Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

이 프로토콜의 전반적인 목표는 숙주의 생리학적 조건에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 생물막 형성을 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 실시간으로 발생하는 생물막 형성을 관찰할 수 있으며 항균제의 효과를 테스트하거나 유전적 돌연변이를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 높은 처리량 방식으로 생물막에 대한 활성에 대한 잠재적인 치료제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 그 효과를 측정, 시각화 및 현재 치료와 비교할 수 있습니다.

이 기술의 주요 이점은 연구자에게 관심사의 몇몇 다른 조건 하에서 biofilm 대형을 분석하기 위하여 이용될 수 있다 입니다. 이 방법은 칸디다 알비칸스 생물막 형성을 연구하기 위해 특별히 개발되었지만 박테리아뿐만 아니라 다른 곰팡이 종을 포함한 다른 생물막 형성 미생물에도 적용할 수 있습니다. 먼저 표준 미생물 관행에 따라 효모 추출물 펩톤 포도당 또는 YPD 배지 한천에 도금 된 세포에서 다양한 C.albicans 균주의 단일 콜로니 배양을 준비합니다.

다음으로, 컨트롤러, 두 개의 전원 공급 장치, 현미경, 카메라 및 시스템에 연결된 컴퓨터를 포함하는 미세유체 시스템을 켭니다. 컴퓨터가 로드되면 시스템을 제어하는 소프트웨어를 엽니다. 사용 중인 플레이트의 바코드 번호를 찾아 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 번호를 입력합니다.

그런 다음 제어 모듈에서 미세유체 시스템 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 그런 다음 입구 웰 I1, I7, I13 및 I19를 클릭하고 인터페이스 플레이트 튜브를 통해 멸균 공기를 5분 동안 흐르게 하여 응결을 제거합니다. 모든 응축이 증발하면 48웰 0-20 다인 미세유체 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다.

12시간 생물막 형성 실험의 경우 먼저 600마이크로리터의 예열된 매체를 주입정에 추가합니다. 48웰 미세유체 플레이트 위에 있는 청소된 인터페이스 플레이트를 천천히 내립니다. 그런 다음 튜브가 입구 및 출구 웰 상단에 배치되고 제자리에 고정될 때까지 인터페이스 플레이트를 약간 왼쪽으로 밉니다.

소프트웨어의 전단 제어 섹션에서 흐름 모드를 상수로 설정하고 최대 전단을 센티미터당 1다인 제곱으로 설정합니다. 그런 다음 매체가 있는 주입구를 클릭하여 채널을 프라이밍하기 위해 주입구에서 배출구 우물로의 매체 흐름을 시작합니다. 5분 동안 흐른 후 소프트웨어의 웰 플레이트 제어 섹션에서 중지 버튼을 클릭합니다.

그런 다음 인터페이스 플레이트를 제거하고 미세유체 플레이트 웰을 관찰합니다. 배출구에서 작은 한 방울의 미디어만 볼 수 있어야 합니다. 야생형 및 돌연변이 C.albicans 균주를 테스트하려면 스파이더 배지에서 50마이크로리터의 야생형 SC5314 세포 배양을 두 개의 출구 웰에 추가하고, 스파이더 배지의 bcr1 돌연변이를 두 개의 출구 웰에 추가하고, 스파이더 배지의 EFG1 돌연변이체를 두 개의 출구 웰에 추가합니다.

인터페이스 플레이트를 미세유체 플레이트에 다시 놓고 뚜껑을 제자리에 잠급니다. 소프트웨어의 전단 제어 섹션으로 돌아가서 흐름 모드를 일정으로 설정하고 최대 전단을 센티미터 제곱당 2다인으로 설정합니다. 세포가 있는 배출구 웰을 클릭하여 배출구에서 주입구 웰로 매체의 흐름을 시작하여 C.albicans의 파종을 시작합니다.

3초 후 웰 플레이트 제어 섹션의 중지 버튼을 클릭하여 세포가 주입 웰로 유입되는 것을 방지합니다. 초기 세포 부착을 위해 관찰 채널에서 10-20분 동안 세포가 흐름 없이 정지 상태를 유지하도록 합니다. 이미징 모듈 창에서 다차원 획득 모듈을 열고 왼쪽 메뉴의 스테이지 탭을 클릭합니다.

스테이지 섹션에서 48-well 0-20 dyne 미세유체 플레이트에 대한 마스터 스테이지 목록을 로드합니다. 그런 다음 샘플 재장전 조정을 열고 스테이지를 절대 위치 모듈로 이동합니다. 샘플 재장전 조정 모듈에서 라이브 버튼을 눌러 십자선이 있는 이미지 미리보기를 확인합니다.

조이스틱을 사용하여 보기 채널 4에 인접한 화살표 끝이 소프트웨어의 십자선과 정렬되도록 웰 플레이트를 배치합니다. 그런 다음 스테이지 이동 절대 위치 메뉴로 이동하여 원점 설정 버튼을 누릅니다. 그런 다음 Sample reload 조정 모듈로 돌아가서 왼쪽 메뉴의 초기 참조 포인트 섹션을 클릭하고 48-well 0-20 dyne 미세유체 플레이트에 대한 파일을 로드합니다.

