Name: 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 배우세요 마우스 난자의 발달 능력을 비침습적으로 평가하는 방법을. 시간 경과 이미징과 입자 영상 속도 측정법 및 신경망 분석을 활용하여 생식 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품 가능한 덕분에 의해 지원 되었다: 파 비아 대학 FRG 2016; 파 르 마 대학 FIL 2014, 2016; 그리고이 연구를 수행 하는 데 필요한 plasticware 공급에 대 한 자세. 닥터 쉐 인 윈저 (공학 부, 브리스톨 대학, 영국)는 Cell_PIV 소프트웨어를 제공 하는 감사 합니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다.
1. 난소 격리
<ol><li>Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사.</li>
	<li>46-48 h를 기다립니다.</li>
	<li>Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg의 근육 주사와 anesthetize 및 마우스 무게. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.</li>
	<li>피부 절 개 집게의 쌍을 사용 하 여 복 벽을 덮고 파악. 피부를 잘라 하 고 한 쌍의가 위와 풀으로 체 벽 집게와 절 개를 엽니다.</li>
	<li>핀셋의 쌍을 사용 하 여, 배 짱, 자 궁 뿔을 정확 하 고 그들의 말단에 난소를 지역화 이동 합니다.</li>
	<li>부드럽게 시계 집게를 사용 하 여 난소를 누른 자 궁에 그것의 인 대를 잘라가 위를 사용 합니다. 다른 난소와 반복.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 공기에서에서 미리 예 열 하는 M2 절연 매체의 1 mL를 포함 하는 35 mm 셀 문화 페 트리 접시에 수집 된 난소를 전송 합니다.</li>
	<li>지방과 stereomicroscope에서 좋은 위를 사용 하 여 수 란 관을 제거 합니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 적 운 Oocyte 단지의
<ol><li>찔린 antral 적 운 oocyte 단지 (COCs)는 수 동적으로 해제 될 때까지 멸 균 핀셋 및 1 G 메 마른 인슐린 바늘을 사용 하 여 난소 표면 합니다.</li>
	<li>적 운 세포는 입 제어 손을 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 200 µ m)를 사용 하 여 3 개 이상의 레이어 COCs를 수집 하 고 신선한 M2 매체의 300 µ L 방울으로 그들을 전송.</li>
	<li>부드럽게 몇 초 동안 밖으로 pipetting으로 oocytes 손으로 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 80 µ m)를 사용 하 여 주변 적 운 세포를 제거</li>
	<li>반복 해 서 전송 oocytes M2 매체의 20 µ L 드롭에서 또 하나, 적 운 세포는 완전히 제거 될 때까지.</li>
</ol>3. chromatin Oocyte 조직 기반 분류
<ol><li>5 mg/mL 1 x PBS에 희석의 어머니 솔루션에서 M2 중간 시작에 0.05 µ g/mL의 최종 농도에 Hoechst 33342 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>3.5 µ L 마이크로 방울 Hoechst 얼룩 솔루션 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑의 하단에 배치 합니다.</li>
	<li>각 단일 oocyte Hoechst 얼룩 드롭으로 전송 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 난방 접시에 접시를 놓고 조명 박람회를 피하기 위해 어두운 뚜껑으로 커버.</li>
	<li>보육 실 온에서 10 분, 후 더 이상 1-2 s는 oocytes UV 빛 (330-385 nm), 아래에서 10 배 확대에 형광 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	<li>그들은 핵소체를 둘러싼 Hoechst 긍정적인 chromatin의 반지를 선물 하는 경우 oocytes 둘러싸여 핵소체 (SN) (그림 1A)로 분류 합니다.</li>
	<li>그들의 핵소체 Hoechst 긍정적인 chromatin 둘러싸이 지 고 쇼 분산 (그림 1B) 핵 내의 heterochromatic 명소 oocytes 하지 둘러싸여 핵소체 (NSN)으로 분류 합니다.</li>
</ol>4. 신경 네트워크 기반 Oocyte 분류
