Name: 뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 뼈 재생을 위한 BMP2 변이체의 화학 클릭 결합법. 이 방법은 저용량 BMP2로 골형성을 촉진하여 기존 기술의 부작용을 줄이고 비유합성 골결손 치료 효과를 향상시킵니다.

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저자는 pyrrolysyl-tRNA를 인코딩 하는 플라스 미드를 제공 하 고 제공 하는 pRSFduet pyrtRNAsynth 인코딩 해당 aminoacyl-tRNA 합성 박사 M. Rubini (Konstanz, 독일) 감사 합니다.

1. 생산의 BMP2 변형 BMP2-K3Plk
<ol><li>복제의 BMP2-K3Plk 사이트 감독 mutagenesis PCR를 사용 하 여 12<ol>
<li>인간의 성숙 BMP2 증폭 (hmBMP2) p25N hmBMP2 벡터에서 ( 재료의 표참조) 앞으로 뇌관 (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) 및 역방향 뇌관 (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 황색 정지 codon (소개 태그) BMP2´s 성숙 부분의 첫 번째 신의 위치에. H2O, 10 µ L의 PCR 반응 혼합 33.5 µ L, 10 µ M dNTP 재고 솔루션의 1.5 µ L, 앞으로 뇌관 (10 pmol / µ L), 역방향 뇌관 (10 pmol / µ L), p25N-hmBMP2 (10 ng / µ L)의 1 µ L의 1.5 µ L의 1.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응을 수행합니다 그리고 DNA 중 합 효소의 1 µ L ( 재료의 표참조)에 열 cycler (변성 5 분 동안 95 ° C에서 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C에서 신장 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장에 대 한 60 ° C에서 어 닐 링 동안 95 ° C에서 변성의 30 주기).</li>
		<li>제조 업체의 권장 사항에 따라 상용 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 45 분 동안 37 ° C에서 제한 효소 NdeI PCR 제품을 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 효소 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 제한 효소 BamHI로 PCR 제품을 위한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화 효소</li>
		<li>H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 2 h 45 분 동안 37 ° C에서 NdeI와 pET11a-pyrtRNA 벡터를 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 BamHI로 pET11a pyrtRNA 벡터에 대 한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화.</li>
		<li>소화 되지 않은 벡터에서 소화 벡터를 분리 하 고 소화 잔재 여 agarose 젤 전기 이동 법 (0.8 %agarose, 100 V에서 60 분). 2 h 100을 사용 하 여 실 온 (RT)에서 소화 pET11a pyrtRNA 등뼈와 소화 BMP2 K3TAG 삽입을 위하여 pET11a pyrtRNA 백본 및 34.5의 ng ng의 BMP2 K3TAG 삽입 (어 금 니 비율 1:3). 반응 혼합물 DNA 등뼈 및 삽입, 리가 버퍼의 2 µ L, DNA 리가, 그리고 H2O 20 µ L의 총 볼륨의 1 µ L를 포함 한다.</li>
		<li>BL21(DE3) 박테리아에 pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 및 pSRF-듀엣-pyrtRNAsynth의 공동 변화를 수행:<ol>
<li>50 추가 30 분 동안 얼음 50 42 ° C에서 열 충격에 혼합물을 배치 하는 각 플라스 미드는 박테리아의 ng s, 5 분 동안 얼음에, 혼합물, Lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L을 추가 하 고 60 분 동안 300 rpm에서 흔들어.</li>
			<li>미리 데워 진된 대 (50 µ g/mL)에 세균성 혼합물의 100 µ L를 확산 / 암 피 실린 (100 µ g/mL) 접시, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>표현과 BMP2 K3Plk의 정화 13 , 14<ol>
<li>50 µ g/mL 대와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c.에 파운드 매체의 50 mL에서 하룻밤 단일 식민지를 전파</li>
		<li>야간 문화 1시 20분 대의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린, 보완 하는 훌륭한 국물 (TB) 매체의 800 mL로 희석 하 고 0.7의600 세이 때까지 37 ° C에서 성장 한다. 10 m m의 최종 농도를 propargyl-L-리 신을 추가 합니다. 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도 전에 문화에서 100 µ L 샘플을 수집 합니다.</li>
		<li>1 m m의 최종 농도에 IPTG의 추가 의해 유전자 발현을 유도. 180 rpm에서 궤도 통에 16 h 37 ° C에서 문화를 성장. 문화에서 100 µ L의 샘플을 수집 합니다.</li>
