생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

이 실험의 전반적인 목표는 SUMOylated가 가능하거나 SUMO E3 lygase인 관심 단백질을 검증하는 것입니다. 이 방법은 SUMO E3 리가제 식별과 같은 SUMOylation 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 SUMO iso 형태에 대한 SUMO E3 리가제 특이성을 조사하는 데 활용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Wan-Shan Young입니다. 태그 K-bZIP을 정제하려면 먼저 14ml 폴리프로필렌 튜브에서 10ml의 세포 용해물을 50마이크로리터의 항체 태그 마그네틱 비드와 함께 배양합니다. 그런 다음 서스펜션 믹서에서 3시간 동안 섭씨 4도에서 분당 50회전으로 튜브를 회전합니다.

단백질이 포획되면 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 800배 g으로 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 비드를 다시 현탁하기 위해 1ml의 상등액을 제외한 모든 것을 버리십시오. 그리고 용해된 비드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

포획된 단백질을 세척하려면 비드가 있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 비드가 튜브의 측벽에 부착될 때까지 약 3초 동안 기다린 다음 상층액을 제거합니다. 비드를 세척하려면 1.5ml 튜브에 1ml의 용해 완충액을 추가합니다.

그런 다음 튜브를 10번 뒤집습니다. 다음으로, 1.5ml 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 벽에 부착되면 상층액을 제거합니다. 비드를 다시 세척하려면 1.5ml 튜브에 1ml의 인산염 완충 식염수를 넣고 10번 뒤집습니다.

그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드로 옮기고 비드가 측벽에 부착되면 상층액을 제거합니다. 항체 태그가 지정된 마그네틱 비드에서 K-bZIP 태그가 지정된 단백질을 용리하려면 1.5ml 튜브에 인산염 완충 식염수에 희석된 옥타펩타이드 150마이크로그램당 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 서스펜션 믹서의 튜브를 실온에서 10분 동안 분당 50회전으로 회전시킵니다.

튜브를 마그네틱 스탠드로 옮깁니다. 그런 다음 상등액이 포함된 K-bZIP을 수집합니다. 다음으로, 정제된 K-bZIP 태그를 분석하기 위해 정제된 단백질을 1마이크로리터에 5마이크로리터로 SDS 페이지에 노출시킨 다음 쿠마시 블루 염색을 수행합니다.

0.5, 1 및 2 마이크로그램의 소 혈청 알부민을 K-bZIP 농도를 정량화하기 위해 겔에 표준물질로 로드합니다. 이미지 J.Next에서 이미지를 처리하는 동안 정제된 K-bZIP을 인산염 완충 식염수에 희석합니다. 마이크로리터당 100나노그램의 최종 농도를 달성합니다.

그리고 섭씨 영하 80도에서 작은 부분 표본으로 보관하십시오. in vitro SUMOylation 마스터 믹스 반응에서 정제된 태그가 지정된 K-bZIP 3마이크로리터당 100나노리터를 추가합니다. 그런 다음 마스터 믹스의 내용물을 부드럽게 섞고 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, 로딩 버퍼가 있는 20마이크로리터의 2X SDS 페이지를 추가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 다음으로, 10%SDS 페이지 젤에 20마이크로리터의 샘플을 로드합니다.

그리고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 약 120분 동안 80볼트에서 젤을 실행합니다. 전기 마비가 끝나면 겔 장치를 분리합니다. 그리고 5 분 동안 반 건조 전사 완충액에 젤을 옮깁니다.

그런 다음 PVDF 멤브레인을 메탄올로 채워진 다른 용기에 1분 동안 담급니다. 메탄올에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 반건조 전사 완충액에 담급니다. 그런 다음 5분 동안 멤브레인을 부드럽게 교반합니다.

반건식 전기영동 장치의 안전 커버를 제거합니다. 여과지를 미리 적십니다. 그리고 백금 양극 바닥에 젤 샌드위치를 준비합니다.

