January 3rd, 2018
건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 실시간, 3D, 단일 입자 추적 현미경을 구현하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 확산 나노 스케일 물체를 광자가 제한된 시간 해상도로 지속적으로 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 전체 감염 과정에서 단일 비리온을 추적하는 것과 같은 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
광학 테이블에 장치를 준비합니다. 이 설정은 보정할 준비가 되었습니다. 주요 구성 요소로는 488나노미터 고체 레이저, 빔 경로를 따라 있는 두 개의 전기 광학 디플렉터, 조정 가능한 음향 구배 렌즈, 마이크로 및 나노 포지셔너가 있는 샘플 스테이지가 있습니다.
이 설정 회로도는 추가 세부 정보를 제공합니다. 다음은 샘플 스테이지에 대한 레이저 빔 경로입니다. 전기 광학 디플렉터와 조정 가능한 음향 렌즈는 빔의 경로를 따라 있습니다.
이러한 장치는 샘플 단계에서 레이저 스폿을 동적으로 구동합니다. 샘플의 광자는 눈사태 포토 다이오드에 의해 계산됩니다. 카메라는 입자의 위치를 모니터링합니다.
샘플의 위치는 마이크로 및 나노 컨트롤러를 사용하여 설정됩니다. 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이는 레이저 스폿, 실시간 입자 위치 계산, 스테이지 피드백 및 광자 계수를 제어합니다. 두 개의 샘플을 준비해야 합니다.
첫 번째는 인산염 완충 식염수에 희석된 190나노미터 형광 비드가 필요합니다. 커버 슬립을 사용하여 고정 입자 샘플을 준비합니다. 400마이크로리터의 비드 용액을 커버 슬립에 놓습니다.
이제 자유롭게 움직이는 입자 샘플을 생산합니다. 물에 희석된 110나노미터 형광 구슬이 필요합니다. 400마이크로리터의 용액을 커버 슬립에 올려 자유롭게 움직이는 입자 샘플을 만듭니다.
고정 입자 샘플을 현미경으로 가져와 장착합니다. 샘플은 XY 나노 포지셔너에 있습니다. 레이저, 광 검출기, 빔 라인 요소에 대한 컨트롤러 및 포지셔너를 켭니다.
피에조 나노 포지셔너를 폐쇄 루프에서 실행합니다. 그런 다음 광 검출기 앞에서 형광 방출 필터를 제거합니다. 그런 다음 마이크로 포지셔너로 샘플의 z 위치를 변경합니다.
위치가 변함에 따라 광 검출기를 사용하여 레이저 반사의 강도를 모니터링합니다. 대물 렌즈의 초점면을 식별하기 위해 강도를 최대화합니다. 샘플을 초점면에 놓고 형광 방출 필터를 교체합니다.
이제 컴퓨터 제어 소프트웨어로 작업하십시오. 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 샘플을 래스터 스캔합니다. 먼저 큰 스캔 범위, 시작과 종료의 차이를 설정합니다.
여기서 범위는 Y에서 10마이크로미터, X에서 10마이크로미터이며 각 방향에서 큰 스텝 크기를 설정합니다. 여기, 200 나노 미터. 두 Z 필드를 모두 이전에 식별된 초점 평면 위치로 설정합니다.
스캔을 누르면 래스터 스캔이 시작됩니다. 스캔을 시작합니다. 이 소프트웨어는 야간 투어에서 전기 광학 디플렉터를 구동하고, 광 검출기에서 개수를 수집하고, 나노 포지셔너를 구동하고, 위치 계산을 수행합니다.
스캔은 플라타 형광을 통해 소프트웨어에서 식별할 수 있는 입자를 찾습니다. 스캔의 각 부위에 대해 소프트웨어는 전기 물체 디플렉터 스캔의 중심을 기준으로 X 및 Y의 입자 위치 추정치도 결정합니다. 입자를 찾은 후 주변의 스캐닝 범위를 X와 Y에서 2마이크로미터로 축소하고 둘 다의 단계 크기를 100나노미터로 줄입니다.
2마이크로미터의 Z 방향으로 스캔 범위를 추가하여 형광 초점을 브래킷화합니다. Z 스텝 크기를 200나노미터로 설정합니다. 3D 래스터 스캔을 시작하여 형광 초점을 찾습니다.
스캔에서 생성된 데이터는 tunable acoustic gradient lens의 전원을 켜기 전의 초점면을 보여줍니다. 제어 소프트웨어 내에서 조정 가능한 음향 렌즈 설정으로 작업을 계속하십시오. 먼저 연결을 클릭한 다음 전원을 켭니다.
pulse and gating control section(펄스 및 게이팅 제어 섹션)으로 이동하여 출력 트리거 모드를 RGB에서 multi-plane으로 변경합니다. 그런 다음 다시 RGB로 변경하여 출력 위상을 변경할 수 있습니다. 슬라이더를 사용하여 출력 위상을 0도, 90도 및 270도 사이에서 설정합니다.