		<li>원심에서 9000 x g 30 분 삭제에 대 한 전체 문화 상쾌한, 그리고 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가)와: TBSE 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA))의 30 mL에서 세균 펠 릿 resuspend. 주의: 연기 후드 2-mercaptoethanol을 처리 합니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 증기 나 미스 트의 흡입을 하지 마십시오. 2-mercaptoethanol 연기 후드를 포함 하는 버퍼와 물의 resuspension의 모든 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>무게는 빈 원심 분리기 비 커와 빈 비 커에 resuspended 펠 릿을 전송. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿으로 비 커를 무게. 펠 릿의 무게를 계산 하려면 빈 비 커의 무게를 뺍니다. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 짧은 기간에-20 ° C에 또는 긴 기간에서-80 ° C에서 펠 릿을 고정 합니다. 프로토콜을 다시 시작 시 실시간에 펠 릿을 녹여</li>
		<li>STE 버퍼 (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 375 mM 자당, 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가))에 펠 릿을 resuspend. STE 버퍼의 200 mL를 사용 하 여 펠 릿의 모든 10 g에 대 한.</li>
		<li>얼음 (10 분 40 s 펄스, 20 s 브레이크, 및 30% 진폭)에 정지 sonicate 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게. 4 번 쥡니다 및 원심 분리 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>TBS 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL에 펠 릿을 resuspend. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.</li>
		<li>갓 추가 80 U/mL nuclease (예, Benzonase)와 nuclease 버퍼 (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 m m MgCl2) 펠 릿 resuspend 펠 릿의 10 mL/g를 사용 하 여. 교 반 접시 (30 rpm)에 실시간에 하룻밤 정지를 품 어.</li>
		<li>트리톤 버퍼 추가 (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜) 정지에. 트리톤 버퍼 추가 현 탁 액의 0.5 볼륨 부분에 해당 합니다. RT (교 반)에서 10 분 동안 품 어. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.</li>
		<li>펠 릿 테 버퍼 (100 mM Tris, 20 mM EDTA)에 resuspend 8 mL/g의 펠 릿을 사용 하 여. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.</li>
		<li>4 mL/g 25 m m NaAc pH 5.0의 1 m m dithiothreitol (DTT) (갓 추가)와 6 M GuCl의의 5 mL/g을 추가 하 여 펠 릿을 resuspend. 교 반 접시 (30 rpm)에 4 ° C에서 하룻밤 정지를 품 어.</li>
		<li>20 분 동안 75500 x g에서 원심. 상쾌한 펼친된 단위체 BMP2 단백질을 이제 포함 되어 있습니다. 상쾌한 고 집중 하는 집중에 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 20 세/mL에 추출이 물이 세포 ( 재료의 표참조)를 수집 합니다.</li>
		<li>(30 rpm)를 교 반 하면서 Renaturation 버퍼 (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25mm 균열, 5 mM EDTA, 1mm 티 아 황산 (GSSG) 2 m m 티 (GSH))를 단일 상품에 집중된 단위체 추가 합니다. 어둠 속에서 120 h RT에서 품 어. 참고: 동안이 부 화 기간, refolding occours. 앞으로이 단계에서 솔루션에는 접힌된 dimeric BMP2-K3Plk 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>3.0 집중 셀에 10 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 dialyzed 솔루션 집중된 HCl. Dialyze 1 m HCl 집중 m에 대 한 솔루션을 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>버퍼는 (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 여 솔루션을 equilibrate. 버퍼 A 해당 하는 솔루션의 30% 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 4700 x g 15 분에서 솔루션 원심</li>
		<li>이온 교환 버퍼 A. 부하 equilibrated 열에 단백질 해결책의 150 mL와 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템15 에 대 한 열 equilibrate (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀, 2 M NaCl) 버퍼 B의 선형 그라디언트를 사용 하 여 분수 elute 버퍼 B. 수집 2 mL 분수의 100 mL를 사용 하 여. 참고: 총 열 량에 따라 열에 로드 하기 전에 단백질을 집중 한다. 최종 단백질 볼륨 이어야 한다 < 총 열 량의 5%.</li>
		<li>SDS Polyacrylamide 젤 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE) 16 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩17 ( 재료의 표참조)에 의해 각 분수의 20 µ L를 분석 합니다. 참고: SDS 페이지 젤 쇼 분수 이합체 (26 kDa)와 포함 하는 단위체 (13 kDa) 분수를 포함 하는 Coomassie 화려한 블루 스테인드.</li>
