사용 하 여 계통 발생 분석은 진 핵 유전자 원산지 조사

이 방법은 염기서열을 수집하는 방법 및 올바른 계산 모델을 선택하는 방법과 같은 식물 유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 배우기가 매우 쉽다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 계통발생의 원리와 방법에 대한 기본 지식이 부족하여 데이터를 처리하는 방법을 모르기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 방법은 진핵생물 SWEET 유전자의 정렬을 분석했을 때 처음 개발되었습니다. 이 방법의 시각적 시연은 정렬의 다양한 측면에 대한 선택 및 설정의 크기가 있기 때문에 매우 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단세포 진핵생물에서 35개의 후보 SWEET 단백질을 선택하여 이 절차를 시작합니다.

35개의 SWEET 염기서열을 Clustal Omega에 입력하여 정렬합니다. FASTA 형식의 단백질 염기서열을 복사하여 입력 상자에 붙여넣거나 FASTA 형식의 염기서열 파일을 업로드합니다. 이것이 아미노산 염기서열임을 지정하려면 step one 섹션의 풀다운 메뉴 아래에 있는 아이콘을 클릭합니다.

필요한 경우 2단계 섹션에서 출력 형식 및 기타 매개 변수를 지정합니다. 이 연구에서는 출력 형식을 숫자 없는 Clustal로 설정하고 다른 매개변수는 기본 설정으로 둡니다. 대부분의 경우 기본 매개 변수는 사양 없이도 잘 작동합니다.

3단계 섹션에서 정렬을 제출하고 실행합니다. 정렬이 완료될 때까지 몇 초에서 몇 분까지 걸릴 수 있습니다. Result Summary 패널에서 Alignment in CLUSTAL format 아래의 링크를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 정렬된 시퀀스를 35.clustal로 저장합니다.

BioEdit에서 정렬 결과 파일을 열려면 Sequence를 클릭하고 BioEdit의 메인 패널에 있는 첫 번째 풀다운 메뉴에서 Edit Mood를 선택합니다. 그런 다음 하위 메뉴에서 Edit Residues(잔류 물 편집)를 클릭합니다. 커서로 정렬의 왼쪽에 있는 돌출 시퀀스를 선택하고 편집(Edit) 메뉴에서 삭제(Delete) 아이콘을 클릭하여 선택한 시퀀스를 제거합니다.

첫 번째 MtN3 타액 영역의 오른쪽에 있는 염기서열을 선택하여 삭제하고 트리밍된 첫 번째 MtN3 타액 도메인 염기서열을 35-1.fas로 저장합니다. 마찬가지로 두 번째 MtN3 타액 영역의 좌우 염기서열을 삭제하고 35-2.fas로 저장합니다. 첫 번째와 두 번째 MtN3 타액 영역 염기서열은 리듬 또는 TMHMM으로 미리 예측할 수 있습니다.

35-1. fas 파일을 MEGA로 열고 메시지가 표시되면 정렬을 클릭합니다. Edit(편집) 메뉴에서 Select All(모두 선택)을 클릭합니다.

그런 다음 시퀀스 선택(Select Sequences)을 클릭합니다. 분류군의 이름과 순서는 검은색으로 선택됩니다. 편집 메뉴에서 복사를 선택하여 시퀀스를 클립보드에 복사한 다음 복사한 시퀀스를 doc 파일에 붙여넣습니다.

doc 파일에서 모든 숫자 기호를 보다 큼 기호로 바꾼 다음 관련 없는 문자를 삭제하여 FASTA 형식으로 변환합니다. 각 분류군 이름 끝에 1을 추가하여 첫 번째 MtN3 타액 도메인 염기서열로 표시합니다. 동일한 방법에 따라 두 번째 MtN3 타액 도메인 염기서열을 처리하고 각 분류군 이름 뒤에 2를 추가합니다.

이제 FASTA 형식의 첫 번째 및 두 번째 MtN3 타액 도메인 염기서열을 doc 파일에 결합합니다. 이렇게 하려면 결합된 염기서열을 Clustal Omega에 다시 로드하고 이전과 같이 염기서열을 정렬합니다. 결과를 35realigned.clustal로 저장합니다.

BioEdit에서 35realigned. clustal 파일을 엽니다. 정렬된 염기서열의 양쪽 끝에서 불균일한 아미노산 잔기를 삭제한 다음 염기서열을 35realigned.fas로 저장합니다.

일부 비표준 문자를 저장할 수 없다는 경고가 표시되면 예를 클릭합니다. 오픈 35재정렬. MEGA의 fas.