<ol><li>4 준비와 5% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 mM L-글루타민, 5mm 황소자리, 100 U/mL 페니실린, 75 µ g/mL 스 35 m m 유리로 23.5 µ µ g/L 나트륨 pyruvate 보충 하는 α-MEM 매체의 2 µ L 방울 페 트리 접시 바닥 및 함께 그들을 커버 미리 데워 진된 (37 ° C) 그리고 중간 증발을 피하기 위해 미리 equilibrated 미네랄 오일. 참고: 라이브 셀 검 진 시스템을 사용 하는 경우 유지를 특정 거리에서 지침으로 7 x 7 mm의 그려진된 격자를 사용 하 여.</li>
	<li>각 드롭 전송 3-4 oocytes입니다.</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 갖춘 라이브 셀-심사 시스템으로 유리 하단 페 트리 접시를 놓습니다 (참조 테이블의 자료), 안정적인 온도 (37 ° C)와 CO2 환경에서 oocyte 성숙의 관측을 허용 하 농도 (5%).</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 엽니다. 화면에서 창 왼쪽에 oocyte 라이브 샷 모든 설정 버튼 오른쪽에 나타납니다.</li>
	<li>화면의 중앙에 배치 하려면 oocyte의 중심을 선택 합니다. 필요 하다 면 초점을 조정 합니다.</li>
	<li>전화 버튼을 선택 하 고 192; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 1/125 s; 이득 1.99; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>FL2 선택한 5; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 3 s; 이득 에 2.37; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>문화 드롭 내 oocyte 위치를 기록 하기 위해 새 포인트 버튼을 선택 합니다. 문화 드롭 내 각 oocyte에 대해 동일한 루틴을 반복 합니다.</li>
	<li>시간 을 선택 하 고 8 분 및 15h 총 시간 에 수집 주기 를 설정 합니다.</li>
	<li>녹화 주기를 시작할 시작 시간 을 선택 합니다.</li>
	<li>MATLAB 소프트웨어를 열고 쓰기 >>cell_piv; 고 PIV 도구를 선택 합니다.</li>
	<li>기록된 영화를 포함 하는 폴더를 선택 하 고 전체 이미지 시퀀스를 로드 하려면.jpeg 파일을 선택 합니다. 각 oocyte 관심 (ROI) 영역 선택 영역 도구를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
	<li>파일 메뉴에서 프로세스 PIV 를 선택 합니다. 뷰어 도구 단추를 선택 합니다. 참고: 프로그램 투자 수익 내 속도 벡터를 계산 하 고.mat 파일으로 저장 된 데이터 파일을 자동으로 생성.</li>
	<li>열려는.mat 파일을 선택 합니다. 버튼 선택 ROI 도구 를 선택 하 고 개요는 oocyte의 원을 그립니다. 파일 메뉴에서 저장을 클릭 합니다. 참고:이 지역에서 벡터 표시 됩니다 하 고 평균 크기 데이터가 그래프 창에서이 새로운 투자 수익에 대 한 업데이트.</li>
	<li>오픈 전체 시간 경과 프레임의 수집된 평균 크기 데이터 기록, 행, 프레임 시퀀스에와, 열에는 스프레드시트에 각 단일 oocyte 분석.</li>
	<li>10 하위 그룹으로 NSN와 SN oocytes의 데이터를 구성 합니다.</li>
	<li>9 하위 그룹을 사용 하 여 반복적으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 훈련 (FANN) 및 블라인드 테스트 1 하위 그룹.<ol>
<li>다른 반복 9 번 변경 블라인드 테스트 샘플 (10 교차 유효성 검사).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB, 맞춤 스크립트 주요 실행 열고, 요청 시, 학습 데이터 (train.txt), NSN과 SN oocytes 사용 교육 및 시간 경과 간격 (일반적으로,에서 분석할 수 있는 파일의 이름을 삽입합니다 프레임 # 1-2 프레임 # 112-113).</li>
	<li>훈련을 수행 하기 위해 입력 을 누릅니다.</li>
	<li>테스트 데이터 (test.txt) 파일의 이름을 삽입 합니다.</li>
	<li>MATLAB 작업 공간에서 벡터 test_outputs_cyt 를 엽니다. 참고: 창이 나타납니다, 첫 번째 행, NSN과 SN oocytes에 대 한 진실한 확실성 (TP 또는 진정한 NSN)와 틀린 확실성 (FP 또는 False NSN)를 각각; 얻을 확률을 보여주는 화면에 대신, 두 번째 행에 각각 False 네거티브 (FN 또는 False SN)과 NSN과 SN oocytes에 대 한 진정한 원판 (테네시 또는 진정한 SN)을 확률에서.</li>
	<li>수식을 사용 하 여: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), 백분율로 표시 FANN 정확도 계산 하.</li>
</ol>