음극판을 안전 커버에 고정한 후 15분 동안 90볼트 정전류로 블롯을 실행합니다. 그런 다음 반건조 장치를 분리한 후 전원 공급 장치를 끄고 PVDF 멤브레인을 제거합니다. 이제 PVDF 멤브레인을 블로킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커에서 분당 30회전으로 차단합니다.

다음으로, PVDF 멤브레인을 항-p53 항체 및 차단 버퍼와 하이브리드화하여 서스펜션 믹서에서 분당 30회전으로 섭씨 4도에서 12-16시간 동안 수행합니다. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 꺼내 Tris-buffered saline tween 20으로 채워진 용기에 옮깁니다. 다음으로, PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20에 30분 동안 오비탈 쉐이커에서 분당 45회전으로 담급니다.

그런 다음 PVDF 멤브레인을 차단 버퍼에서 희석된 양 고추 냉이 과산화 효소와 결합 된 항 토끼 항체와 현탁액 믹서에서 실온에서 1 시간 동안 30 회전으로 하이브리드합니다. 다음으로, PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20으로 3회 세척합니다. 세척 후 PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20에 30분 동안 서스펜션 믹서에서 분당 45회전으로 담그십시오.

그런 다음 Tris-buffered saline tween 20을 phosphate-buffered saline으로 교체합니다. PVDF 멤브레인을 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 보존합니다. 다음으로, 향상된 화학발광 기질 시약 1과 2를 1:1 비율로 혼합합니다.

그런 다음 인산염 완충 식염수에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 펀치 포켓으로 잠시 닦아내어 과도한 수분을 흡수합니다. 즉시 400마이크로리터의 화학발광 시약을 멤브레인 표면에 추가하고 3-5분 동안 기다립니다. 여분의 화학발광 시약을 배출하기 위해 잠시 닦아내어 멤브레인이 완전히 건조되는 것을 방지합니다.

Luminescent의 이미징 시스템을 사용하여 얼룩을 노출시킵니다. 여기서 p53 표적을 SUMOylate하는 데 필요한 Ubc9 효소의 농도를 보여주기 위해 면역 블롯 분석을 수행했습니다. 이는 Ubc9 효소의 농도가 1/2 및 1/5 SUMO 1 및 SUMO 2 펩타이드를 사용하여 시험관 내 SUMOylation 분석에서 p53 효소를 충분히 SUMOylate 할 수 있음을 보여줍니다.

SUMOylated p53을 분석하기 위해 멤브레인에 항-p53 항체를 조사했습니다. SUMO 1, SUMO 2 및 SUMO 3 펩타이드를 사용하여 체외 SUMOylation 분석에서 p53 표적을 SUMOylate하기 위해 E1 농도의 절반과 Ubc9 효소의 1/10 농도가 필요하다는 것을 보여주기 위해 유사한 면역 블롯 분석을 수행했습니다. 여기서 멤브레인은 정제된 K-bZIP 단백질을 보여주기 위해 Coomassie로 염색되었습니다.

바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 정제된 K-bZIP을 발현하고, 이를 SDS 페이지에서 비교를 위한 표준으로 소 혈청 알부민을 분석했습니다. 추가 면역 블롯 분석도 수행되어 K-bZIP의 농도를 높이면 E1 양의 절반과 Ubc9 효소의 1/10이 존재할 때 p53의 SUMOylation을 촉매하는 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 in vitro SUMOylation 분석을 위한 모든 시약을 얼음에 보관하고 한 번의 거대한 희석이 아닌 시리즈 희석을 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 찾으면 SUMOylation을 시험관 내에서 확인하기 위해 SUMOlygase를 과도하게 표현하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 SUMOylation 분야의 연구자들이 더 많은 SUMOlygase를 탐색하고 특이성을 검증할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 in vitro 시뮬레이션 분석을 사용하여 SUMO e3 lygase를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.