		<li>포함 하는 이합체 분수 풀. 1mm HCl (5 리터 볼륨)에 대 한 4 ° C에서 하룻밤 분수를 포함 하는 이합체의 풀 dialyze 10 kDa 원심 필터 단위 집중을 사용 하 여 최종 제품을 집중 ( 재료의 표참조). (12%) SDS Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩에 의해 최종 제품을 분석. 참고: Coomassie 화려한 블루에 밴드 스테인드 SDS 페이지 젤 26 kDa에 하나의 밴드를 표시 해야 합니다. 이것은 최종 BMP2-K3Plk 제품입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 구리 (I)의 최적화-촉매 Alkyne-아 지 드 Cycloaddition (CuAAC) 조건
<ol><li>나트륨 하는데 (NaAsc) 및 구리 (II) 황산 염 (CuSO 4 )의 효과 야생 타입 BMP2에 (BMP2-WT)<ol>
<li>20 µ M를 품 어 BMP2-WT CuSO4NaAsc의 다른 비율. 50 µ L 볼륨에 0.5 m NaAsc m와 0.5 m m CuSO4 (시작 농도)를 사용 합니다. NaAsc의 다음 비율 CuSO4진행: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), 0.5 m m에 지속적인 CuSO4 농도 유지 하 고 NaAsc의 농도 적절 하 게 조정. 실시간에서 H2O (20 rpm) 회전 믹서에 반응을 밤새 수행 하는 방법</li>
		<li>5 %2-mercaptoethanol을 포함 하는 로드 버퍼를 추가 하 여 감소 샘플을 준비 하 고 6 분 분석 감소 및 SDS Polyacrylamide 여 비 감소 샘플 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE)와 화려한 Coomassie 파란 얼룩이 지 젤 95 ° C에서 샘플을 품 어. SDS 페이지 젤 스테인드 Coomasie 13 kDa (감소 이용) 26 kDa와 높은 분자량 (비 감소 조건)의 범위에서 밴드를 표시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
효과 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 반응에 아민 (THPTA)
	<ol>
<li>20 µ M를 품 어 BMP2-K3Plk CuSO4THPTA의 다른 비율. 사용 하 여 5 mM NaAsc, 그리고 200 µ M 3-Azido-7-hydroxycoumarin (일정 하 게 유지 NaAsc와 3-Azido-7-hydroxycoumarin). 50 µ M THPTA와 CuSO4 의 0.5 m m를 사용 하 여 농도 시작으로. CuSO4THPTA의 다른 비율을 사용 하 여: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). 회전 믹서 (20 rpm)에 실시간에 24 h에 대 한 반응에서 H2O (50 µ L 총 볼륨)를 수행.</li>
		<li>커플링, 시 3-Azido-7-hydroxycoumarin 형광 염색 된다. 감소 및 감소 비 조건에서 샘플을 준비 하 고 SDS 페이지 분석. 3-Azido-7-hydroxycoumarin에 대 한 특정 파장 여기 채널에서 젤 시각화 (λabs 404 = nm; λem 477 = nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 공유 결합 기술 BMP2-아 지 드를 K3Plk의 공업화 Agarose 구슬
<ol><li>2 h RT에는 rotati에 대 한 반응 버퍼 (0.1 m M HEPES pH 7.0, 3.9 M 요소, 50 µ M CuSO4, 250 µ M THPTA, 5mm 나트륨 하는데)에 500 µ L의 전체 볼륨에 아 지 드 활성화 agarose 구슬의 20 µ L로 BMP2 K3Plk 또는 BMP2 WT (부정적인 제어 사용) 20 µ M를 품 어 ng 믹서 (20 rpm)입니다. 5 mM EDTA (최종 농도)를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>RT에 회전 믹서 (20 rpm)에 15 분 동안 품 어. 실시간 수집에 1 분 동안 20000 x g에서 샘플은 supernatants 원심.</li>
	<li>4 M MgCl2, 1000 µ L와 함께 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1000 µ L 세 번의 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), 1000 µ L와 구슬 포함 된 펠 릿 세 번 씻어. 모든 세척 단계에서 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심과 supernatants를 수집 합니다. 4 ° c.에 PBS의 1000 µ L에 결합 된 구슬 저장 주의: 제거는 상쾌한 하는 동안 비드 펠 렛을 방해 하지 마십시오.</li>
</ol>4. BMP 수용 체를 분류 존재와 고정된 BMP2-K3Plk를 사용 하 여 텍사스 레드의 생물 학적 활동의 유효성 검사 나 Ectodomain BMPR IA ( EC )
<ol><li>50을 품 어 텍사스 레드의 1 µ M와 기능성된 BMP2 K3Plk 구슬의 µ L 회전 믹서 (20 rpm)에 1 시간에 대 한 실시간에 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl)의 150 µ L 함께 BMPR IAEC 를 분류.</li>
	<li>20000 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 1 분 동안에 구슬 원심 워시 1000 µ L의 HBS500 버퍼와 구슬. 세척 단계는 추가 3 회 반복 한다. 각 후 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 세척 단계.</li>
	<li>PBS의 500 µ L에 구슬 resuspend 고 유리 커버 슬라이드에 50 µ L 플라스틱. 561 또는 594 nm 사이 현미경 필터를 설정 합니다. 텍사스 레드-BMPR-IAEC검색-BMP2-K3Plk 기능성 형광 현미경 검사 법 및 사진을 사용 하 여 구슬.</li>
</ol>5. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 측정 전에 BMP2 K3Plk 생산 고는 결합 후 반응의 생체 외에서 Bioactivity를 증명 하는 식.