<ol><li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li>
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<li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-%CE%B6-induced+Ca2%2B+oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li>
<li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feed+forward+artificial+neural+network%3A+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li>
<li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Comput.+Intell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방지 하 고 oocytes의 전체 실험 그룹의 동기화 수 있습니다.
라이브 셀 심사 시스템 ( 재료의 표참조) 우리의 실험에 사용 된 4 방울, 따라서 실험 당 16 oocytes의 총 당 4 oocytes 성숙 상품의 수를 제한 합니다. 시스템 사용 하 여 다른 시간 경과 라이브 셀-상영, 상업적으로 사용 가능 하 고 여러 문화 챔버에 장착이 한계를 극복할 수 수 있습니다.
<...

여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.
암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.
Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)3로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이3,,45,6,7,8 표시 ,9, meiotic 및 발달 그들의 능력을 포함 하 여. 난소에서 분리 하 고 생체 외에서성숙 하는 때 모두 oocytes의 MII 무대를 입력 하 고 정자 수정 후 2-셀 단계로 개발 하지만 SN chromatin 조직 들만 기간9를 개발할 수 있습니다. 비록 좋은 유능한 대 무능 한 oocytes를 선택 하기 위한 분류 방법으로, 주요 단점은 자체 형광 색소와 무엇 보다도 자외선의 검색에 사용 되는 셀에 있을 수 있는 돌연변이 효과.
모든 이러한 이유로, 우리는 동일한 높은 분류 정확도 유지 하면서 Hoechst의 사용을 대체할 수 있는 SN 또는 NSN chromatin 구조와 관련 되었던 다른 비-침략 적 표시에 대 한 검색. 세포질 운동 속도 (CMVs)의 경과 관찰 셀 상태의 독특한 기능으로 떠오르고 있다. 예를 들어 최근 학문 CMVs 사이 협회 기록 수정 시간과 완료 preimplantation 및 전체 용어 개발10,11마우스 및 인간의 zygotes의 용량에서 설명 했다.
이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리가 여기 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes5,6,,78의 인식에 대 한 플랫폼을 설명 합니다. 플랫폼 기반으로 세 가지 주요 단계: 1) Oocytes antral 낭에서 격리는 먼저 둘러싸여 핵소체 (SN) 또는 아닙니다 포위 핵소체 (NSN); 그림 뿐만 아니라 그들의 chromatin 구성 중 하나에 따라 분류 각 단일 oocyte의 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 CMVs의 2) 시간 경과 이미지 촬영 및 분석 입자 이미지 velocimetry (PIV); 그리고 3) PIV와 얻은 데이터 분석으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 맹인 분류12,13. 우리는 그것을 테스트 하 고 다른 포유류 종 (예, 소, 원숭이 및 인간)에 대 한 사용 가능한 준비 하도록 마우스에 대 한 설계 절차의 가장 중요 한 단계의 세부 정보를 준다.

<table><tbody><tr><td>Folligon</td><td>Intervet</td><td>A201A02</td><td>호르몬 치료</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>난자 이질염색</td></tr>질 <tr><td>세포 배양 페트리 디쉬 35 mm x 10 mm&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>430165</td><td>COCs 격리</td></tr>용 <tr><td>EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td><td>Merck-Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>COCs 격리</td></tr>용 <tr><td>MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td>난자 세포</td></tr><tr><td>배양 페트리 디쉬 35 mm 유리 바닥&nbsp;</td><td>윌코&nbsp;</td><td>GWSt-3522</td><td>이미징 실험용</td></tr><tr><td>BioStation IM-LM&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MFA91001</td><td>라이브 셀 스크리닝 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Delchimica Scientific 유리 6709230</td><td></td><td>난포 조작용</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>오염 및 매체 증발을 방지하기 위해</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td>매체 오염을 방지하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>ML16141079</td><td>메이크업 &알파; MEM 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td>메이크업 & 알파; MEM 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0625</td><td>메이크업 &알파용; MEM 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A3310</td><td>메이크업 &alpha; MEM 매체</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>&nbsp; P4562</td><td>메이크업 &알파; MEM 미디어</td></tr><tr><td>Zoletil (Tiletamina 및 Zolazepan cloridrate)</td><td>Virbac Srl</td><td>QN01AX9</td><td>마우스 마취</td></tr><tr><td>Cell_PIV 소프트웨어용&nbsp;</td><td>영국 브리스톨 대학교의 Shane Windsor 박사가 친절하게 제공했습니다&</td><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-&</td><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;-</td><td>다중 패러다임 수치 컴퓨팅용</td></tr></tbody></table>

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

불 임 클리닉 발달 유능한 대 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO2시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.

그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지.
분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 대 이상 2 백의 감수 분열의 진행에서 시간 차이 보였다. 특히, NSN oocytes에서 GVBD는 크게 지연 1-2 시간 경과 프레임, PB1 압출 15 프레임 지연으로 발생 하는 반면. 이러한 차이도 불구 하 고 가변성은 단일 oocyte 분류를 허용 하도록 너무 높다. 이 절차는 수학적 분류 도구 구현 되었습니다.
...

