Name: Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 Candida albicans 바이오필름 형성을 자동 미세유체 장치를 사용하여 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 항균제 효능 테스트와 유전자 돌연변이체 평가에 활용됩니다.

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우리 biofilm 분석에 유용한 토론 Nobile 연구소의 모든 구성원을 감사합니다. 이 연구는 건강 (NIH) 부여 R21 AI125801 (C.J.N.)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. D.L.R.는 멕시코와 미국 (UC-MEXUS)와 Consejo 나시오날 드 많은 y Technologia (CONACYT) 캘리포니아 연구소의 대학에서 박사 과정 장학금에 의해 지원 되었다.

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고모 J. Nobile BioSynesis, Inc., 저 해제 및 C. albicans biofilms의 진단 개발 회사의 설립자 이다.

여기에 설명 된 사용자 지정 가능한 미세 biofilm 분석 결과 수에 biofilm 형성의 시각화에 대 한 고정된 속도 층 흐름과 일정 한 온도에 노출 되 면 단일 셀 수준에 실시간으로. 그것은 야생 형 및 돌연변이 체 긴장에 biofilms의 개발 연구에 강력한 수단을 제공 하 고 생리 조건 모방 조건 하에서 biofilms에 항균 성 에이전트 처리의 효과 임상 설정에서 관찰. 대부분 체 외에서 biofilm 분석 실험와 달리이 메서드는 실시간으로 개발 biofilm의 시험에 대 한 수 있습니다 그것은 형성 하는으로.
24 샘플까지 될 수 있는 동시에 biofilm 형성 평가 실행 높은 처리 방식으로이 메서드를 사용할 수 있습니다. 메서드는 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하기 위해 돌연변이 라이브러리의 유전 스크린을 사용할 수 있습니다 하 고 화합물 라이브러리 화면에 대 한 관심의 항균 성 화합물의 biofilms에 대 한 유효성을 평가 ...

그러나 그것은 또한는 기회 주의 병원 체, 표면 하 고 심한 곰 팡이 감염1,2를 일으키는 능력이 candida albicans 인간의 microbiota의 공생 회원입니다. C. albicans 의 주요 독성 특성 양식 복구 하는 기능 이며, 약물 내성 biofilms, 세포의 표면에 준수 고 기질 소재1,3에. C. albicans biofilms는 고도로 구조화, 포함 하는 여러 종류의 세포 여러 레이어 (신진 효 모-양식 라운드 셀, 타원형 pseudohyphal 셀 및 관 hyphal 셀)4. C. albicans biofilm 개발 표면에,이 세포의 확산에 의해 따라 (에서 biofilm 시드), 표면에 둥근 효 모 형태의 세포의 부착으로 시작 하 고 다음 미 숙 biofilm의 성숙으로 구조를 완벽 하 게 형성 된 biofilm 기질 소재4에 의해 둘러싸여. 성숙한 biofilm biofilm4건축 안정성을 제공 밀도 연결 네트워크를 형성 하는 길쭉한 hyphal 세포 주로 구성 됩니다. Biofilm 라이프 사이클에 걸쳐 신진 효 모 라운드 세포 성숙 biofilm에서 분산 하 고 전파 감염 시키거나 다른 사이트4,5에서 새로운 biofilms 씨앗 몸의 다른 지역에 여행 수 있습니다. C. albicans 는 biotic 표면, 점 막 표면에와 같은 및 호스트 조직, 전체에 카 테 터, 심장, 틀니, 인공 관절 등의 비 생물 적인 표면에 biofilms를 형성할 수 있다. Biofilms의 고집 불통 속성으로 인해 그들은 매우 어려운 근절, 그리고 많은 경우에서 유일 하 게 효과적인 치료 전략은 감염 된 장치4의 제거. 따라서 조사 임상 설정에서 관찰 된 것과 유사한 조건 하에서 biofilm 형성에 결정적 이다.
몇 가지 중요 한 vivo에서 동물 모델이 C. albicans biofilm 형성6,,78; 공부 하는 데 사용 그러나, 이러한 연구 비용, 시간이 소요 될 수 있으며 긴장 및 한 번에 테스트할 수 있는 항균 성 대리인의 수에 의해 제한 됩니다. 생체 외에서 biofilm 분석 실험, 다른 한편으로, 항진균 성 화합물 및 돌연변이 체 긴장의 급속 한, 높은 처리량 평가 대 한 허용 하 고 훨씬 더 비용 효율적이 고 윤리적인 biofilm 분석 실시 보다는 동물에서 모델9, 10,,1112,,1314. 여기는 생체 외에서 분석 결과 우리가 개발 하 고 사용자 지정 가능한 미세 장치14,15를 사용 하 여 층 류에서 일시적으로 biofilm 형성을 관찰 하도록 최적화에 대해 설명 합니다. 분석 결과 시각화 biofilm 형성, 초기 부착 단계, 세포 증식, biofilm 성숙, 세포 분산 등의 각 단계에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 시각화는 biofilm의 개발을 통해 세포 형태학 변화에도 유용 합니다.
일반적으로 체 외에서 biofilm 분석 실험, 높은 처리량을 동안에 대 한 활용 결정 접시 제어 흐름 조건에 대 한 허용 하지 않습니다. 전통적인 층 흐름 전지 시스템 제어 흐름 조건에서 biofilm 형성의 지속적인 평가 대 한 허용 하지만 이러한 시간이 소요를 설정 하 고 동적 범위 컨트롤 및 처리량 제한 하는 경향이 많습니다. 여기 활용 미세 장치 내장 층 류 챔버와 높은 처리량 판 (48 웰 스 포함)를 결합 하 여 이러한 한계를 극복 하 고 매우 재현 하 고 다재 다능 한, 사용자 정의.
우리가 야생-타입 C. albicans 의 biofilm 형성 평가를 상업적으로 사용할 수 있는 자동화 미세 장치 사용에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기, 스트레인, biofilm, biofilm의 개발에 알려진 항진균 제의 효과 두 돌연변이 체 긴장 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ) 이전 biofilm를 보고 된에서 대형 생체 외에서 그리고 vivo에서16,,1718결함. Biofilm의 개발을 통해 biofilm 형성 억제에 항균 성 대리인의 효능을 테스트 하 고 돌연변이 라이브러리를 검사 하 여 정상적인 biofilm 개발에 필요한 유전자를 식별 하는 설명된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BioFlux 1000z</td><td>Fluxion</td><td></td><td>라이브 셀 분석을위한 자동 미세 유체 장치</td></tr><tr><td>48 웰 플레이트 0-20 dyne</td><td>Fluxion</td><td>910-0047</td><td>미세 유체 플레이트</td></tr><tr><td>몽타주 소프트웨어</td><td>Fluxion</td><td>버전 7.8.4.0</td><td>시각화 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>효모 추출물</td><td>Criterion</td><td>C7341</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>포도당(D-글루코스)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>시그마-알드리치</td><td>R6504</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>영양소 국물</td><td>기준</td><td>C6471</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-Mannitol</td><td>BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>기준</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>멸균 접종 루프</td><td>VWR</td><td>30002-094</td><td></td></tr><tr><td>투명 뚜껑이 있는 페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>일회용 큐벳</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 종이</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 및 큐벳 분광 광도계</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>M12820004</td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 biofilm 형성의 시각화