<ol><li>
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 분석 결과
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.</li>
		<li>96-잘 microplate에 3 × 104 셀/잘의 밀도에 씨앗 C2C12 세포. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 품 어 0.5-200의 C2C12 세포에 100 µ L/잘 DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)의 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서의 BMP2 WT 또는 BMP2 K3Plk nM.</li>
		<li>매체를 제거 하 고 잘 당 PBS의 100 µ L로 세포 세척. 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L/잘 1 h에 대 한 실시간에 세포를 lyse (1 %NP-40, 0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) 흔들어에 접시 (220 rpm).</li>
		<li>세포 lysate를 100 µ L/ALP 버퍼 (0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2)의 우물 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (갓 추가) 추가.</li>
		<li>405에서 흡수 측정 여러 리더 알프 버퍼 및 모든 5 분을 추가 하는 색상의 개발 완료 될 때까지 후에 nm. 복용량 응답 곡선 및 로지스틱 모델을 사용 하 여 EC50 값 생성 y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/0x)p).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 얼룩
	<ol>
<li>Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.</li>
		<li>씨앗의 3 × 104 셀/96-잘 microplate에 밀도에 세포를 C2C12. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 20 µ L/잘 BMP2 K3Plk 결합 된 구슬의 추가. BMP2 K3Plk 결합 구슬 1000 µ L의 PBS 정지에 있습니다.</li>
		<li>DMEM에 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 솔루션을 준비 합니다. 그리고 전자 렌지 (600 W 3 분)에서 녹여 사용까지 37 ° C에서 물 욕조에 진정 하자.</li>
		<li>각 잘 (취재 구슬과 셀)에서 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 20 µ L를 추가 합니다. 20 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심 분리기 80 µ L DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)를 추가 하 고 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>매체, 응고 0.4 %agarose 분리 하지 않도록 주의 하 고 제거 합니다. 추가 100 µ L/우물 1 단계 NBT/BCIP (니트로 블루 tetrazolium 염화 물, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-톨루이 소금) 기판 솔루션.</li>
		<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소는 명백 하 게 되는 보라색 얼룩 직후 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 분석. 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 고 사진을 찍고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
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<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2+antagonists+emerge+from+alterations+in+the+low-affinity+binding+epitope+for+receptor+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II.</a> EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).</li>
<li>Hein, J. E., Fokin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28CuAAC%29+and+beyond%3A+new+reactivity+of+copper%28I%29+acetylides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides.</a> Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
<li>Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

유전자 codon 확장 태그 단백질 이체를 생성 주로 기본 단백질 시퀀스의 어떤 위치 든 지에서 다양 한 비 천연 아미노산 아날로그의 도입을 허용 한다. BMP2 같은 Bmp, 경우 공통 태그 6 히스티딘 (그의) 태그 수와 같은 N-말기, 이후 protein´s C 터미널 끝 차 단백질 구조 내에서 매장 된다 고 따라서 액세스할 수 없는 외부에서 도입. 다른 위치에서 소개 태그의 크기는 결과적으로 BMP´s bioactivity를 없애다 구조 변경 가능성이 매우 발생할 수 있습니다. 또한, 돌연변이 소개 BMP2 시퀀스로 refolding 효능에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 또한 수정 된 단백질의 전자 포인트 같은 다른 단백질 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 따라서, 설립된 단백질 생산 프로토콜에서 모든 단일 단계 변경된 단백질 variant´s 특성에 따라 적응 해야 합니다. BMP2-K3Plk의 생산은 실제로 야생 타입 BMP2의 표현에 대 한 설립된 방법의 수정이 필요합니다. 다른 문화 시간 또는 propargyl-...

뼈 조직 공학 및 뼈 재생의 궁극적인 목표는 단점 및 비-연합 골절의 일반적인 치료 중 발생 하는 한계를 극복 하는. 비록 그들은 둘 다 몇 가지 단점이 자동 또는 알 로스 간이식 주로 현재 치료 전략으로 사용 됩니다. 이상적인 골 이식 한다 osteoinduction 뼈에는 이식의 osteointegration에 지도 하는 osteoconduction에 의해 골을 유도 하 고 있다. 요즘만 자동 이식 이후 이상적인 뼈 이식의 모든 특성을 제공 하는 그것은 "금 표준"으로 간주 됩니다. 불행히도, 그것은 또한 긴 수술 시간, 그리고 일반적으로 더 많은 합병증 (예를 들어, 만성 통증, 혈 종 형성, 감염, 화장품 결함, 등)을 수반 하는 두 번째 외상 사이트 같은 중요 한 부정적인 측면을 선물 한다. Allogenic 이식, 다른 한편으로 모든 일반적인 측면1차선 특성 있다. 대체 뼈 이식 기술은 지난 몇 년 동안, osteoinductive, osteoconductive, 생체, 그리고 bioresorbable는 건설 기계를 생산 하는 목적으로 개선 되었습니다. 때문에 많은 바이오 이러한 osteogenic 특성 모두 표시 되지 않습니다, 다른 성장 인자, 주로 BMP2, BMP7, 특정 비 계2의 osteogenic 잠재력을 향상 시키기 위해 통합 되었습니다.
