Name: 생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 생체 외 SUMOylation 분석을 통해 SUMO E3 리가제 활동을 연구하는 방법을. 이 기법은 단백질 수정 및 신경과학 연구에서 새로운 리가제를 식별하는 데 활용됩니다.

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이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.

1입니다. 준비의 잠재 식 구문
<ol><li>
이중 식 잠재 벡터에 K bZIP19 의 cDNA 클로닝 하 여 스모 E3 리가 K bZIP을 정화 (재료의 표 참조)는 N 맨끝 피토 프 태그. 우리는 (벡터-태그-K-bZIP으로 프로토콜에 걸쳐 표시) octapeptide 태그를 사용 하 여 성공을 했다. 참고: K bZIP 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 복제에 대 한 DNA 템플렛은 cDNA 역방향 doxycycline 치료20다음 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 셀에서 격리 하는 RNA에서 복사할.<ol>
<li>전송 길이 K bZIP cDNA19 Cpo와 듀얼 식 벡터에 사이트 복제 나. Cpo 내가 소화 PCR 제품 및 3 h2137 ° C에서 이중 식 벡터의 1 µ g.</li>
		<li>고220.8 %agarose 젤 전기 이동 법 다음 소화 DNA를 추출 합니다. 삽입 (K-bZIP) 선 및 T4 DNA 리가 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 16 ° C에 의해 벡터 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>5 µ L 추가 50 µ L DNA 결 찰의 유능한 대장균 세포 1.5 mL 튜브에 "A" ( 재료의 표참조). 30 분 동안 얼음에 넣어. 그런 다음, 45 42 ° C 물 욕조에 1.5 mL 튜브를 품 어 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.</li>
		<li>튜브에 600 µ L S.O.C. 매체 (0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 20mm MgSO4, 4% (w/v) 포도 당)을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 그런 다음, x 600g에 3 분 동안 실내 온도에 튜브 원심.</li>
		<li>상쾌한 제거, 60 µ L Luria Bertani 매체와 펠 릿 resuspend (파운드, 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 및 85 mM NaCl) 및 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함에 확산. 16 h23,2437 ° C에서 한 천 배지를 품 어.</li>
		<li>1 식민지 250rpm 떨고와 100 µ g/mL 암 피 실린 및 16 h 37 ° C에서 문화를 포함 하는 5 mL 파운드 매체에 접종을 선택 합니다. 다음, 플라스 미드, 벡터-태그-K-bZIP, 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 추출 키트에 의해 추출 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태그-K-bZIP 유능한 대장균 으로 벡터 태그 K bZIP의 변형에 의해 은닉 하는 재조합 bacmid 생성 세포 "B" (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>0.2 µ g 벡터-태그-K-bZIP 플라스 미드와 100 µ L 유능한 중 1.5 mL 튜브와 30 분 대에 넣어 얼음에 대장균 세포 "B" 품 어 45 42 ° C 물 목욕에서 튜브 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.</li>
		<li>튜브에 S.O.C. 매체의 900 µ L을 추가 하 고 회전 50 rpm에서 37 ° C 4 h에서 품 어. 다음, 매체의 10 µ L, 추가 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 10 µ g/mL 항생물질, 100 µ g/mL galactosidase 기판, 및 40 µ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG에 확산 S.O.C 매체의 추가 50 µ L ), 및 48 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>5 mL 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin 및 10 µ g/mL 항생물질을 포함 한 백색 식민지 접종 16 h 떨고 250 rpm 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>재조합 bacmid 태그 K bZIP을 은닉 하는 DNA를 분리 하 고 계량, 1 µ g / µ L25의 농도에 다시 일시 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
태그-K-bZIP 재조합 bacmid 태그-K-bZIP 6 잘 플레이트 한 우물에서 Sf9 셀에 포함 된 DNA의 transfecting 1 µ g에 의해 표현 하는 재조합 baculoviruses을 생성 합니다.
	<ol>
<li>시드 2 x 106 Sf9 셀 ( 재료의 표참조) 2 mL 그레이스의 곤충 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 각각 1 %gentamicin 제공 6 잘 플레이트의 잘 다음 1 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C와 함께 제공 된 그레이스의 곤충 매체에서 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 ( 재료의 표참조) 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서. Hemocytometer 고 trypan 푸른 얼룩;를 사용 하 여 셀의 개수 세포 생존 능력 95%를 초과 한다. 매 2-3 일 (최소 밀도 ~0.5 x 106 셀/mL) 1: 3의 subcultivation 비율을 사용 하 여 셀을 유지 합니다.</li>