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans 인간의 병원 획득 패 혈 증 경우의 약 15%를 일으키는 가장 일반적인 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans 의 주요 독성 특성은 그것의 양식 biofilms 능력, biotic 및 abiotic 표면에 연결 된 세포의 구조적된 커뮤니티. C. albicans biofilms 호스트 조직, 점 막 층, 같은 카 테 터, 심장, 의치, 공동 prostheses 등 의료 기기에 형성할 수 있다. 그들은 물리적, 화학적 물결에 높게 저항 하기 때문에 씨앗에 저수지 전파 감염으로 작동할 수 있다 Biofilms 중요 한 임상 도전 포즈. 분석 실험 체 외에 다양 한 C. albicans biofilm 형성, 결정 플레이트 분석 실험, 건조 중량 측정, 세포 생존 능력 분석 실험, confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 등 공부를 이용 되어 있다. 이 분석 실험의 모두 단일 끝점 분석 실험, biofilm 형성 특정 시간에 평가 됩니다. 여기, 우리 층 흐름 조건 하에서 자동된 미세 장치를 사용 하 여 실시간에 biofilm 형성 연구 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 biofilm 혈관 카 테 터에서 발생 하는 등 호스트의 모방 하는 사용자 지정 조건을 사용 하 여 시간이 지남에 개발로 biofilm 형성의 관찰에 대 한 수 있습니다. 유전 돌연변이의 biofilm 결함 뿐만 아니라 실시간으로 biofilm 개발에 항균 성 대리인의 억제 효과 평가 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

우리 수행 미세 biofilm 분석 결과 설명 여기 야생-타입을 사용 하 여 두 미디어 조건 (RPMI 1640 그리고 거미 미디어) C. albicans 스트레인, 알려진된 항진균 약물 RPMI, 암포 B (16 µ g/mL)의 야생-타입 스트레인 그리고 2 개의 돌연변이 체 긴장 이전 거미 미디어에 biofilm 형성 (bcr1Δ/Δ와 efg1 Δ/Δ)에서 결함을 보고.
비디오 1 RPMI 1640 매체에 biofilm 형성에 항진균 약물, 암포 B의 효과 야생-타입 biofilm의 개발을 보여 줍니다. 야생-타입 조건 하에서 여러 셀으로 강하게 준수, 셀 형성 시간 진행 되는 동안, 균 고 두꺼운 biofilm 균 intercalating으로 관찰 될 수 있다 효 모 세포. 미세 실험의 끝, 야생-타입 biof...