다차원 획득 모듈의 스테이지 섹션에서 스테이지 위치 22.2를 두 번 클릭하여 채널 22를 보면서 현미경 보기 스테이지와 카메라 초점을 화살표 마커에 가깝게 만듭니다. 그런 다음 조이스틱을 사용하여 보기 채널 22에 인접한 화살표 끝이 십자선과 정렬되도록 웰 플레이트를 배치합니다. 다차원 수집 모듈의 Y 좌표를 의 Y 위치에 복사합니다.

2 Sample Reload Adjustment 모듈의 Update Reference Points 탭에서. 마지막으로, Sample reload adjustment 모듈의 Update Stage Positions 탭에서 Apply to MDA stage list를 클릭합니다. 이미징 모듈 창에서 다차원 획득 모듈을 사용하고 왼쪽 메뉴에서 저장 탭을 클릭합니다.

그런 다음 실험의 파일 이름과 획득한 이미지를 컴퓨터에 저장할 폴더를 선택합니다. 그런 다음 타임랩스 탭을 클릭하고 각 이미지 사이에 5분 동안 총 145개의 이미지를 획득하도록 설정합니다. 그런 다음 파장 탭에서 파장 수를 1로 설정하고 12-20밀리초의 노출 시간으로 50% 명시야 및 50% 카메라에서 캡처합니다.

게인을 0.6으로 설정하고 디지타이저를 20밀리헤르츠로 설정합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 초점을 설정한 후 획득을 선택하여 모든 하위 단계에 대해 부착된 세포의 사전 플러시 이미지 캡처를 시작합니다. 전단 제어 섹션에서 흐름 모드를 상수로 설정하고 최대 전단을 센티미터당 1다인 제곱으로 설정합니다.

그런 다음 주입구 웰을 클릭하여 접착되지 않은 세포를 제거하기 위해 주입구에서 배출구 웰로 매체의 흐름을 시작합니다. 5분 후 웰 플레이트 제어 섹션에서 중지 버튼을 클릭합니다. 두 번째 라운드의 이미지를 획득한 다음 전단 제어 섹션에서 최대 전단 흐름을 0.5 dyne per centimeter 제곱으로 조정하고 변경 사항을 확인합니다.

이미징 모듈 창에서 분석 도구 탭을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 다차원 데이터 검토를 클릭합니다. 그런 다음 기본 파일 선택을 클릭하십시오. 그러면 다차원 데이터 세트 유틸리티 창이 열립니다.

그런 다음 디렉토리 선택 버튼을 클릭하고 실험을 저장하는 데 사용된 폴더를 선택합니다. 데이터 세트 목록에서 실험 파일 로그를 선택합니다. 로그가 로드되면 보기 버튼을 클릭합니다.

왼쪽 파장 메뉴의 옵션을 클릭하여 파장을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 보려는 스테이지 위치를 선택합니다. 이미지 번호를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모듈 상단의 숫자에서 로드할 이미지를 선택합니다. 그런 다음 타임랩스 비디오를 만들기 위해 모든 이미지를 선택합니다.

선택한 이미지가 새 창에서 비디오로 열립니다. 이미징 모듈 창에서 파일 탭을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 다른 이름으로 저장을 선택합니다. 결과 비디오를 기본 파일 형식으로 저장합니다.

마지막으로 저장된 비디오 파일을 이미지 J.In 이미지 J로 열고 로드하고 파일 탭을 클릭한 다음 다른 이름으로 저장을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 AVI를 선택하고 초당 10프레임으로 설정된 JPEG 변환을 사용하여 파일을 AVI 파일로 변환합니다. RPMI 1640 배지의 야생형 조건에서 여러 세포가 채널에 강하게 부착되었습니다.

그들은 균사를 형성하고 삽입하는 균사 및 효모 세포와 함께 두꺼운 생물막을 관찰할 수 있습니다. 미세유체 실험이 끝날 무렵, 야생형 생물막이 이 시청 채널을 완전히 채웁니다. 그러나 암포테리신 B의 존재는 생물막 형성을 감소시키는 데 뚜렷한 효과가 있습니다.

구체적으로, 세포의 부착력이 감소하고 여러 세포가 매체의 전단 흐름과 함께 흘러가는 것을 볼 수 있습니다. 이번에 거미 배지에서 성장한 야생형 대조 세포는 RPMI에서 자라는 것으로 방금 보여진 것과 유사한 생물막을 형성했습니다. 또한 이 배지에서 자란 두 개의 생물막 결함 돌연변이가 있습니다.

두 균주 모두 대조군에 비해 생물막 형성이 심각하게 감소된 것으로 나타났습니다. 이 세포 집단에서 부착된 세포는 균사를 형성하지 않으며 생성된 생물막에 심각한 결함이 있습니다. 이 다른 균주는 생물막 형성과 채널에 부착하는 능력에 결함이 있습니다.

이 실험을 완전히 마스터하면 한 시간 이내에 설정할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 초기 세포 부착, 생물막 성숙 및 세포 분산을 포함한 생물막 형성의 다양한 측면에 대해 많은 것을 배울 수 있습니다. 이 프로토콜은 사용자 정의가 가능하고 다재다능합니다.

왕국 전체에 걸쳐 다양한 미생물 종을 평가하도록 조정할 수 있습니다. 유속, 온도, 배양 시간 및 배지는 혼합 종 생물막을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 미세유체 생물막 분석법은 in vivo 동물 실험 전에 활용하기 위해 in vitro assay로 적극 권장합니다.

우리의 경험에 비추어 볼 때, 이 분석의 결과는 기존의 in vivo 생물막 분석과 매우 밀접한 관련이 있습니다.