		<li>2 µ L bacmid DNA를 추가 (1 µ g / µ L) 98 µ L 2 mL 튜브에 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)을 감소. 그런 다음 추가 4 µ L transfection 시 약 ( 재료의 표참조) 튜브를 잘 믹스. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>각 음에이 transfection 혼합물 (104 µ L)를 추가 하 고 12-16 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>부드러운 포부와 함께 지쳐 미디어를 제거 하 고 신선한 그레이스의 곤충 매체 10 %FBS 1 %gentamicin와 함께 제공 된의 2 개 mL를 바꿉니다. Sf9 세포는 플레이트 표면에 느슨하게 고착 하 고 부드러운 포부와 방해 하지 않을 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 후 재조합 잠재를 수집 하 고 증폭 하는 추가 실험을 위해 높은 titer 주식 (P1)를 얻을 잠재.
	<ol>
<li>매체, 멸 균 셀 기중 기를 사용 하 여 긁어는 Sf9 셀을 변경한 후 72 h 1.5 mL 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 각 개별 우물에서는 상쾌한 수집 s.</li>
		<li>150 x g. 3 분 4 ° C에서 원심 P0 잠재 및 1.5 mL 튜브 (각 관에 1 mL 잠재) 약 수 수집 상쾌한. -80 ° c.에 게</li>
		<li>10 mL 그레이스의 곤충 매체에 씨앗 1 x 107 Sf9 세포 10 %FBS 1% gentamicin 10 cm 배양 접시에에서 함께 제공 하 고 1 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>재조합 baculoviruses 표현 태그-K-bZIP의 증폭에 대 한 시드 Sf9 셀을 0.5 mL P0 잠재를 추가 하 고 48 h 27 ° C에서 품 어.</li>
		<li>최대 1 개월에 대 한 15 mL 튜브에 4 ° C에서 저장소 P1 잠재로 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. K-bZIP의 정화
<ol><li>1.3.2 단계에서 설명한 대로 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서 제공 하는 그레이스의 곤충 매체에 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 합니다.</li>
	<li>변환의 날, 2 x 106 셀/mL의 조밀도 가진 Sf9 셀의 250 mL에 잠재 된 상쾌한 (P1)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>떨고, 140 rpm 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 72 h에 대 한 Sf9 셀을 품 어 다음 4 ° c.에 15 분 동안 2,740 x g에서 원심 분리 하 여 수집</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 mL 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% 세제 ( 재료의 표참조), 2% 글리세롤, 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 펠 릿 세포를 lyse 및 4 ° C에서 30 분 동안 정지 믹서를 사용 하 여 50 rpm에 회전.</li>
	<li>원심 분리기 세포 lysate 15000 x g 15 분은 상쾌한 수집에서.</li>
	<li>태그-K-bZIP 정화, 항 체 태그 14 mL 폴 리 프로필 렌 튜브, 자석 구슬의 50 µ L로 세포 lysates (10 mL)를 품 어 하 고 정지 믹서를 사용 하 여 4 ℃에서 3 h 50 rpm에 회전 합니다. 30 g 원심 x 800에 구슬 작은 단백질 캡처, 다음 4 ° c.에 s 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 다시 약 1 mL의 잔여 볼륨에 비즈를 일시에 1.5 mL 튜브에 전송.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 구슬 들어 있는 튜브를 배치 하 여 캡처된 단백질을 세척 하 고 일단 자석 구슬은 튜브의 측면을 완벽 하 게 준수는 상쾌한을 제거.</li>
	<li>
세포의 용 해 버퍼와 구슬 4 번 씻어.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 1 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 1.5 mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 2.7에서 설명 된 대로 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>또 다른 3 시간 이전 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 구슬 한 번 씻는 다.
	<ol>
<li>1.5 mL 튜브에 1 mL PBS (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 8 m m Na2HPO4, 1.5 m m KH2PO4)를 추가 하 고 반전 튜브 10 번.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 1.5 mL 튜브를 넣어 하 고는 상쾌한 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 PBS에 희석 150 µ g/mL octapeptide의 100 µ L을 추가 하 여 항 체 태그 자석 구슬에서 태그-K-bZIP 단백질을 elute. 실 온에서 정지 믹서에 의해 50 rpm에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 다음, 튜브 자석 스탠드에 다시 놓고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 K bZIP 포함 된 상쾌한 수집 합니다.</li>