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

이 절차의 전반적인 목표는 비침습적 도구를 사용하여 뒤쪽 발달 능력을 가진 후구를 식별하는 것입니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 체외 성숙 과정에서 발생하는 난모세포 움직임을 관찰하는 것만으로도 여성의 배우자 발달 잠재력을 평가할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 신경망 기반 분석인 입자 이미지 속도계와 결합된 타임 랩스 이미징을 기반으로 합니다.여기에서는 생식 방포에서 중기 2 단계로 전환하는 동안 마우스 난모세포가 발달 능력 또는 무능력과 유의한 상관관계가 있는 상기 플라즈마 운동의 다른 프로필을 표시한다는 것을 입증하기 위해 취한 단계를 설명합니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 불임은 부부의 약 20%에 영향을 미치는 병리학이며, 암 치료를 받는 여성의 1/3이 조기 난소 부전의 위험에 처해 있습니다. 이것은 각각 미국이나 이탈리아와 같은 국가에 있는 약 300, 000 또는 30, 000명의 여성에 해당합니다.난모세포 발달 역량을 확인하기 위한 비침습적 절차의 설계는 임신 결과의 전반적인 성공을 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서는 소나 인간과 같은 다른 포유류 종에 대해 쉽게 테스트하고 사용할 수 있도록 마우스용으로 개발된 절차의 가장 중요한 단계에 대한 세부 정보를 제공합니다. 난소는 M2 매체, 예열 및 평형, 섭씨 37도 및 5% CO2를 포함하는 Petrie 접시로 옮겨집니다.난관과 약간의 지방이 난소 주변에 여전히 존재하면 제거해야 합니다. 그런 다음 핀셋으로 난소를 잡고 멸균 된 1G 바늘을 사용하여 난소 표면에 구멍을 뚫습니다. 구멍이 뚫린 난소를 M2 배지에서 제거하고 손으로 당긴 마이크로피펫을 사용하여 깨끗한 새 M2 배지로 첫 번째 이동을 유도한 다음 난모세포를 둘러싼 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 몇 초 동안 피펫을 안팎으로 피펫으로 넣습니다.다음으로, 난모세포는 M2 배지의 20마이크로리터 방울로 전달되고 일부 적운 세포가 지속되는 경우 적운 세포가 완전히 제거될 때까지 한 방울에서 한 방울로 여러 통로를 통해 완전히 제거됩니다. Hoechst 33342를 밀당 0.05마이크로그램의 최종 농도로 제조하기 위해 1회 pbs에서 제조된 밀당 5밀리그램 농도의 Hoechst의 온화한 용액으로 시작하고 필요한 농도가 얻어질 때까지 더 희석합니다. 3.5 마이크로 리터의 Hoechst 용액을 Petrie 접시 뚜껑 바닥에 놓고 희석 된 각 난모 세포를 단일 Hoechst 방울로

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Oocytes는 meiotic 성숙하는 동안 염색체 분리의 오류로 인해 aneuploidy하는 경향이 있습니다. Aneuploid 계란은 다운 증후군과 같은 불임, 유산 또는 발달 장애를 일으킬 수 있습니다. 여기서 우리는 oocytes과 meiotic 성숙을 연구하고 ploidy 평가 방법에 선택의 자료를 소개하는 방법을 설명합니다.

마우스 Oocyte의 Microinjection, 성숙과 Ploidy 평가

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.

감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 마우스 Oocytes를 사용 하 여 나

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

여기에서, 우리는 고정 마우스 난소 조직의 정확한 여포 계산을 위한 2개의 다른 기술을 기술하고, 비교하고, 대조합니다.

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.

마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가

시냅스와 재조합의 감수분열 오류는 포유류 난모세포에 일반적입니다. 이러한 과정에 관여하는 단백질에 대한 엄격한 분석은 난자형성이 어떻게 그리고 왜 잘못되는지를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에 제시된 기술을 통해 재조합 및 시냅스를 종합적으로 모니터링하여 마우스의 난모세포 품질을 평가할 수 있습니다.

시냅스와 재조합 평가를 위한 마우스 난모세포에서 퍼진 감수분열 염색체 준비(Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Oocytes for Assessment of Synapse and Recombination)

이 프로토콜은 마우스 난자의 시험관 내 성숙, 시험관 수정, 그리고 배아를 배반포 단계까지 배아 배양하는 절차를 설명합니다.

생쥐 난자 내 시험관 성숙, 수정 및 착상 전 배아의 배양

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

배우세요 마우스 난자의 발달 능력을 비침습적으로 평가하는 방법을. 시간 경과 이미징과 입자 영상 속도 측정법 및 신경망 분석을 활용하여 생식 의학 연구에 활용할 수 있습니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

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