바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

이 실험 설정의 전반적인 목표는 RNA 및 DNA 조절의 주요 층을 설명하여 자극 또는 치료에 대한 반응으로 발생하는 주요 분자 메커니즘을 밝히는 것입니다. 이 방법은 일반적인 면역 반응뿐만 아니라 약물 치료에 대한 분자 반응과 같은 다양한 생물학적 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 시간이 지남에 따라 여러 층의 유전자 조절을 동시에 표시할 수 있다는 것입니다.

따라서 각 방법에 대해 동일한 셀 풀을 사용하는 것이 중요합니다. 대체로 이 세 가지 프로토콜은 먼저 관심 세포를 서로 다른 시점으로 조작하는 것을 포함합니다. 각 조작 후 세포는 풀링되고 각 분석에 대해 하나씩 세 개의 그룹으로 나뉩니다.

비디오의 이 섹션에서는 4sU 라벨링을 사용하여 가장 최근에 생성된 전사체의 라벨링 및 정제에 대해 설명합니다. 각 프로토콜은 궁극적으로 염기서열분석(sequencing)에 바로 사용할 수 있는 샘플을 생성합니다. 먼저, 관심 세포주에 필요한 4sU 농도와 배양 시간을 조회합니다.

예를 들어, 200마이크로몰 4sU를 T 세포에 1시간 동안 사용합니다. 처리 후 세포 풀을 각 방법과 시점에 대해 하나의 별도 접시로 분리합니다. 그런 다음 필요한 수의 4sU 부분 표본을 완전히 해동하고 4sU를 세포 배지에 직접 첨가하고 지시에 따라 배양물을 배양합니다.

다음으로, 폴리프로필렌 튜브에서 4sU 표지 세포를 수집합니다. 그런 다음 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 TRIzol에 밀리리터당 약 300만 개의 세포로 재현탁시키고 TRIzol의 세포를 실온에서 5분 동안 배양합니다.

이제 Radle과 회사의 방법을 사용하여 30-80 마이크로 그램의 RNA를 준비하십시오. 다음으로, 티올 특이적 비오틴화 반응을 이 순서로 혼합합니다. 뉴클레아제가 없는 물, 10배 완충액, RNA, 마지막으로 비오틴-HPDP로 시작합니다.

그런 다음 피펫팅과 혼합하여 배양합니다. 정제 단계를 진행하여 표지되지 않은 기존 RNA와 혼합된 새로 전사된 비오틴화된 RNA의 샘플을 생성합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열합니다.

그런 다음 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오. 각 샘플이 냉각되면 100마이크로리터의 스트렙타비딘 비드를 추가하고 실온에서 15분 동안 회전하면서 배양합니다. 이제 마그네틱 컬럼을 사용하여 새로 전사된 RNA로 장식된 비드를 분리한 다음 염기서열분석을 위해 11마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 RNA를 용리합니다.

이 섹션에서는 활발하게 번역되고 있는 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 전사체를 염기서열분석하면 동적 트랜스라토솜을 조사할 수 있습니다. RNA 염기서열분석 데이터와 결합된 이 분석을 통해 RNA 회전율 및 번역 속도를 계산할 수 있습니다.

현탁액에 cycloheximide를 추가하고 반전을 사용하여 혼합하는 것으로 시작합니다. 실온에서 1분 후 세포를 원심분리하고 배지를 제거한 다음 시클로헥시미드가 보충된 최소 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 다음으로, 배지를 흡인하고 1,000만 개의 세포당 100마이크로리터의 포유류 세포 용해 완충액으로 교체합니다.

20-25 게이지 바늘을 사용하여 세포를 용해하기 위해 혼합물을 분쇄합니다. 그런 다음 세포 용해물을 예냉각된 1.50ml 튜브로 옮기고 주기적인 반전으로 얼음에서 10분 동안 용해물을 배양합니다. 10분 후 용해액을 원심분리하고 상층액을 시원한 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 뉴클레아제가 없는 물에 용해물을 1-10 희석하여 준비하고 260나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 희석되지 않은 용해물의 200마이크로리터 분취액을 생성하고 각 흡광도 단위에 대해 7.5 단위의 뉴클레아제로 각각 처리합니다. 뉴클레아제가 45분 동안 반응하도록 한 다음 15마이크로리터의 RNase 억제제를 사용하여 반응을 종료하거나 섭씨 음의 80도에서 보관합니다.

그런 다음 상용 키트를 사용하여 RPF RNA를 정제하고 키트를 사용하여 rRNA 고갈을 수행합니다. 다음으로, 500나노그램의 분리된 RPF RNA에 대해 PAGE 정제를 수행합니다. 샘플을 젤에 적재할 준비를 한 후 섭씨 95도에서 5분 배양으로 샘플을 변성시키고 대조군을 변성시킵니다.