	<li>SDS 페이지 Coomassie 파란 얼룩이26뒤 1-5 µ L 정화 태그-K-bZIP 단백질 분석. 2 µ g, 1 µ g, 로드 및 소 혈 청 알 부 민 (BSA)는 동일에 0.5 µ g 샘플 젤 ImageJ 같은 이미지 처리 프로그램, 정량화에 대 한 그것을 사용 하 여. BSA 기준에 비교 하 여 K-bZIP 농도 견적 한다.</li>
	<li>순화 K bZIP 이제 각 SUMOylation 분석 결과에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. PBS에서 K bZIP 100 ng / µ L-80 ° c.에 작은 aliquots가 게의 최종 농도에 희석</li>
</ol>3. SUMOylation 분석 결과
<ol><li>각 시험관에서 SUMOylation 반응에서의 마스터 믹스에 정화 태그-K-bZIP의 100 ng / µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 마스터 믹스 구성 요소 포함 1 µ L 단백질 버퍼, SUMOylation 버퍼, 0.5 µ L p53 단백질 (0.5 mg/mL), 25 x 1 nM E1 효소를 활성화 (재고 하자마자: 1 µ M), 50 nM e 2의 효소 변화 (재고 하자마자: 10 µ M), 및 250 nM 각 스모 펩 티 드 (스모-1의 스모-2, 또는 스모-3; 재고 하자마자: 5 µ M) 17 µ L의 최종 볼륨을.</li>
	<li>내용을 부드럽게 혼합 하 고 3 h. SDS 페이지 로딩 버퍼 x 2의 20 µ L을 추가 하 여 반응을 중지에 30 ° C에서 반응을 품 어 (100 mM Tris HCL pH 6.8, 4% 나트륨 라우릴 황산 염, 0.2% (w/v) bromophenol 블루, 20% (v/v) 글리세롤, 및 200 m m β-mercaptoethanol) 및 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성</li>
	<li>
SDS 페이지에 샘플, PVDF 막에 분리 된 단백질 전기 이동 전송 반 건조 장치를 사용 하 여 전송 하 고 안티-p53 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석 합니다.
	<ol>
<li>2.11, 단계에서 젤 장치를 설정 하 고 젤 우물에 20 µ L의 샘플을 로드.</li>
		<li>(때까지 염료 밴드 젤의 하단에 도달) 정 전류 80 V에서 약 120 분 동안에 10% 젤을 실행 합니다. 전기 이동 법의 완성 후 전원 공급 장치를 해제 합니다.</li>
		<li>젤 기구와 젤, 밖으로 데리고 젤 카세트를 분리 하 고 5 분 동안 세미 드라이 전송 버퍼 (48 mM Tris HCl, 39mm 글리신, 20% 메탄올)에 젤을 떠.</li>
		<li>다른 컨테이너를가지고 고 1 분 동안 메탄올에 PVDF 막 담가. 그런 다음, 메탄올에 PVDF를 데리고 고 세미 드라이 전송 버퍼에 넣어. 부드럽게 막 5 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>세미 드라이 전기 이동 기구의 안전 덮개를 제거 합니다.</li>
		<li>사전 필터 종이, 젖은 하단 플래티넘 양극에 젤 샌드위치를 같이 준비: 필터 종이, PVDF 막, 젤, 및 필터.</li>
		<li>다음 실행 오 점 15 V 정 전류 90 분 설정에 대 한 전원 공급 장치에서 안전한 음극 판과 안전 커버, 세미 건조 장치, 고 PVDF 막 밖으로.</li>
		<li>블로킹 버퍼 블록 PVDF 막 (TBST 버퍼에 5% 비-지방 우유 (137 m m NaCl2, 20 mM Tris HCl, 0.1% 세제 B ( 재료의 표참조), pH 7.6)) 궤도 셰이 커로 흔들어 30 rpm으로 1 시간에 대 한 실내 온도에.</li>
		<li>30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 안티 p53 항 체 희석 (1:1, 000) 4 ° C에서 12-16 h에 대 한 블로킹 버퍼와 PVDF 막 교배.</li>
		<li>컨테이너에 PVDF 막 꺼내와 TBST에 넣어. 두 번 더 TBST 가진 PVDF 막을 헹 구 십시오.</li>
		<li>45 rpm 궤도 셰이 커로 흔들어 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다.</li>
		<li>30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 반대로 토끼 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석과 활용 (1:4, 000)와 PVDF 막 교배.</li>
		<li>3.4.10 단계에서 설명한 대로 TBST 3 시간 PVDF 막을 씻으십시오.</li>
		<li>45 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다. TBST를 제거 하 고 PBS PVDF 막 12 h까지 4 ° C에서 유지 하기 위해 추가.</li>
		<li>믹스 향상 된 chemiluminescent 기판 (ECL 기판) 시 약 1, 2 (1:1) ( 재료의 표참조). PBS에서 PVDF 막 제거, 간단히 종이 타월 또는 과도 일 분을 흡수 즉시 짧게 blotting에 의해 3-5 분 제거 초과 ECL 시 약에 대 한 각 막의 표면에 ECL 시 약의 400 µ L을 추가 하는 빛-의무 퍼 오 점 하지만 m을 허용 하지 마십시오 embrane을 완전히 건조.</li>
		<li>오 점 발광 이미징 시스템 또는 autoradiography 영화27을 사용 하 여 노출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 그들의 활동만 방법을 사용할 수 있는이 시험관 을 사용 하 여 스모 E3 리가 촉매 활동을 결정 하는 검색할 수 있습니다. SUMOylation 시스템입니다. 이 가설에 따라 우리는 성공적으로 해명 K bZIP의 E3 리가 활동 하 고 소설 스모 E3 리가로 스모-2/3으로 특이성에 동일시.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 E1 및 e 2의 낮은 금액의 설립 이다. 같이 <strong...