이 프로토콜에서는 호스트 생리 적 조건 하에서 Candida albicans 에 biofilm 형성을 시각화 하는 사용자 지정 가능한 자동화 된 미세 장치를 사용 하 여를 설명 합니다.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 숙주의 생리학적 조건에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 생물막 형성을 실시간으로 시각화하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 실시간으로 발생하는 생물막 형성을 관찰할 수 있으며 항균제의 효과를 테스트하거나 유전적 돌연변이를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 높은 처리량 방식으로 생물막에 대한 활성에 대한 잠재적인 치료제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 그 효과를 측정, 시각화 및 현재 치료와 비교할 수 있습니다.이 기술의 주요 이점은 연구자에게 관심사의 몇몇 다른 조건 하에서 biofilm 대형을 분석하기 위하여 이용될 수 있다 입니다. 이 방법은 칸디다 알비칸스 생물막 형성을 연구하기 위해 특별히 개발되었지만 박테리아뿐만 아니라 다른 곰팡이 종을 포함한 다른 생물막 형성 미생물에도 적용할 수 있습니다. 먼저 표준 미생물 관행에 따라 효모 추출물 펩톤 포도당 또는 YPD 배지 한천에 도금 된 세포에서 다양한 C.albicans 균주의 단일 콜로니 배양을 준비합니다.다음으로, 컨트롤러, 두 개의 전원 공급 장치, 현미경, 카메라 및 시스템에 연결된 컴퓨터를 포함하는 미세유체 시스템을 켭니다. 컴퓨터가 로드되면 시스템을 제어하는 소프트웨어를 엽니다. 사용 중인 플레이트의 바코드 번호를 찾아 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 번호를 입력합니다.그런 다음 제어 모듈에서 미세유체 시스템 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 그런 다음 입구 웰 I1, I7, I13 및 I19를 클릭하고 인터페이스 플레이트 튜브를 통해 멸균 공기를 5분 동안 흐르게 하여 응결을 제거합니다. 모든 응축이 증발하면 48웰 0-20 다인 미세유체 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다.12시간 생물막 형성 실험의 경우 먼저 600마이크로리터의 예열된 매체를 주입정에 추가합니다. 48웰 미세유체 플레이트 위에 있는 청소된 인터페이스 플레이트를 천천히 내립니다. 그런 다음 튜브가 입구 및 출구 웰 상단에 배치되고 제자리에 고정될 때까지 인터페이스 플레이트를 약간 왼쪽으로 밉니다.소프트웨어의 전단 제어 섹션에서 흐름 모드를 상수로 설정하고 최대 전단을 센티미터당 1다인 제곱으로 설정합니다. 그런 다음 매체가 있는 주입구를 클릭하여 채널을 프라이밍하기 위해 주입구에서 배출구 우물로의 매체 흐름을 시작합니다. 5분 동안 흐른 후 소프트웨어의 웰 플레이트 제어 섹션에서 중지 버튼을 클릭합니다.그런 다음

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을...

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

우리의 3 차원 나노 biofilms 구성된 고밀도 microarray 플랫폼을...

높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

이 비디오는 현미경을 사용하여 곰팡이 균사에서 박테리아 생물막을 성장시키고 정성적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 박테리아 생물막은 곰팡이 표면에 자주 형성되며 대사 협력, 경쟁 또는 포식과 같은 수많은 박테리아-곰팡이 상호 작용 과정을 포함합니다.

진균균사에서 박테리아를 형성하는 생물막을 시각화하기 위한 시료 전처리 방법

다공성 매체를 모방한 미세유체 장치에서 생물막 형성 연구를 위한 프로토콜에 대해 논의합니다. microfluidic 장치는 마이크로 기둥의 배열로 이루어져 있고 이 장치에 있는 Pseudomonas fluorescens에 의하여 biofilm 대형은 조사됩니다.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

칸디다 알비칸스 생물막의 내부 특징을 보고 정량화하기 위해 굴절률 매칭을 통해 명확히 된 고정 된 손상되지 않은 표본을 준비합니다. 이어서, 광학 단면 현미경 검사법은 생물막의 전체 두께를 가하지만 3차원 이미지 데이터를 얻기 위하여 이용될 수 있다.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

학습하세요 Candida albicans 바이오필름 형성을 자동 미세유체 장치를 사용하여 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 항균제 효능 테스트와 유전자 돌연변이체 평가에 활용됩니다.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

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