Name: 바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 학습하세요 ChIP-seq, 4sU-seq, 리보솜 프로파일링을 활용한 세포 활성화 중 전사인자 결합, RNA 전사, 번역 및 회전율의 실시간 다층 분석 방법을 통해 유전자 조절 메커니즘을 규명하는 통합 기술입니다.

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우리는 4sU 라벨 기본 T 세포;에 대 한 설정에 대 한 조언 라스 Dölken 감사 합니다. 엘리자베스 그라프와 토마스 Schwarzmayr에 대 한 중요 한 도움 라이브러리 세대와 시퀀싱; RNAPII 및 T 세포 항 체;를 제공 하기 위한 Eick와 앤드류 Flatley 더크 명. Henriette Uhlenhaut와 프란체스카 Greulich 칩 seq;에 대 한 라이브러리 준비에 대 한 도움 캐롤라인 C. 프리 델 FR2938/7-1 하 고 CRC 1123 (Z2)에서 도이치 가운데 (DFG); 교부 금에 의해 지원 되었다 Elke Glasmacher 부여 GL 870/1-1 독일 가운데 (DFG) 독일 센터에서 대 한 당뇨병 연구 (DZD), 헬름홀츠 Zentrum 뮌헨에 의해 지원 되었다.

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<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

유전자 규칙의 전체 과정을 분석 하는 것은 완전히 특정 자극 또는 치료에 대 한 응답에 세포질 적응을 이해 하는 데 필요한입니다. 총 RNA-seq 결합, 4sU-seq, 프로 파일링, 리보솜 그리고 다른 시간 지점에서 칩 seq 시간 유전자 규칙의 주요 프로세스에 대 한 포괄적인 분석을 지도 한다. 생물 학적 과정의 깊은 이해는 실험 설정으로 최적의 시간 포인트 정의 필요 합니다.
유전자 규칙을 공부 하는 방법을 빠르게 개선, 이후 이러한 프로토콜의 급속 한 변화에 적용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그들은 모든 종류의 셀에 기본 유전자 규제 메커니즘을 공부에 대 한 가장 중요 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리가 논의 일부 함정 사실 하나는이 메서드를 사용할 때 고려해 야 하.
셀: 셀 매우 실용적 이어야 하 고, 순도 세포 인구의 기본 격리 된 셀을 사용 하는 경우 (예를 들어, 기본 T 세포에 대 한 FACS 분석) 보장 되어야 한다. 조금 이라도 스트레스 세포 수 있습니다이 매우 민감한 시퀀싱 방법의 결과 영향을 미칠 및 새로 베낀 또는 번역 된 RNA의 양을 줄이는 고 시퀀싱 결과에 스트레스 반응의 원치 않는 정보. 작은 셀을이 프로토콜에 언급 된 원심 분리 속도 기본 T 세포에 최적화 되어 있습니다. 따라서, 셀 형식에 따라 속도 조정 합니다.
4 세포 생리학에 수 효과: 4sU 추가 시 세포질 생리학을 최소한의 섭 동을 확인 하기 위한 전술 옵션 외에 추가 및 추가 분석 수행할 수 있습니다, 셀 수는 제한 하는 경우에 특히. 세포 증식에 영향을 단순히 레이블 및 레이블 셀을 계산 하 여 셀의 2 배 시간을 확인 하 여 테스트할 수 있습니다. Nucleolar 스트레스 유도 수 또한 nucleolin와 핵의 면역 형광 염색을 통해 셀 형태를 분석 하 여 테스트할 수 있습니다. 추가로 4sU의 영향을 확인, 변경 된 글로벌 유전자 발현 레이블이 없는 총 RNA를 레이블이 총 RNA에서 카운트를 읽는 연관 하 여 측정 될 수 있는.
휴대폰 번호: T 세포에서 생체 외에서 생성 된 표 2에 표시 된 셀의 금액 이상으로 시작 하는 것이 좋습니다. 셀 유형 방법 당 충분 한 숫자를 선택 합니다. 이후 T 세포 적은 세포질 RNA를 다른 세포에 비해, 다른 셀의 가장 가능성이 낮은 금액 적절 한 될 것입니다. 칩 seq에 대 한 셀 숫자 매우 사용 하는 항 체 및 세포 내에 관심사의 단백질의 표현 수준에 따라 다릅니다. 히스톤, RNAPII 칩에 대 한 fewe 셀 사용할 수 있습니다, 반면 셀 숫자 증가 녹음 방송 요인 사용 됩니다 때, 그들은 낮은 수준에서 표현 하는 경우에 특히 필요.
4 수 라벨 및 RNA biotinylation: 부착 세포를 사용할 때 4sU 라벨 감독이 할 수 Rädle 외에 설명 된 대로. 19 셀 매우 빠르게 통합 4sU, 이후 그것은 추가할 수 있습니다 서 스 펜 션, 부착, 또는 반 부착 세포의 매체에 직접.