스모 수정 처음 단백질 안정성1을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)2. Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인9,10 또는 음수10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.
포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)13포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성14에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별15. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용16, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.
생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정17공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc918 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>이중 발현 바큘로바이러스 벡터</td></tr><tr><td>pCR2.1-TOPO 벡터</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR 생성물 벡터</td></tr><tr><td>유능 세포&nbsp; E. coli DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>유능한 E. coli 세포 A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>유능한 E. coli 세포 B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>환원 혈청 매체</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEW England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>갈락토시다아제 기질</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s 곤충 매체</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>써모 피셔</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린,</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>, LB, 육수</td><td>Merk</td><td>, 1.10285.0500</td><td></td></tr>, <tr><td>HEPES,</td><td>시그마-알드리치,</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr>, <tr><td>NaCl</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>, KCl</td>, <td>Merk</td><td>, 1.04936.1000</td><td></td></tr>, <tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4<</td><td>/sub>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>무지방 우유</td><td>폰테라</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>세제 A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>세제 B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>세제 C</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x 플래그 펩타이드</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG m2 마그네틱 비드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>항체 태그 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 키트</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>표준 SUMOylation 프로토콜&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 키트</td><td>액티브 모티프</td><td>40220</td><td>표준 SUMOylation 프로토콜&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick 젤 추출 키트,</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAGEN 플라스미드 미니 키트</td>, <td>QIAGEN</td><td>12123</td><td>플라스미드 추출 키트</td></tr><tr><td>, 폴리프로필렌 튜브</td><td>, Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>, Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter,</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>로딩 팁</td><td>, Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 여과지</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry 전기영동 전사 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL 시약</td></tr><tr><td>서스펜션 믹서</td><td>Digisystem laboratory instruments&nbsp; Inc.</td><td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>캔신 인스트루먼트</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 생체 분자 이미저</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr><td>항-p53 항체</td><td>세포 신호전달</td><td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>항-토끼 항체</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 스모 e3 리가 활동 공부 sumoylation 분석 결과