필수 조건으로 같은 성장 인자 전달 시스템 셀 모집 및 첨부 파일, 셀 ingrowth와 신생 같은 필수 이벤트를 촉진 하기 위해 시간이 지남에 제어 복용량 릴리스를 제공 해야 합니다. 그러나, BMPs 뿐만 아니라 다른 osteogenic 성장 요인 되었습니다 일반적으로 움직일 수 비 covalently3. 함정 및 흡착 기술 위에 생리 양의 심각한 단점 vivo에서, 일반적으로 자라 난 뼈를 유도 하 여 주변 조직에 영향을 미치는에 이르게 한 초기 버스트 출시로 인해 단백질의 사용을 필요로 osteolysis와 염증, 붓기,4. 따라서, 오랜 시간에 대 한 배달 사이트에 성장 요인의 보존 화학식 동원 정지 방법으로 얻을 수 있습니다. 화학적 BMP2 수정 (succinylated5, acetylated6 또는 biotinylated7), heterodimers8, 설계 또는 BMP2 파생된 펩타이드9 설계 하 고 한계를 극복 하는 데 사용 된 관련 흡수입니다. 그러나, 배치는 잠재적으로 세포질 수용 체에 고정된 ligand의 바인딩 억제 때문에 이러한 구문 중 바이오 활동 예측 되지 않습니다. 와 같이 이전에, 모든 4 개의 수용 체 체인 수용 체 ligand-활성화 단지의 형성에 관련 된 모든 다운스트림 신호 폭포10를 완전히 활성화 하려면 고정된 BMP2 상호 작용 필수적 이다.
Bioactivity, 안정성, 및 고정된 요인의 bioavailability 한계와 휘도가 제품 결과의 문제를 극복 하기 위해 우리는 BMP 이체를 covalently 사이트 이동 방식으로 건설 기계를 바인딩 할 수 설계 되었습니다. BMP2-K3Plk, 불리는이 변형 유전자 codon 확장11에 의해 도입 된 인공 아미노산으로 구성 됩니다. 이 이체의 생물 활성을 유지 하면서 공유 결합 전략을 사용 하 여 건설 기계에 성공적으로 연결 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step NBT/BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>세포에 용액 추가</td></tr><tr><td>3-Azido-7-hydroxycoumarin</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>클릭 반응에 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>Agarose 저융점</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>ALP 분석을 위한 Agarose&nbsp;</td></tr><tr><td>Azide 아가로스 비즈</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td>반응에 사용되는 비즈</td></tr><tr><td>BamHI (Fast Digest enzyme)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>BMP 수용체 IA (BMPR-IAEC)</td><td>--</td><td></td><td>-우리 실험실에서 생산</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>Coomassie에 사용되는 화학물질 SDS PAGE</td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염 무수 (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td>의 화려한 파란색 염색 <td>클릭 반응에 사용되는</td></tr><tr><td>화학물질 DNA 중합효소 및 반응 완충액&nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA HiFi PCR 키트</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 배지 (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>클릭 반응을 멈추는 데 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>이소프로필 &szlig;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>박테리아 유도 (1mM 최종 농도)&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>NHS-활성화 텍사스 레드</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>T6134</td><td>수용체</td></tr><tr><td>P-니트로페닐 포스페이</td>트에 결합 <td>시그마 알드리치 GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>알칼리 인산가수분해효소</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&nbsp;</td><td>--</td><td></td>-<td>플라스미드는 Walter Sebald가 J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA</td>에게 친절하게 제공함<td>--</td><td>-</td><td>-뷔르츠부르크 대학교 약학 및 생물약학 의</td></tr>장이 제공함<tr><td></td><td>--</td>-뷔<td></td><td>르츠부르크 대학교</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td></td>--<td>--</td><td>Wuerzburg 대학의 제약 및 생물약학 의장이 제공하는</td></tr><tr><td>Qiagen 젤 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>젤 정제</td></tr><tr><td>Qiagen PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 정제&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 L-아스코르브산염</td><td>시그마 알드리치 GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>클릭 반응에 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>Ligation&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>클릭 반응에 사용되는 화학물질</td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-폴리에틸렌 글리콜</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon 집중 셀 400 ml&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>UFSC40001</td><td>농축 