그런 다음 주파수 제어 섹션으로 이동합니다. 거기에서 68, 500Hz의 공진 주파수를 선택하십시오. 화면 상단으로 이동하여 고급을 클릭합니다.
그런 다음 설정 탭을 선택합니다. 새 화면에서 0 열의 최대 빈도를 찾습니다. 주파수 검색 범위를 변경하려면 조정하십시오.
클릭하고 보정을 저장한 다음 보정을 종료합니다. 주파수 컨트롤로 돌아가서 공진 주파수를 변경합니다. 즉시 68, 500 헤르츠로 다시 변경하여 교정을 적용하십시오.
진폭 제어 섹션에서 슬라이더를 사용하여 진폭을 35%까지 천천히 올립니다.그런 다음 잠금 공명을 클릭합니다. 주파수가 잠겨 있으면 공진 잠금 해제를 클릭합니다. 래스터 스캔 소프트웨어로 돌아갑니다.
X와 Y의 입자를 중심으로 한 두 개의 마이크로미터 스캐닝 범위를 입력하고 100나노미터의 단계 크기를 사용합니다. 입자를 Z의 4마이크로미터 범위, 200나노미터의 단계 크기로 중앙에 배치합니다. 그 결과 스캐닝 이미지에서 입자를 나타내는 조명 영역은 약 1마이크로미터 너비입니다.
이를 기반으로 XY 스케일 매개변수를 조정하여 X 및 Y의 예상 위치 범위가 음의 0.5에서 0.5마이크로미터 사이가 되도록 합니다. Z 스케일을 사용한 유사한 절차 후 나노 포지셔너를 제로 위치로 설정합니다. 계속하기 전에 나노 포지셔너의 전원을 끄십시오.
고정된 입자 샘플을 자유롭게 움직이는 입자 샘플로 교체합니다. 그런 다음 모든 장비가 켜져 있는지 확인하십시오. 피에조 나노 포지셔너를 개방 루프에서 실행합니다.
컴퓨터에서 조정 가능한 acoustic gradient lens 소프트웨어를 이전과 같이 설정합니다. 광 검출기로 가는 경로에서 형광 방출 필터를 제거합니다. 샘플 Z 위치를 변경하고 커버 슬립에서 레이저 반사 강도를 최대화하여 초점면을 찾습니다.
초점면을 찾은 후 초점 위치를 솔루션으로 15마이크로미터 늘립니다. 형광 방출 필터를 교체합니다. 사용자 지정 추적 소프트웨어를 엽니다.
위치 추정 파라미터를 최적화 중에 찾은 값으로 설정합니다. 이제 나노 포지셔너의 응답 속도를 지시하는 적분 제어 상수를 설정합니다. X 상수로 시작합니다.
낮은 값을 입력하고 천천히 늘리십시오. 입자 위치 판독에서 진동이 시작되면 제어 상수의 값을 기록해 두십시오. 적분 제어 상수를 진동이 시작될 때 값의 약 70%로 줄입니다.
Y 및 Z 컨트롤 상수를 사용하여 단계를 반복합니다. 트랙 임계값을 3킬로헤르츠로 추적하기 시작하도록 트리거를 설정합니다. 추적을 종료하는 트리거인 트랙 최소값을 1.5kHz로 설정합니다.
검색을 클릭한 다음 자동 추적을 클릭하여 실험을 시작합니다. 이 동영상은 3차원 동적 광자 국소화 추적 현미경을 사용하여 물 속에서 110나노미터 형광 나노 입자의 확산 운동을 추적한 결과를 보여줍니다. 나노 포지셔너의 위치 판독값을 사용하여 측정된 입자의 위치가 3D 축에 표시됩니다.
삽입은 과학적인 바다 이끼 카메라의 판독 값입니다. 이는 입자가 추적 시스템에 의해 초점 볼륨에 고정되어 유지되고 있음을 보여줍니다. 입자는 추적되었고 그 위치는 2분 이상 기록되었습니다.
이 기술을 마스터하면 시스템이 올바르게 정렬되고 보정 매개변수가 설정된 경우 50분 이내에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 약물 전달 분야의 연구자들이 세포 화물의 내재화 및 수송 경로를 탐색하는 데 도움이 될 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 제로 타임 3D 단일 입자 추적 현미경을 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 프로토콜은 나노스케일 형광 프로브를 모니터링하도록 설계된 실시간, 3D, 단일 입자 추적 현미경의 구현을 자세히 설명합니다. 이 기술은 광자가 제한적인 조건에서도 단일 확산 물체의 지속적인 관찰을 가능하게 합니다.
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.