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.

제조업체에서 제공 하는 정보에 따라 E1 및 E2 효소 SUMOylation 분석 결과에서 표준 금액은 50 nM 및 500 nM, 각각. 최소한의 E2 효소 Ubc9 SUMOylate p53 수 있는 어근 먼저 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 의해 결정 되었다. 낮은 Ubc9는 표준 체 외에서 SUMOylation 분석 결과 프로토콜에 사용 금액의 1 / 5 SUMOylate p53 효율적으로 수 있었다 (그림 1A). 따라서, 표준 프로토콜에 사용 되는 Ubc9의 양의 1/10로 조합에서 E1 효소의 금액의 절반 SUMOylation 분석 결과 체 외에 다른 사용 되었다. SUMOylation 효율의 상당한 감소는 표준 프로토콜 (그림 1B)...

유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

이 실험의 전반적인 목표는 SUMOylated가 가능하거나 SUMO E3 lygase인 관심 단백질을 검증하는 것입니다. 이 방법은 SUMO E3 리가제 식별과 같은 SUMOylation 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 SUMO iso 형태에 대한 SUMO E3 리가제 특이성을 조사하는 데 활용할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Wan-Shan Young입니다. 태그 K-bZIP을 정제하려면 먼저 14ml 폴리프로필렌 튜브에서 10ml의 세포 용해물을 50마이크로리터의 항체 태그 마그네틱 비드와 함께 배양합니다. 그런 다음 서스펜션 믹서에서 3시간 동안 섭씨 4도에서 분당 50회전으로 튜브를 회전합니다.단백질이 포획되면 샘플을 섭씨 4도에서 30초 동안 800배 g으로 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 비드를 다시 현탁하기 위해 1ml의 상등액을 제외한 모든 것을 버리십시오. 그리고 용해된 비드를 1.5ml 튜브로 옮깁니다.포획된 단백질을 세척하려면 비드가 있는 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 비드가 튜브의 측벽에 부착될 때까지 약 3초 동안 기다린 다음 상층액을 제거합니다. 비드를 세척하려면 1.5ml 튜브에 1ml의 용해 완충액을 추가합니다.그런 다음 튜브를 10번 뒤집습니다. 다음으로, 1.5ml 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 벽에 부착되면 상층액을 제거합니다. 비드를 다시 세척하려면 1.5ml 튜브에 1ml의 인산염 완충 식염수를 넣고 10번 뒤집습니다.그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드로 옮기고 비드가 측벽에 부착되면 상층액을 제거합니다. 항체 태그가 지정된 마그네틱 비드에서 K-bZIP 태그가 지정된 단백질을 용리하려면 1.5ml 튜브에 인산염 완충 식염수에 희석된 옥타펩타이드 150마이크로그램당 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 서스펜션 믹서의 튜브를 실온에서 10분 동안 분당 50회전으로 회전시킵니다.튜브를 마그네틱 스탠드로 옮깁니다. 그런 다음 상등액이 포함된 K-bZIP을 수집합니다. 다음으로, 정제된 K-bZIP 태그를 분석하기 위해 정제된 단백질을 1마이크로리터에 5마이크로리터로 SDS 페이지에 노출시킨 다음 쿠마시 블루 염색을 수행합니다.0.5, 1 및 2 마이크로그램의 소 혈청 알부민을 K-bZIP 농도를 정량화하기 위해 겔에 표준물질로 로드합니다. 이미지 J.Next에서 이미지를 처리하는 동안 정제된 K-bZIP을 인산염 완충 식염수에 희석합니다. 마이크로리터당 100나노그램의 최종 농도를 달성합니다.그리고 섭씨 영하 80도에서 작은 부분 표본으로 보관하십시오. in vitro SUMOylation 마스터 믹스 반응에서 정제된 태그가 지정된 K-bZIP 3마이크로리터당 100나노리터를 추가합니다. 그런 다음 마스터 믹스의 내용물을 부드럽게 섞고 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양합니다.다음으로, 로딩 버퍼가 있는 20마이크로리터의 2X SDS 페이지를 추가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 다음으로, 10%SDS 페이지 젤에 20마이크로리터의 샘플을 로드합니다.그리고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 약 120분 동안 80볼트에서 젤을 실행합니다. 전기 마비가 끝나면 겔 장치를 분리합니다. 그리고 5 분 동안 반 건조 전사 완충액에 젤을 옮깁니다.그런 다음 PVDF 멤브레인을 메탄올로 채워진 다른 용기에 1분 동안 담급니다. 