장치</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 장치</td><td>Merck KGaA</td><td>UFC901024</td><td>농축 원심 장치</td></tr> <tr><td>및 Auml; KTA 아방가르드 FPLC</td><td>&Auml; KTA</td><td>--</td><td>FPLC 기계</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td></td><td>393124 세균 배양을 위한 분리기</td></tr><tr><td>세균 진탕 배양 인큐베이</td><td>터 Infors 세</td><td>균 배양을 위한 HT</td><td></td> 진탕 인큐베이터</tr><tr><td>FluorChem Q 시스템</td><td>proteinsimple</td><td>--</td><td>SDS-PAGE 형광 현미경 이미징 및 분석 시스템</td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel&reg; EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td><td>이온 교환 크로마토그래피 컬럼 재료</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; &nbsp; 96웰 플레이트</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>세포 배양용 96웰 플레이트(ALP 분석)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>--</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>M-20 마이크로플레이트 스윙 버킷 로터</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td><td>ALP 염색 플레이트용 마이크로 원심분리기용 로터</td></tr><tr><td>Microcentrifuge - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>--</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td>--</td><td>ALP 분석 데이터의 정적 분석을 위한 소프트웨어</td></tr><tr><td>폴리신 슬라이드</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 원심분리기</td></tr><tr><td>로터 JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter용 로터&nbsp;</td><td>--</td><td>Avanti J-26XP 원심분리기</td></tr><tr><td>로터 JA 25.50</td><td>Beckman Coulter</td>용 로터;<td>--</td><td>Avanti J-26XP 원심분리기</td></tr><tr><td>Tecan infinite M200 멀티플레이트 리더</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td><td>--</td><td>ALP 분석</td></tr><tr><td>Thermocycler - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td><td></td><td></td></tr>용 멀티플레이트 리더--PCR <tr><td>TxRed - 형</td>광 현미경용 <td>현미경 필터 Keyence</td><td></td><td>필터&nbsp;</td></tr><tr><td>한외여과 재생 셀룰로오스 디스크 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>amicon 농축 셀 400ml와 함께 사용</td></tr> 한<tr><td>외여과 재생 셀룰로오스 디스크 10 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>amicon 농축 셀 400ml와 함께 사용</td></tr></tbody></table>

뼈 morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

긴 뼈 결함 치료 비의 치료에 대 한 다른 치료 전략 집중적으로 조사 했습니다. 현재 치료 현재 뼈 morphogenetic 단백질 (BMPs) 같은 osteogenic 성장 인자와 함께에서 생체 재료의 사용에 지도 하는 몇 가지 제한이 사용 됩니다. 일반적으로 사용 되는 흡수 또는 캡슐화 방법 위에 생리 양의 BMP2, 소위 초기 버스트 출시 효과 몇 가지 심각한 부작용을 불러 일으키에 결과 일반적으로 필요 합니다. 이러한 문제를 극복 하는 전략 covalently 발판 단백질을 결합 하는 것입니다. 또한, 커플링 재현할 수 제품 결과 보장 하기 위해 특정 방식으로 수행 되어야 한다. 따라서, 우리는 인공 아미노산 (propargyl-L-리 신) codon 사용법 확장 (BMP2-K3Plk)에 의해 BMP2 단백질의 성숙한 부분에 도입 되었다 BMP2 변종을 만들었습니다. BMP2 K3Plk 기능성된 비즈 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition (CuAAC)을 통해 결합 했다. 결합 된 BMP2 K3Plk의 생물 학적 활동 생체 외에서 입증 되었다 고 BMP2-K3Plk-기능성된 구슬의 osteogenic 활동 세포 기반 분석 실험에서 입증 되었다. C2C12 셀 접촉 기능성된 비즈 구슬의 로컬 제한에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 식을 유도 할 수 있었다. 따라서,이 기술에 의해 공업화 건설 기계 생산 될 수 있는 osteogenic 혈통으로 세포 분화를 일으킬 수 있다. 또한, 더 낮은 BMP2 복용량 결합된 BMP2 사이트 감독의 제어 방향 때문에 충분 한 있습니다. 이 방법으로, Bmp는 항상 사실이 아닌 사이트 감독 비 커플링 기술을 통해 요소를 결합 하는 경우 적절 한 방향으로 세포 표면에 그들의 수용 체에 노출 됩니다. 제품 결과 매우 제어 하 고, 따라서, 중요 한 크기의 복구에 대 한 그들의 적응성 향상 균질 속성 자료에 결과 뼈 결함.

이 문서에서 우리는 covalently 상용 아 지 드 기능성된 agarose 구슬 (그림 1)을 새로운 BMP2 변종, BMP2-K3Plk 하는 방법을 설명 합니다. 생산된 BMP2 K3Plk variant의 bioactivity C2C12 세포에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 유전자 발현의 유도 의해 확인 되었다. 생체 외에서 시험 야생 타입 BMP2에 의해 유도 된 유사한 ALP 식 레벨 표시 (BMP2-WT) 및 BMP2-K3Plk (그림 2).
구리 (II) 황산 염 (CuSO4)과 나트륨 하는데 (NaAsc) 사이 redox 반응 구조적 무결성에 영향을 하 고 따라서 BMP2 K3Plk의 bioact...

