뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

이 연구의 전반적인 목표는 클릭 화학에 의해 새로 설계된 BMP2 변이체의 부위 지향 및 공유 결합에 의한 골형성 골격의 강력하고 재현 가능한 생산입니다. 이 방법은 긴 뼈 결손의 치유되지 않는 치료를 위해 일반적으로 사용되는 기술과 관련된 문제를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 흡수 또는 캡슐화 방법은 몇 가지 심각한 부작용을 유발하는 엄청난 양의 BMP2를 필요로 합니다.

이 기술의 주요 장점은 측면 방향 방식으로 스캐폴드에 공유 결합되는 새로 설계된 BMP2 변형체의 더 적은 양을 사용하는 것입니다. 섭씨 37도에서 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램, 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램이 포함된 50밀리리터의 LB 배지로 하룻밤 사이에 단일 콜로니를 번식시킵니다. 하룻밤 배양액을 1-20 밀리리터로 희석하여 카나마이신 밀리리터당 50 마이크로그램과 암피실린 밀리리터 당 100 마이크로그램이 보충된 800 밀리리터의 훌륭한 육수 배지로 만듭니다.

섭씨 37도에서 광학 밀도가 600나노미터에서 0.7에 도달할 때까지 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 프로포폴 L-Lycine을 최종 농도 10 millimolar에 첨가합니다. 1밀리몰의 최종 농도를 위해 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도합니다.

섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 180RPM으로 16시간 동안 배양물을 배양합니다. 배양 후, 9, 000 회 g에서 30 분 동안 전체 배양을 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 박테리아 펠릿을 30ml의 TBSE 완충액에 다시 현탁시킵니다.

빈 원심분리기 비커의 무게를 측정하고 다시 부유한 펠릿을 빈 비커로 옮깁니다. 그런 다음 다시 현탁 된 펠릿을 6, 360 회 g에서 20 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 버리고 펠릿으로 비커의 무게를 잰다.

빈 비커의 무게를 빼서 펠릿의 무게를 계산합니다. 그런 다음 펠릿을 STE 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 펠릿 10g당 200ml의 STE 버퍼를 사용하십시오.

얼음 위에서 현탁액을 초음파 처리한 후 6, 360회 g에서 20분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 초음파 처리 및 원심 분리 단계를 4 회 반복 한 후 펠릿을 100 밀리리터의 TBS 버퍼에 다시 현탁시킵니다.

6, 360 회 g에서 20 분 동안 원심 분리기. 그런 다음 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 펠릿 그램당 10밀리리터를 사용하여 새로 첨가된 뉴클레아제로 펠릿을 뉴클레아제 완충액에 다시 현탁시킵니다.

현탁액을 30RPM의 교반 플레이트에서 실온에서 밤새 배양합니다. 다음 날 서스펜션에 Triton Buffer를 추가합니다. 추가할 Triton Buffer의 부피는 현탁액의 0.5 부피 부분에 해당합니다.

실온에서 10분 동안 배양한 후 현탁액을 6, 360회 g에서 20분 동안 원심분리한다. 상등액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 다음으로, 펠릿 그램당 8밀리리터를 사용하여 TE 버퍼에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

이전과 같이 원심분리 후 상층액을 버리고 펠릿의 무게를 잰다. 이제 25 밀리몰 아시테이트 나트륨 그램 당 4 밀리리터, PH5 및 1 밀리 몰 DTT와 함께 6 몰 구아니디늄 클로라이드 그램 당 5 밀리리터를 추가하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 현탁액을 섭씨 4도에서 교반 플레이트에서 밤새 배양합니다.

75, 500 회 g에서 20 분 동안 원심 분리 한 후 상등액에는 풀린 단량체 BMP2 단백질이 포함됩니다. 상층액을 수집하고 농축 세포에서 3 킬로달톤 분자량 차단 멤브레인을 사용하여 이 추출물을 20 밀리리터당 광학 밀도로 농축합니다. 교반하는 동안 농축된 단량체를 단일 방울로 Renaturation Buffer에 추가합니다.

그런 다음 용액을 실온에서 어둠 속에서 120시간 동안 배양합니다. 1 밀리몰 염산에 대해 용액을 투석하기 전에 진한 염산을 사용하여 용액의 pH를 3.0으로 조정하십시오. 농축 세포에서 10 kilodalton 분자량 차단 멤브레인을 사용하여 투석된 용액을 농축합니다.

다음으로, 단백질 용액을 평형화된 컬럼에 로드하고, 버퍼 B의 선형 그래디언트를 사용하여 분획을 희석하여 2밀리리터 분획을 수집합니다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 각 분획 20마이크로리터를 분석하여 단량체를 함유한 분획과 이량체를 함유한 분획을 측정합니다. 다음으로 분수를 포함하는 이량체를 당깁니다.