메탄올에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 반건조 전사 완충액에 담급니다. 그런 다음 5분 동안 멤브레인을 부드럽게 교반합니다.반건식 전기영동 장치의 안전 커버를 제거합니다. 여과지를 미리 적십니다. 그리고 백금 양극 바닥에 젤 샌드위치를 준비합니다.음극판을 안전 커버에 고정한 후 15분 동안 90볼트 정전류로 블롯을 실행합니다. 그런 다음 반건조 장치를 분리한 후 전원 공급 장치를 끄고 PVDF 멤브레인을 제거합니다. 이제 PVDF 멤브레인을 블로킹 버퍼로 실온에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커에서 분당 30회전으로 차단합니다.다음으로, PVDF 멤브레인을 항-p53 항체 및 차단 버퍼와 하이브리드화하여 서스펜션 믹서에서 분당 30회전으로 섭씨 4도에서 12-16시간 동안 수행합니다. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 꺼내 Tris-buffered saline tween 20으로 채워진 용기에 옮깁니다. 다음으로, PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20에 30분 동안 오비탈 쉐이커에서 분당 45회전으로 담급니다.그런 다음 PVDF 멤브레인을 차단 버퍼에서 희석된 양 고추 냉이 과산화 효소와 결합 된 항 토끼 항체와 현탁액 믹서에서 실온에서 1 시간 동안 30 회전으로 하이브리드합니다. 다음으로, PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20으로 3회 세척합니다. 세척 후 PVDF 멤브레인을 Tris-buffered saline tween 20에 30분 동안 서스펜션 믹서에서 분당 45회전으로 담그십시오.그런 다음 Tris-buffered saline tween 20을 phosphate-buffered saline으로 교체합니다. PVDF 멤브레인을 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 보존합니다. 다음으로, 향상된 화학발광 기질 시약 1과 2를 1:1 비율로 혼합합니다.그런 다음 인산염 완충 식염수에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 펀치 포켓으로 잠시 닦아내어 과도한 수분을 흡수합니다. 즉시 400마이크로리터의 화학발광 시약을 멤브레인 표면에 추가하고 3-5분 동안 기다립니다. 여분의 화학발광 시약을 배출하기 위해 잠시 닦아내어 멤브레인이 완전히 건조되는 것을 방지합니다.Luminescent의 이미징 시스템을 사용하여 얼룩을 노출시킵니다. 여기서 p53 표적을 SUMOylate하는 데 필요한 Ubc9 효소의 농도를 보여주기 위해 면역 블롯 분석을 수행했습니다. 이는 Ubc9 효소의 농도가 1/2 및 1/5 SUMO 1 및 SUMO 2 펩타이드를 사용하여 시험관 내 SUMOylation 분석에서 p53 효소를 충분히 SUMOylate 할 수 있음을 보여줍니다.SUMOylated p53을 분석하기 위해 멤브레인에 항-p53 항체를 조사했습니다. SUMO 1, SUMO 2 및 SUMO 3 펩타이드를 사용하여 체외 SUMOylation 분석에서 p53 표적을 SUMOylate하기 위해 E1 농도의 절반과 Ubc9 효소의 1/10 농도가 필요하다는 것을 보여주기 위해 유사한 면역 블롯 분석을 수행했습니다. 여기서 멤브레인은 정제된 K-bZIP 단백질을 보여주기 위해 Coomassie로 염색되었습니다.바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 정제된 K-bZIP을 발현하고, 이를 SDS 페이지에서 비교를 위한 표준으로 소 혈청 알부민을 분석했습니다. 추가 면역 블롯 분석도 수행되어 K-bZIP의 농도를 높이면 E1 양의 절반과 Ubc9 효소의 1/10이 존재할 때 p53의 SUMOylation을 촉매하는 것으로 나타났습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 in vitro SUMOylation 분석을 위한 모든 시약을 얼음에 보관하고 한 번의 거대한 희석이 아닌 시리즈 희석을 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 찾으면 SUMOylation을 시험관 내에서 확인하기 위해 SUMOlygase를 과도하게 표현하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 SUMOylation 분야의 연구자들이 더 많은 SUMOlygase를 탐색하고 특이성을 검증할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 in vitro 시뮬레이션 분석을 사용하여 SUMO e3 lygase를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

