소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

이 실험의 전반적인 목표는 pH 지시자 접합 시냅토솜의 식세포작용에 대한 체외 라이브 이미징을 통해 성상세포 및 미세아교세포와 같은 신경교세포의 실시간 삼킴 및 분해 역학을 검출하는 것입니다. 이 방법은 건강하고 병든 뇌에서 신경교세포 식균작용이 어떻게 조절되는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 체외 배양 세포의 라이브 이미징을 통해 신경교세포의 실시간 식세포 역학을 효과적으로 모니터링하고 분석할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 또한 신경교세포의 삼킴 및 분해 능력을 조절하는 요인 및 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 해동된 시냅토솜 샘플을 섭씨 21도, 092G 및 섭씨 4도에서 3-4분 동안 원심분리합니다. 상등액을 흡입한 후, 튜브당 0.1몰 탄산나트륨 200마이크로리터에 펠릿을 다시 현탁시키고, 완전히 혼합된 후 각 샘플에 2마이크로리터의 pH 지시약을 추가합니다.

부드러운 와류 후 알루미늄 호일 덮개로 용액을 빛으로부터 보호하고 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하면서 샘플을 트위스트 셰이커에 넣습니다. 배양이 끝나면 Dulbecco의 PBS 또는 DPBS 1ml를 추가하고 원심분리로 시냅토솜을 수집하여 세척당 1ml의 신선한 DPBS로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 마지막 원심분리 후, 5% DMSO가 보충된 200마이크로리터의 DPBS에 비기능성 시냅토솜 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

시냅토솜 삼킴의 실시간 이미징을 위해서는 먼저 융합 성상세포 배양의 각 웰에서 상층액을 제거하고 세척당 1ml의 DPBS로 세포를 3회 빠르게 세척합니다. 마지막 세척 후 300마이크로리터의 면역판넬 성상세포 염기성 배지와 5마이크로리터의 pH 지시약 접합 시냅토솜, 그리고 신경교세포 식세포작용을 조절할 수 있는 추가 인자를 추가합니다. 시냅토솜이 우물의 바닥에 가라앉고 섭씨 37도 및 5%Co2에서 성상세포의 포스파티딜 세린 수용체에 부착되도록 합니다.

40분 후 상층액을 버리고 세척당 1ml의 DPBS로 웰을 빠르고 부드럽게 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 관심 요소가 보충된 500마이크로리터의 새 배지를 적절한 웰에 추가하고 플레이트를 라이브 이미징 기기로 옮깁니다. 이미징 위치를 선택하고, 초점, 노출 시간, 밝기 및 LED 전원을 조정하고, 라이브 이미징을 위한 이미지 형식, 시간 간격 및 총 주기 수를 실험적으로 적절하게 설정합니다.

그런 다음 식세포작용 실험의 실시간 이미징을 시작합니다. 적절한 실험 종점에서 imagine 분석 프로그램을 열고 타임랩스 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 이미지를 8비트 회색 음영으로 변환하고 롤링 막대 반경이 50픽셀인 배경 빼기를 시작합니다.

다음으로, Time Series Analyzer V3 플러그인을 열고 관심 영역을 플러그인으로 드래그합니다. 관심 지역 관리자에서 추가를 클릭합니다. Time Series V3 플러그인에서 Get Total Intensity를 클릭합니다.

그런 다음 결과를 저장하고 데이터를 통합합니다. 준비 후, 시냅토솜은 외막에 포스파티딜 세린을 발현하여 기능 상실을 암시하며, 이는 성상세포와 미세아교세포의 포스파티딜 세린 수용체에 의해 인식될 수 있습니다. pH 지시약이 결합된 시냅토솜은 식세포화되어 밝은 적색 형광을 방출합니다.

신경교세포 식세포작용(glial cell phagocytosis)을 정량화하기 위해 적색 형광 신호 영역 또는 식세포 지수(phagocytic index)를 측정할 수 있습니다. 성상세포는 많은 수의 pH 지시약이 결합된 시냅토솜을 식세포하는 데 효율적이지만, 미세아교세포는 시냅토솜을 삼키고 분해하는 데 더 빠릅니다. 흥미롭게도, 성상교세포 조절 배지에 함유된 성상세포 분비 인자는 성상교세포와 미세아교세포 매개 식세포작용을 모두 증가시키는 데 필수적입니다.

또한, 마우스 MEGF10 knockout 성상세포는 야생형 세포에 비해 현저히 손상된 식세포 능력을 보여주었습니다. 개발 후, 이 기술은 신경과학 및 신경교세포 생물학 분야의 연구자들이 다양한 신경 질환을 치료하기 위한 잠재적인 방법으로 신경교세포 식작용의 조절과 관련된 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.