데이터 메뉴를 클릭하고 선형 내보내기를 선택합니다. 그런 다음 POP 형식으로 정렬을 35로 저장합니다. MR Base에서 나중에 사용하기 위해 다음.

한편, MEGA의 메인 패널에서 모델 아이콘을 클릭합니다. Find Best DNA Protein Models(최상의 DNA 단백질 모델 찾기)를 선택하고 팝업 창에서 OK(확인)를 클릭합니다. 계산을 클릭하여 모델 검색 프로세스를 시작합니다.

새 진행률 패널이 열립니다. 이 프로세스는 로드된 시퀀스의 복잡성과 컴퓨터 성능에 따라 몇 분에서 며칠까지 지속됩니다. 모델 검색 프로세스가 완료된 후 결과를 보여주는 테이블이 열립니다.

가장 작은 BIC 점수가 먼저 나열되고 그 다음에 BIC 점수가 점진적으로 증가하는 일련의 다른 모델이 나열됩니다. BIC 점수가 가장 작은 첫 번째 모델 LG+G+F는 35realigned를 기반으로 ML 트리에 권장되는 모델입니다. FAS 파일.

그런 다음 MEGA의 메인 패널에서 계통 생성 아이콘을 클릭합니다. Construct/Test the Maximum Likelihood Tree(최대우도 트리 구성/테스트)를 클릭한 다음 팝업 패널에서 Yes(예)를 클릭합니다. 지정해야 하는 다른 매개변수를 보여주는 새 창이 열립니다.

먼저, 계통 발생 상자의 테스트에서 부트 스트랩 값을 설정하십시오. 대부분의 경우 500 또는 1, 000이 적절합니다. Substitution Model(대체 모델)에서 amino acid(아미노산)를 대체 유형으로 선택합니다.

대입 모델을 선택하는 목적은 현재 상태를 기반으로 시퀀스 간의 실제 차이를 추정하는 것입니다. 모델 및 방법(Model and Method) 상자에서 LG with Freqs Model(주파수 모델이 있는 LG)을 선택합니다. Rates and Patterns(속도 및 패턴) 상자에서 분포된 감마를 선택하여 천천히 진화하는 사이트의 변경 사항에 더 많은 가중치를 부여하는 것과 같이 사이트 간의 속도 변화를 설명합니다.

데이터 하위 집합 상자에서 전체 삭제를 선택하여 하이픈이 포함된 모든 열을 제거합니다. 다른 모든 매개 변수를 기본 상태로 유지합니다. 이러한 매개변수를 지정한 후 Compute 아이콘을 클릭하여 계산을 시작합니다.

계통발생학적 ML 트리는 MEGA를 사용한 계산이 완료되면 표시됩니다. Tree(트리) 패널에 있는 File(파일) 아이콘의 풀다운 메뉴에서 Save Current Session(현재 세션 저장)을 선택하여 결과를 저장합니다. 본 연구에서 결과는 35.mas로 저장되었습니다.

트리 패널에는 clade의 길이, 나무 스타일, 나무 토폴로지, 분류 이름 글꼴, 크기 및 색상을 포함한 많은 매개 변수가 표시되며 다른 옵션으로 설정할 수 있습니다. 이미지 아이콘을 클릭하여 최종 트리 파일을 저장하고 그림을 다른 형식으로 저장하거나 이미지를 사진 편집 소스로 복사합니다. SWEET와 semiSWEET의 관계 분석을 진행하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 MR Base를 사용한 서열 정렬 계통수 구성을 사용합니다.

계통발생 나무는 35개의 SWEET 서열의 첫 번째 MtN3 타액 도메인이 모두 하나의 군집으로 군집되어 있고 SWEET 염기서열의 두 번째 MtN3 타액 도메인이 다른 군집으로 군집되어 있음을 보여줍니다. 또한, SWEET와 semiSWEETs의 정렬 결과는 알파-프로테오박테리아의 일부 semiSWEETs가 SWEET 서열의 첫 번째 MtN3 타액 도메인과 정렬된 반면, 메타노박테리아의 semiSWEETs는 SWEET 서열의 두 번째 MtN3 타액 도메인과 정렬되었음을 보여줍니다. 이러한 결과는 SWEET를 포함하는 두 개의 MtN3 타액 도메인이 박테리아 semiSWEET와 고세균의 진화적 융합에서 파생될 수 있음을 시사합니다.

이 기술을 마스터하면 데이터의 복잡성에 따라 1시간에서 며칠 안에 완료할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 사전에 고품질 시퀀스를 수집하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 프로토콜은 진화 연구자들이 상동 유전자 간의 관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 계통발생 나무를 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.