March 3rd, 2018
여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 비침습적 도구를 사용하여 뒤쪽 발달 능력을 가진 후구를 식별하는 것입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 체외 성숙 과정에서 발생하는 난모세포 움직임을 관찰하는 것만으로도 여성의 배우자 발달 잠재력을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 신경망 기반 분석인 입자 이미지 속도계와 결합된 타임 랩스 이미징을 기반으로 합니다.
여기에서는 생식 방포에서 중기 2 단계로 전환하는 동안 마우스 난모세포가 발달 능력 또는 무능력과 유의한 상관관계가 있는 상기 플라즈마 운동의 다른 프로필을 표시한다는 것을 입증하기 위해 취한 단계를 설명합니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 불임은 부부의 약 20%에 영향을 미치는 병리학이며, 암 치료를 받는 여성의 1/3이 조기 난소 부전의 위험에 처해 있습니다. 이것은 각각 미국이나 이탈리아와 같은 국가에 있는 약 300, 000 또는 30, 000명의 여성에 해당합니다.
난모세포 발달 역량을 확인하기 위한 비침습적 절차의 설계는 임신 결과의 전반적인 성공을 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서는 소나 인간과 같은 다른 포유류 종에 대해 쉽게 테스트하고 사용할 수 있도록 마우스용으로 개발된 절차의 가장 중요한 단계에 대한 세부 정보를 제공합니다. 난소는 M2 매체, 예열 및 평형, 섭씨 37도 및 5% CO2를 포함하는 Petrie 접시로 옮겨집니다.
난관과 약간의 지방이 난소 주변에 여전히 존재하면 제거해야 합니다. 그런 다음 핀셋으로 난소를 잡고 멸균 된 1G 바늘을 사용하여 난소 표면에 구멍을 뚫습니다. 구멍이 뚫린 난소를 M2 배지에서 제거하고 손으로 당긴 마이크로피펫을 사용하여 깨끗한 새 M2 배지로 첫 번째 이동을 유도한 다음 난모세포를 둘러싼 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 몇 초 동안 피펫을 안팎으로 피펫으로 넣습니다.
다음으로, 난모세포는 M2 배지의 20마이크로리터 방울로 전달되고 일부 적운 세포가 지속되는 경우 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 한 방울에서 한 방울로 여러 통로를 통해 완전히 제거됩니다. Hoechst 33342를 밀당 0.05마이크로그램의 최종 농도로 제조하기 위해 1회 pbs에서 제조된 밀당 5밀리그램 농도의 Hoechst의 온화한 용액으로 시작하고 필요한 농도가 얻어질 때까지 더 희석합니다. 3.5 마이크로 리터의 Hoechst 용액을 Petrie 접시 뚜껑 바닥에 놓고 희석 된 각 난모 세포를 단일 Hoechst 방울로 옮긴 다음 접시를 어두운 뚜껑으로 덮어 Hoechst 염색 과정에서 빛 노출을 줄이도록주의합니다.
10분 동안 염색한 후 자외선을 이용한 형광 현미경으로 난모세포를 관찰합니다. 염색질 형태에 따라 핵소체 주위에 x 양성 염색질 고리가 있는 경우 Surrounded Nucleolus, SN으로 분류되거나 nucleolus에 x 양성 염색질 고리가 없고 전체 염색질이 nucleolus에 분산된 것처럼 보이는 경우 Non-Surrounded Nucleolus, NSN으로 분류됩니다. 알파 멤 배지의 2마이크로리터 방울 4개를 유리 바닥 페트리 접시에 놓고 방울이 특정 거리 내에 있도록 주의하면서 떨어뜨리고, 방울을 미리 예열 및 평형화된 미네랄 오일로 겹쳐 놓고, 총 3-4개의 난모세포를 각 방울에 전달합니다.