그런 다음 약 75분 동안 180볼트에서 샘플을 실행하고 결과를 평가합니다. 젤 슬라이스 수집의 경우 멸균 20게이지 바늘을 사용하여 0.5ml 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 28 내지 30 염기 뉴클레오티드 영역에 해당하는 겔 슬라이스를 절제하고, 이를 준비된 0.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.

RNA 대조군의 샘플과 음성 대조군의 샘플을 포함하여 오염을 확인합니다. 다음으로, 뚜껑이 있는 작은 샘플 튜브를 더 큰 마이크로 원심분리기 튜브에 로드합니다. 그런 다음 어셈블리를 원심 분리하여 겔을 파쇄하고 샘플을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 물, 아세트산암모늄 및 SDS를 샘플 튜브에 첨가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 반응하여 RNA를 용리시킵니다. 그런 다음 상용 키트를 사용하여 작은 RNA에서 cDNA 라이브러리를 만들고 cDNA 라이브러리의 염기서열분석을 진행합니다. ChIP-seq는 게놈 전체에 걸쳐 관심 있는 전사 인자의 결합을 매핑하는 데 사용됩니다.

리보솜 프로파일링 및 모든 새로운 전사체 조사의 데이터와 결합된 ChIP-seq는 전사 인자 결합의 실제 영향을 보여줍니다. 먼저 포름알데히드를 사용하여 세포 샘플을 최종 농도 1%로 가교하고 실온에서 부드럽게 흔들면서 10분 후 글리신 농도를 0.125 어금니로 올려 반응을 중지합니다. 그런 다음 세포를 모아 얼음처럼 차가운 PBS로 세 번 씻고 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.

그 후, 갓 첨가한 프로테아제 억제제가 함유된 1ml의 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시키고 10분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다. 10분 후, 세포를 스핀다운하고 상층액을 흡인하며 용해 완충액 추가 및 배양을 반복합니다. 다음으로, 초음파 처리를 사용하여 200에서 1, 000 염기쌍 사이의 전단 염색질을 생성합니다.

그런 다음 염색질을 항체로 코팅된 마그네틱 비드에 연결하고 단백질-DNA 복합체를 50마이크로리터의 용리 완충액에 용리시킵니다. 다음으로, 5마이크로리터의 40%RNase와 용리 완충액을 첨가하고 샘플을 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플에 proteinase K 1단위와 글리코겐 20마이크로그램을 추가하고 2시간 동안 배양합니다.

다음으로, 샘플을 밤새 섭씨 65도로 옮겨 역방향 교차 결합시킵니다. 다음날, 샘플을 자석에 최소 30초 동안 놓고 관심 DNA가 포함된 상등액을 수집합니다. 그런 다음 DNA를 정제하고 검증을 위해 정량적 PCR을 사용하고 DNA를 시퀀싱합니다.

4sU-라벨링은 세포에 스트레스를 주고 세포사멸을 유발할 수 있습니다. Annexin V 및 7-AAD 염색을 사용하여 세포사멸 및 사멸 세포를 식별했습니다. 30분 또는 60분 처리를 사용하여 Th1 세포를 4sU로 표지한 후 세포가 죽거나 세포사멸을 겪지 않았습니다.

RNA를 처리할 때 매우 중요하기 때문에 표준 분석을 사용하여 염기서열분석 전에 RNA의 무결성을 항상 확인했습니다. 증폭된 라이브러리는 건강한 범위의 뉴클레오티드를 가지고 있었습니다. 과도한 어댑터 이량체는 PAGE에 의한 추가 정제가 필요했습니다.

너무 많은 템플렛 또는 너무 많은 주기는 무거운 뉴클레오티드, 번진 제품 및 접합기 이량체 제품 귀착됩니다 염색질 전단은 전단된 염색질의 주요 부분이 약 1, 000의 염기쌍 또는 경미하게 더 적은일 때 제일 작동하는 것을 찾아냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 염색질 면역침전 염기서열분석에 대한 항체의 적용 가능성을 테스트했습니다. negative control primer는 관심 세포에서 발현되지 않는 유전자를 위한 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 4sU를 추가할 시기와 각 방법에 대한 세포 수확 시기에 대한 일정을 포함하여 실험 설정에 대한 자세한 계획을 세우는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 4sU가 세포 생존율 및 스트레스 반응에 미치는 영향을 사전에 테스트하여 최적의 4sU 라벨링 조건을 항상 검증합니다. 요약하면, 이 접근 방식을 사용하면 세포 활성화 과정에서 발생할 수 있는 모든 유전자 조절 이벤트를 시각화할 수 있습니다.

이 방법은 또한 1차 면역 세포와 자극 또는 약물에 대한 반응에 활용될 수 있습니다.