하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 분획을 포함하는 이량체 풀을 1 밀리몰 염산 5 리터에 대해 투석하십시오. SDS-PAGE 및 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 최종 제품을 분석하기 전에 10킬로달톤 농축 원심 필터 장치를 사용하여 제품을 농축합니다. 총 500 마이크로 리터의 부피로 반응 버퍼에서 20 마이크로 리터의 아지드 활성 아가로 오스 비드와 음성 대조군으로 사용되는 BMP2-K3Plk 또는 BMP2-while 유형의 20 마이크로 몰을 결합합니다.

20 RPM으로 회전하는 혼합물로 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 5 millimolar EDTA의 최종 농도를 추가하여 반응을 중지합니다. 용액을 실온에서 20RPM으로 회전 믹서에서 15분 동안 배양합니다.

다음 20, 실내 온도에 1 분 동안 000 시간 g에 표본을 분리기하고 상층액을 모으십시오. 그런 다음 비드가 들어있는 펠릿을 1, 000 마이크로 리터의 HBS 500 버퍼로 세척합니다. 20, 000 시간 g에 표본을 실내 온도에 1 분 동안 원심 분리기하고 상층액을 모으십시오.

이 세척 절차를 HBS 500 Buffer로 두 번, 네 몰 염화마그네슘으로 세 번, PBS로 두 번 반복하여 매번 상층액을 수집합니다. 결합된 구슬을 섭씨 4도의 PBS 1, 000마이크로리터에 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ALP 분석을 수행합니다.

ALP 염색을 수행하기 위해 DMEM에서 10% 송아지 혈청과 100밀리리터당 100단위의 페니실린 G 및 스트렙토마이신을 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 96웰 마이크로플레이트에서 웰당 30, 000개의 세포의 밀도로 C2C12 세포를 공급합니다. 세포를 밤새 부착시킨 후 배지를 제거하고 웰당 PMB2-K3PLK 결합 비드 20마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 각 웰에 20 마이크로 리터의 0.4 % 낮은 용융점 아가로 오스를 첨가하십시오. 2, 20 섭씨 온도에 5 분 동안 000 시간 g에 96 우물 마이크로 판을 원심분리기. 그런 다음 동일한 매체 80마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 37도의 가습 분위기에서 5% 이산화탄소로 72시간 동안 배양합니다. 배양 후, 응고된 0.4%아가로스가 분리되지 않도록 주의하면서 배지를 제거합니다. 1단계 MBT-BCIP 서브스트레이트 용액의 웰당 100마이크로리터를 추가합니다.

보라색 염색이 뚜렷해진 직후 광학 현미경을 사용하여 알칼리성 인산화산염 염색을 분석합니다. 명시야 현미경을 사용하여 사진을 찍습니다. 새로 생산된 BMP2-K3Plk 변이체의 생체 활성은 C2C12 세포에서 알칼리성 인산가수분해효소 유전자 발현 유도에 의해 검증되었습니다.

시험관 내 검사는 BMP2 유형 또는 BMP2-K3Plk 유형에 의해 유도된 유사한 알칼리 인산가수분해효소 유전자 발현 수준을 보여줍니다. BMP2-K3Plk via cover 촉매 아지드 알킨 시클로 첨가로 코팅된 비드는 dilabeled BMP receptor 1A eco-domain과 함께 배양할 때 형광을 생성했습니다. BMP 수용체 1A와 BMP2-K3Plk의 결합은 결합 후 생체 활성의 유지를 확인합니다.

BMP2-K3Plk 기능성 비드의 생리 활성은 ALP 매개 염색에 의해 입증되었습니다. 염색은 BMP2-K3Plk 기능화 비드와 직접 접촉하는 세포에서만 발생했으며, 이는 단백질이 단순히 흡수되는 것이 아니라 비드에 실제로 공유 결합되어 있음을 확인했습니다. 단백질이 흡수된 상황에서 방출된다면, 용해성 BMP2-K2Plk로 처리할 때 알칼리성 인산가수분해효소 염색에 대해 여기에서 볼 수 있듯이 더 먼 거리에서 더 퍼진 염색이 관찰되었을 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 유전자 확장에 의해 생물학적으로 활성화된 단백질을 발현하고 생산하는 방법과 클릭 화학 반응을 통해 가상의 단백질을 미세구에 공유 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 유전적으로 확장되어 단백질 변이를 생성하면 원칙적으로 1차 단백질 염기서열의 모든 위치에 인공 아미노산을 도입할 수 있습니다. BMP2 염기서열에 돌연변이를 도입하면 재접힘 효율에 영향을 미칠 수 있으며 단백질 매개변수도 변경할 수 있습니다.

BMP2-K3Plk 생산은 while 유형 BMP2의 발현을 위해 확립된 방법의 수정이 필요했습니다. 생산된 BMP2-K3Plk는 while형 단백질과 유사한 생물학적 활성을 보였다. 클릭 화학에 의해 BMP2 변이체를 azire 허구화된 아가로스 비드에 공유 결합하는 우리의 접근 방식은 높은 효율로 실현될 수 있으며, 그 결과 허구화된 비드를 생성하여 in vitro에서 유전적 분화를 파악할 수 있습니다.

우수한 실험실 관리 기준에 따른 표준 보호가 보장되어야 합니다.