발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

이 절차의 전반적인 목표는 비침습적 도구를 사용하여 뒤쪽 발달 능력을 가진 후구를 식별하는 것입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 체외 성숙 과정에서 발생하는 난모세포 움직임을 관찰하는 것만으로도 여성의 배우자 발달 잠재력을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 신경망 기반 분석인 입자 이미지 속도계와 결합된 타임 랩스 이미징을 기반으로 합니다.

여기에서는 생식 방포에서 중기 2 단계로 전환하는 동안 마우스 난모세포가 발달 능력 또는 무능력과 유의한 상관관계가 있는 상기 플라즈마 운동의 다른 프로필을 표시한다는 것을 입증하기 위해 취한 단계를 설명합니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 불임은 부부의 약 20%에 영향을 미치는 병리학이며, 암 치료를 받는 여성의 1/3이 조기 난소 부전의 위험에 처해 있습니다. 이것은 각각 미국이나 이탈리아와 같은 국가에 있는 약 300, 000 또는 30, 000명의 여성에 해당합니다.

난모세포 발달 역량을 확인하기 위한 비침습적 절차의 설계는 임신 결과의 전반적인 성공을 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서는 소나 인간과 같은 다른 포유류 종에 대해 쉽게 테스트하고 사용할 수 있도록 마우스용으로 개발된 절차의 가장 중요한 단계에 대한 세부 정보를 제공합니다. 난소는 M2 매체, 예열 및 평형, 섭씨 37도 및 5% CO2를 포함하는 Petrie 접시로 옮겨집니다.

난관과 약간의 지방이 난소 주변에 여전히 존재하면 제거해야 합니다. 그런 다음 핀셋으로 난소를 잡고 멸균 된 1G 바늘을 사용하여 난소 표면에 구멍을 뚫습니다. 구멍이 뚫린 난소를 M2 배지에서 제거하고 손으로 당긴 마이크로피펫을 사용하여 깨끗한 새 M2 배지로 첫 번째 이동을 유도한 다음 난모세포를 둘러싼 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 몇 초 동안 피펫을 안팎으로 피펫으로 넣습니다.

다음으로, 난모세포는 M2 배지의 20마이크로리터 방울로 전달되고 일부 적운 세포가 지속되는 경우 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 한 방울에서 한 방울로 여러 통로를 통해 완전히 제거됩니다. Hoechst 33342를 밀당 0.05마이크로그램의 최종 농도로 제조하기 위해 1회 pbs에서 제조된 밀당 5밀리그램 농도의 Hoechst의 온화한 용액으로 시작하고 필요한 농도가 얻어질 때까지 더 희석합니다. 3.5 마이크로 리터의 Hoechst 용액을 Petrie 접시 뚜껑 바닥에 놓고 희석 된 각 난모 세포를 단일 Hoechst 방울로 옮긴 다음 접시를 어두운 뚜껑으로 덮어 Hoechst 염색 과정에서 빛 노출을 줄이도록주의합니다.

10분 동안 염색한 후 자외선을 이용한 형광 현미경으로 난모세포를 관찰합니다. 염색질 형태에 따라 핵소체 주위에 x 양성 염색질 고리가 있는 경우 Surrounded Nucleolus, SN으로 분류되거나 nucleolus에 x 양성 염색질 고리가 없고 전체 염색질이 nucleolus에 분산된 것처럼 보이는 경우 Non-Surrounded Nucleolus, NSN으로 분류됩니다. 알파 멤 배지의 2마이크로리터 방울 4개를 유리 바닥 페트리 접시에 놓고 방울이 특정 거리 내에 있도록 주의하면서 떨어뜨리고, 방울을 미리 예열 및 평형화된 미네랄 오일로 겹쳐 놓고, 총 3-4개의 난모세포를 각 방울에 전달합니다.

Petrie 접시는 타임랩스 현미경의 배양 챔버로 옮겨져 섭씨 37도 및 CO2 5%의 온도를 장기간 유지하고 적색 LED 조명으로 조명을 유지할 수 있습니다. 타임랩스 분석 전에 BioStation 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 루틴 동안 한 드롭에서 다음 드롭으로의 이동을 자동화하기 위해 각 드롭의 좌표가 설정됩니다. 타임랩스 프레임은 8분 간격으로 총 15시간 동안 촬영됩니다.

그런 다음 기록된 영상은 CellPave 소프트웨어를 사용하여 분석되며, 이를 통해 속도 벡터로 표현되는 세포질 움직임을 감지할 수 있습니다. 첫째, CellPave 도구를 사용하면 각 난모세포의 둘레를 수동으로 구분할 수 있습니다. 그런 다음 소프트웨어는 두 개의 연속된 타임랩스 프레임을 비교할 때 발생하는 세포질 운동의 속도를 계산하고 색상 강도와 길이에 따라 움직임의 속도와 방향을 정의하는 컬러 화살표를 배치하여 표현합니다.

여기에서 볼 수 있는 난모세포 아래의 히스토그램은 SN 난모세포의 15시간 기록 기간 동안 전체 세포질 운동의 속도를 설명합니다. NSN 난모세포에 대해서도 동일한 유형의 분석이 이루어집니다. SN 난모세포와 비교하여 NSN 난모세포에 의해 표시되는 지연된 극체 1 압출 피크에 주목하십시오.

화면 하단은 난모세포의 세포질 이동 속도의 시간적 패턴을 보여줍니다. 속도는 연속된 두 프레임을 비교하여 계산됩니다. 그런 다음 세포질 이동 속도의 원시 데이터를 Excel 시트로 내보내어 행, Frens 염기서열 및 열에서 분석된 단일 난모세포를 보고합니다.

왼쪽에는 SN 난모세포의 데이터, 오른쪽에는 NSN 난모세포의 데이터가 있습니다. 그런 다음 SN 또는 NSN 난모세포의 데이터를 10개의 하위 그룹으로 나눕니다. 9 개는 훈련에 사용되며 녹색입니다.

그리고 블라인드 테스트용 하나는 빨간색입니다. 이 절차는 총 10회 반복됩니다. 블라인드 테스트 샘플을 변경할 때마다.

그런 다음 피드포워드 인공 신경망(FANN)을 통해 데이터를 검사합니다. FANN은 전체 타임랩스 프레임을 분석하기 위해 제작되었으며, 여기서는 입력 뉴런"후자는 두 개의 출력 뉴런에 연결된 세 개의 숨겨진 뉴런에 연결되어 있습니다. 하나의 출력은 입력이 유능한 난모세포일 확률을 제공합니다.

반대로, 다른 하나는 입력이 무능한 난모세포라는 것입니다. 두 출력의 비교는 91.03%의 정확도로 난모세포 둘라 정신 능력을 예측합니다. 이 기술은 여기에 표시된 대로 마우스 난모세포에 대해 설정되었습니다.

그러나 향후 리콜은 인간 난모세포에서 테스트하는 것입니다. 사실, 난모세포 품질 분석의 비침습적 절차는 인공 생식 기술 분야에서 특히 필요합니다.