바릅니다.

정의된 시간 동안 용액으로 플레이트를 배양합니다. 각 시점의 끝에서 지정된 플레이트를 흡인합니다. 각 흡인 직후 1ml의 따뜻한 PBS로 세포를 씻으십시오.

그런 다음 플레이트를 부드럽게 두드려 느슨하게 부착된 셀을 분리합니다. 간헐적으로 두 번 더 두드리면서 세탁을 반복합니다. 마지막으로, 남아있는 PBS를 흡인하고 플레이트에 남아있는 세포를 1 밀리리터의 3.7 % 포름 알데히드로 고정합니다.

고정이 완료되면 포름 알데히드를 흡인하십시오. 그런 다음 각 웰에 0.05% 크리스탈 바이올렛 1밀리리터를 첨가하여 세포를 염색합니다. 염색이 완료되면 우물당 1ml의 탈이온수로 세포를 세 번 세척하여 과도한 얼룩을 제거합니다.

100 강도 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 플레이트에 대해 각 웰에 남아 있는 부착된 세포를 계산합니다. 그런 다음 테스트된 3개의 세포주에 대해 서로 다른 시점 동안 분리된 상태로 남아 있는 세포의 비율을 결정합니다. 양방향 분산분석을 사용하여 세 세포주 간의 차이와 세포 분리 속도를 검정하면 통계적으로 유의합니다.

크리스털 바이올렛 염색 대조군 SW 13 및 SW Neo 세포는 대부분 필로포디아(filopodia)와 라멜리포디아(lamellipodia)를 형성했습니다. 대조적으로, DKK3 발현 세포는 얇은 판골이 거의 완전히 없고 필로포디아가 거의 없는 더 많은 전두엽을 형성했습니다. 또한 DKK3 발현 세포와 대조 세포주 사이의 극성 차이에 주목하십시오.

그래프는 테스트된 3개의 세포주에서 서로 다른 세포 확장의 비율을 보여줍니다. DKK3 발현 세포에서 엽족의 비율이 현저히 높다는 점에 주목하십시오. 선 그래프는 X축에 표시된 시점에 대해 해리 용액으로 처리한 후 플레이트에 부착된 상태로 남아 있는 세포의 백분율을 보여줍니다.

최대 10분까지의 모든 시점에서 DKK3 발현 세포는 대조 세포에 비해 상당히 높은 세포 부착 강도를 보여주었습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되는지 여부에 따라 실험 설정에 따라 하루에서 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 세포 확장 형태의 변화가 접착 용량에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 암세포 접착 특성의 변화와 관련하여 세포 확장을 정확하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 행운을 빌며 시청해 주셔서 감사합니다.