생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

이 연구의 전반적인 목표는 클릭 화학에 의해 새로 설계된 BMP2 변이체의 부위 지향 및 공유 결합에 의한 골형성 골격의 강력하고 재현 가능한 생산입니다. 이 방법은 긴 뼈 결손의 치유되지 않는 치료를 위해 일반적으로 사용되는 기술과 관련된 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 흡수 또는 캡슐화 방법은 몇 가지 심각한 부작용을 유발하는 엄청난 양의 BMP2를 필요로 합니다.이 기술의 주요 장점은 측면 방향 방식으로 스캐폴드에 공유 결합되는 새로 설계된 BMP2 변형체의 더 적은 양을 사용하는 것입니다. 섭씨 37도에서 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램, 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 포함된 50밀리리터의 LB 배지로 하룻밤 사이에 단일 콜로니를 번식시킵니다. 하룻밤 배양액을 1-20 밀리리터로 희석하여 카나마이신 밀리리터당 50 마이크로그램과 암피실린 밀리리터 당 100 마이크로그램이 보충된 800 밀리리터의 훌륭한 육수 배지로 만듭니다.섭씨 37도에서 광학 밀도가 600나노미터에서 0.7에 도달할 때까지 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 프로포폴 L-Lycine을 최종 농도 10 millimolar에 첨가합니다. 1밀리몰의 최종 농도를 위해 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도합니다.섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 180RPM으로 16시간 동안 배양물을 배양합니다. 배양 후, 9, 000 회 g에서 30 분 동안 전체 배양을 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 30ml의 TBSE 완충액에 다시 현탁시킵니다.빈 원심분리기 비커의 무게를 측정하고 다시 부유한 펠릿을 빈 비커로 옮깁니다. 그런 다음 다시 현탁 된 펠릿을 6, 360 회 g에서 20 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 펠릿으로 비커의 무게를 잰다.빈 비커의 무게를 빼서 펠릿의 무게를 계산합니다. 그런 다음 펠릿을 STE 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 펠릿 10g당 200ml의 STE 버퍼를 사용하십시오.얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리한 후 6, 360회 g에서 20분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 초음파 처리 및 원심 분리 단계를 4 회 반복 한 후 펠릿을 100 밀리리터의 TBS 버퍼에 다시 현탁시킵니다.6, 360 회 g에서 20 분 동안 원심 분리기. 그런 다음 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 펠릿 그램당 10밀리리터를 사용하여 새로 첨가된 뉴클레아제로 펠릿을 뉴클레아제 완충액에 다시 현탁시킵니다.현탁액을 30RPM의 교반 플레이트에서 실온에서 밤새 배양합니다. 다음 날 서스펜션에 Triton Buffer를 추가합니다. 추가할 Triton Buffer의 부피는 현탁액의 0.5 부피 부분에 해당합니다.실온에서 10분 동안 배양한 후 현탁액을 6, 360회 g에서 20분 동안 원심분리한다. 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 다음으로, 펠릿 그램당 8밀리리터를 사용하여 TE 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.이전과 같이 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 이제 25 밀리몰 아시테이트 나트륨 그램 당 4 밀리리터, PH5 및 1 밀리 몰 DTT와 함께 6 몰 구아니디늄 클로라이드 그램 당 5 밀리리터를 추가하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 교반 플레이트에서 밤새 배양합니다.75, 500 회 g에서 20 분 동안 원심 분리 한 후 상등액에는 풀린 단량체 BMP2 단백질이 포함됩니다. 상층액을 수집하고 농축 세포에서 3 킬로달톤 분자량 차단 멤브레인을 사용하여 이 추출물을 20 밀리리터당 광학 밀도로 농축합니다. 교반하는 동안 농축된 단량체를 단일 방울로 Renaturation Buffer에 추가합니다.그런 다음 용액을 실온에서 어둠 속에서 120시간 동안 배양합니다. 1 밀리몰 염산에 대해 용액을 투석하기 전에 진한 염산을 사용하여 용액의 pH를 3.0으로 조정하십시오. 농축 세포에서 10 kilodalton 분자량 차단 멤브레인을 사용하여 투석된 용액을 농축합니다.다음으로, 단백질 용액을 평형화된 컬럼에 로드하고, 버퍼 B의 선형 그래디언트를 사용하여 분획을 희석하여 2밀리리터 분획을 수집합니다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 각 분획 20마이크로리터를 분석하여 단량체를 함유한 분획과 이량체를 함유한 분획을 측정합니다. 다음으로 분수를 포함하는 이량체를 당깁니다.