Petrie 접시는 타임랩스 현미경의 배양 챔버로 옮겨져 섭씨 37도 및 CO2 5%의 온도를 장기간 유지하고 적색 LED 조명으로 조명을 유지할 수 있습니다. 타임랩스 분석 전에 BioStation 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 루틴 동안 한 드롭에서 다음 드롭으로의 이동을 자동화하기 위해 각 드롭의 좌표가 설정됩니다. 타임랩스 프레임은 8분 간격으로 총 15시간 동안 촬영됩니다.
그런 다음 기록된 영상은 CellPave 소프트웨어를 사용하여 분석되며, 이를 통해 속도 벡터로 표현되는 세포질 움직임을 감지할 수 있습니다. 첫째, CellPave 도구를 사용하면 각 난모세포의 둘레를 수동으로 구분할 수 있습니다. 그런 다음 소프트웨어는 두 개의 연속된 타임랩스 프레임을 비교할 때 발생하는 세포질 운동의 속도를 계산하고 색상 강도와 길이에 따라 움직임의 속도와 방향을 정의하는 컬러 화살표를 배치하여 표현합니다.
여기에서 볼 수 있는 난모세포 아래의 히스토그램은 SN 난모세포의 15시간 기록 기간 동안 전체 세포질 운동의 속도를 설명합니다. NSN 난모세포에 대해서도 동일한 유형의 분석이 이루어집니다. SN 난모세포와 비교하여 NSN 난모세포에 의해 표시되는 지연된 극체 1 압출 피크에 주목하십시오.
화면 하단은 난모세포의 세포질 이동 속도의 시간적 패턴을 보여줍니다. 속도는 연속된 두 프레임을 비교하여 계산됩니다. 그런 다음 세포질 이동 속도의 원시 데이터를 Excel 시트로 내보내어 행, Frens 염기서열 및 열에서 분석된 단일 난모세포를 보고합니다.
왼쪽에는 SN 난모세포의 데이터, 오른쪽에는 NSN 난모세포의 데이터가 있습니다. 그런 다음 SN 또는 NSN 난모세포의 데이터를 10개의 하위 그룹으로 나눕니다. 9 개는 훈련에 사용되며 녹색입니다.
그리고 블라인드 테스트용 하나는 빨간색입니다. 이 절차는 총 10회 반복됩니다. 블라인드 테스트 샘플을 변경할 때마다.
그런 다음 피드포워드 인공 신경망(FANN)을 통해 데이터를 검사합니다. FANN은 전체 타임랩스 프레임을 분석하기 위해 제작되었으며, 여기서는 입력 뉴런"후자는 두 개의 출력 뉴런에 연결된 세 개의 숨겨진 뉴런에 연결되어 있습니다. 하나의 출력은 입력이 유능한 난모세포일 확률을 제공합니다.
반대로, 다른 하나는 입력이 무능한 난모세포라는 것입니다. 두 출력의 비교는 91.03%의 정확도로 난모세포 둘라 정신 능력을 예측합니다. 이 기술은 여기에 표시된 대로 마우스 난모세포에 대해 설정되었습니다.
그러나 향후 리콜은 인간 난모세포에서 테스트하는 것입니다. 사실, 난모세포 품질 분석의 비침습적 절차는 인공 생식 기술 분야에서 특히 필요합니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
이 기사는 체외 성숙 중에 난모세포 발달 능력을 평가하기 위한 비침습적 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 시간 경과 이미징과 입자 이미지 속도계측법(PIV)을 신경망 분석과 결합하여 사용합니다.
Assessing oocyte developmental competence non-invasively addresses a critical bottleneck in assisted reproductive technologies by enabling early selection of viable gametes. This approach supports predictive confidence in fertility treatment pipelines by correlating cytoplasmic movement profiles with developmental outcomes. The method’s adaptability to human oocytes offers translational value for improving IVF success rates and reducing clinical trial attrition in reproductive medicine.
The method integrates into early discovery workflows by providing a predictive assay for oocyte quality prior to fertilization, enabling go/no-go decisions in gamete selection pipelines.