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연구

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Biology

생물학

이 동영상은 순차 효소 캐스케이드를 사용하여 기질 단백질의 SUMOylation을 위한 in vitro 방법을 보여줍니다. 또한, 단백질의 SUMOylated 상태는 전기영동 및 면역블로팅 기술을 사용하여 식별됩니다.

SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

스모는 필수적이 고 고도로 보존 된, 작은 유비퀴틴 같은 수정자 단백질입니다. 이 프로토콜에서 우리는 스트레스를 견딜 수 있는 재조합 스모-포착 단백질 (kmUTAG)의 사용을 설명 하 여 다양 한 세포 유형에 서 고유 하 고 태그가 지정 되지 않은 스모 결합체와 그 현지화를 시각화 합니다.

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

여기서, 우리는 스모 결합 엔티티(SUBEs)를 사용하여 인간 간종 세포및 간 종양으로부터 수득된 인간 간종 세포 및 간 종양모두에서 SUMO에 의해 변형된 단백질을 풍부하게 하고, 분리하고, 식별하고, 특성화하는 프로토콜을 제시한다.

간암에서 스모 프로테오메의 농축, 격리, 식별 및 특성화를 위한 도구로 스모 결합 엔티티(SUBEs)

이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.

시험관 내 링 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 기능적 특성화

본 연구는 E3 유비퀴틴 리구아제 촉매 활성의 분석을 위한 체외 유비쿼터스 분석 프로토콜에 대한 상세한 제공. 재조합 단백질은 대장균 배양과 같은 원핵계를 사용하여 발현되었다.

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

이 프로토콜은 포유류 세포 용해액 또는 순수 유비퀴틴 효소 복합체를 이용해 폐렴 구균을 유비퀴틴화하는 방법을 설명하며, 이후 정제된 VCP/p97-UFD1-NPLOC4 단백질 복합체로 처리하여 박테리오리네이션 활성을 평가하여 유비퀴틴 의존성 면역 효과 연구를 가능하게 합니다.

시험관 내 박테리아 유비퀴틴화 재구성 및 VCP/p97 매개 제거

배우세요 생체 외 SUMOylation 분석을 통해 SUMO E3 리가제 활동을 연구하는 방법을. 이 기법은 단백질 수정 및 신경과학 연구에서 새로운 리가제를 식별하는 데 활용됩니다.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

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