하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 분획을 포함하는 이량체 풀을 1 밀리몰 염산 5 리터에 대해 투석하십시오. SDS-PAGE 및 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 최종 제품을 분석하기 전에 10킬로달톤 농축 원심 필터 장치를 사용하여 제품을 농축합니다. 총 500 마이크로 리터의 부피로 반응 버퍼에서 20 마이크로 리터의 아지드 활성 아가로 오스 비드와 음성 대조군으로 사용되는 BMP2-K3Plk 또는 BMP2-while 유형의 20 마이크로 몰을 결합합니다.20 RPM으로 회전하는 혼합물로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 5 millimolar EDTA의 최종 농도를 추가하여 반응을 중지합니다. 용액을 실온에서 20RPM으로 회전 믹서에서 15분 동안 배양합니다.다음 20, 실내 온도에 1 분 동안 000 시간 g에 표본을 분리기하고 상층액을 모으십시오. 그런 다음 비드가 들어있는 펠릿을 1, 000 마이크로 리터의 HBS 500 버퍼로 세척합니다. 20, 000 시간 g에 표본을 실내 온도에 1 분 동안 원심 분리기하고 상층액을 모으십시오.이 세척 절차를 HBS 500 Buffer로 두 번, 네 몰 염화마그네슘으로 세 번, PBS로 두 번 반복하여 매번 상층액을 수집합니다. 결합된 구슬을 섭씨 4도의 PBS 1, 000마이크로리터에 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ALP 분석을 수행합니다.ALP 염색을 수행하기 위해 DMEM에서 10% 송아지 혈청과 100밀리리터당 100단위의 페니실린 G 및 스트렙토마이신을 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 96웰 마이크로플레이트에서 웰당 30, 000개의 세포의 밀도로 C2C12 세포를 공급합니다. 세포를 밤새 부착시킨 후 배지를 제거하고 웰당 PMB2-K3PLK 결합 비드 20마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 각 웰에 20 마이크로 리터의 0.4 % 낮은 용융점 아가로 오스를 첨가하십시오. 2, 20 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g에 96 우물 마이크로 판을 원심분리기. 그런 다음 동일한 매체 80마이크로리터를 추가합니다.섭씨 37도의 가습 분위기에서 5% 이산화탄소로 72시간 동안 배양합니다. 배양 후, 응고된 0.4%아가로스가 분리되지 않도록 주의하면서 배지를 제거합니다. 1단계 MBT-BCIP 서브스트레이트 용액의 웰당 100마이크로리터를 추가합니다.보라색 염색이 뚜렷해진 직후 광학 현미경을 사용하여 알칼리성 인산화산염 염색을 분석합니다. 명시야 현미경을 사용하여 사진을 찍습니다. 새로 생산된 BMP2-K3Plk 변이체의 생체 활성은 C2C12 세포에서 알칼리성 인산가수분해효소 유전자 발현 유도에 의해 검증되었습니다.시험관 내 검사는 BMP2 유형 또는 BMP2-K3Plk 유형에 의해 유도된 유사한 알칼리 인산가수분해효소 유전자 발현 수준을 보여줍니다. BMP2-K3Plk via cover 촉매 아지드 알킨 시클로 첨가로 코팅된 비드는 dilabeled BMP receptor 1A eco-domain과 함께 배양할 때 형광을 생성했습니다. BMP 수용체 1A와 BMP2-K3Plk의 결합은 결합 후 생체 활성의 유지를 확인합니다.BMP2-K3Plk 기능성 비드의 생리 활성은 ALP 매개 염색에 의해 입증되었습니다. 염색은 BMP2-K3Plk 기능화 비드와 직접 접촉하는 세포에서만 발생했으며, 이는 단백질이 단순히 흡수되는 것이 아니라 비드에 실제로 공유 결합되어 있음을 확인했습니다. 단백질이 흡수된 상황에서 방출된다면, 용해성 BMP2-K2Plk로 처리할 때 알칼리성 인산가수분해효소 염색에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 더 먼 거리에서 더 퍼진 염색이 관찰되었을 것입니다.이 비디오를 시청한 후에는 유전자 확장에 의해 생물학적으로 활성화된 단백질을 발현하고 생산하는 방법과 클릭 화학 반응을 통해 가상의 단백질을 미세구에 공유 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유전적으로 확장되어 단백질 변이를 생성하면 원칙적으로 1차 단백질 염기서열의 모든 위치에 인공 아미노산을 도입할 수 있습니다. BMP2 염기서열에 돌연변이를 도입하면 재접힘 효율에 영향을 미칠 수 있으며 단백질 매개변수도 변경할 수 있습니다.BMP2-K3Plk 생산은 while 유형 BMP2의 발현을 위해 확립된 방법의 수정이 필요했습니다. 생산된 BMP2-K3Plk는 while형 단백질과 유사한 생물학적 활성을 보였다. 클릭 화학에 의해 BMP2 변이체를 azire 허구화된 아가로스 비드에 공유 결합하는 우리의 접근 방식은 높은 효율로 실현될 수 있으며, 그 결과 허구화된 비드를 생성하여 in vitro에서 유전적 분화를 파악할 수 있습니다.우수한 실험실 관리 기준에 따른 표준 보호가 보장되어야 합니다.

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배우세요 뼈 재생을 위한 BMP2 변이체의 화학 클릭 결합법. 이 방법은 저용량 BMP2로 골형성을 촉진하여 기존 기술의 부작용을 줄이고 비유합성 골결손 치료 효과를 향상시킵니다.

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