RNA의 60-80 µ g는 biotinylation 시작 하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 낮은 양의 RNA 사용할 수 있는, 우리가 30 미만 테스트 하지 않았다 비록 µ g. 추가 (예:GlycoBlue)에 coprecipitant 때 펠 릿은 보기 힘들 경우 RNA를 계기. 더 피 외. 그 methylthiosulfonate 활성화 비오 틴 (biotin MTS) HPDP-biotin31보다 4sU 표시 된 RNA와 보다 효율적으로 반응 또한 나타났습니다. 따라서, 그것은 하는 경향이 (더 피 외.; 참조 4sU 표시 된 RNA의 정화에 의해 언급 하는 biotinylation 프로토콜을 참조 하십시오 적은 uridine 잔류물, 작은 RNAs의 복구에 대 한 특히, MTS-biotin, 전환 고려 가치가 있을 수도 있습니다. 실험 절차)입니다.
새로 베 껴 진된 RNA의 복구, 상자성 구슬 또는 당신의 선택의 RNA 정리 구슬 사용 가능 하다. 항상 고려이 키트 또는 특정 RNAs에 대 한 정화 하지 않을 수 있습니다. 예를 들어 당신이 miRNAs에 관심이 있다면, 미르 캡처 및 시퀀싱에 대 한 특정 키트를 사용 하십시오.
새로 베 껴 진된 RNA의 정량화: 새로 베 껴 진된 RNA는 정확 하 게 계량, 측정은 적당 한 fluorometer에 의해 수행 되어야 합니다 ( 재료의 표참조). 4sU 노출의 1 시간, 내 새로 베 껴 진된 RNA 총 RNA의 약 1-4%를 나타냅니다. 1 h 표시의 새로 베 껴 진된 RNA, 활성화 된 T 세포의 rRNA11~ 90-94% 이루어져 있다.
리보솜 프로 파일링: 방법 때, 우리는 적절 한 소화를 보장 보다 원래 프로토콜에 제안 된 nuclease 금액 x 1.5를 사용 하 여 결정. 또한, 아무 부작용 높은 양의 nuclease에 대 한 보고 되었습니다. 꽤 어려운 ribosomal 단백질에 의해 구속 하는 RNA의 일부인 동안에 RPFs를 overdigest 때문에, 최적의 nuclease 소화 적정 금액을 여전히 약간 높일 수 있습니다.
만약 500 ng RPF RNA의 단계 4.4.2에서에서 재기 되었다, rRNA 고갈 및 수영장 정화 RPFs RNA 클린 & 집중-5 열 반복. 또는 젤 (4.5.6 단계)에서 RNA 차입 중 젤 (4.5.3 단계)에 서로와 수영장 젤 조각 2 개의 동일한 샘플을 로드 합니다.
가능한 한 단단히 28 및 30 nt 밴드에는 RPFs 젤에 절단 하는 것이 좋습니다. 이 rRNAs를 tRNAs는 나중에 라이브러리의 일부가 되 고 당신의 RPFs에 대 한 시퀀싱 읽기를 줄일 것입니다 원치 않는 파편을 제거에 도움이 됩니다.
그것은 또한 UV 젤 정화 동안 빛을 피하기 위해 권장 됩니다. 닉스는 RNA 조각으로 pyrimidine 이합체, 그 끝에 심하게 라이브러리 준비 및 시퀀싱 결과 영향을 미칠 수 있습니다 만들 수 있습니다이.
라이브러리 준비 및 데이터의 연속: 프로토콜을 프로 파일링 하는 리보솜 시퀀싱에 대 한 적합 한 cDNA 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 샘플 4sU 라벨에 의해 생성 된 모든 적절 한 RNA 시퀀싱 키트 라이브러리 준비를 위해 직접 사용할 수 있습니다. 이후 새로 베 껴 진된 RNA, 특히 때 짧은 사용 시간, 라벨 수 있습니다 아직 polyadenylated, 아니 폴 리 A 선택 수행 되어야 한다. 대신, 우리는 좋습니다 rRNA 고갈 방지 하기 위해 실제 샘플에 대 한 시퀀싱 깊이 감소. T 세포를 사용 하 여, 우리는 400 수행 (키트, 참조 자료), 따라 새로 베 껴 진 고 총 RNA의 ng rRNA 고갈 시작 하 고 PCR 바이어스를 최소화 하기 위해 PCR 확대 주기를 감소. 라이브러리 준비는 더 적은 시작 물자로 수행할 수 있습니다. PCR의 라이브러리 복잡 한 숫자에 대 한 계정에 최적화 되어야 합니다.
칩 seq에 또한 있다 많은 키트 라이브러리 준비에 사용할 수 있는. 우리 손으로 도서관에서 준비 일 잘 2 시작 칩 DNA의 ng (사용 하는 키트에 대 한 제안에 대 한 자료 참조). 시퀀싱 하는 동안 색상 균형에 대 한 인덱스를 확인 해야 합니다. 4sU-seq, 총 RNA-seq, 및 칩 seq 샘플, 각 106 읽기 x ≥40 x 106 읽기 리보솜 샘플 프로 파일링에 대 한 ≥80의 시퀀싱 깊이 좋습니다. 시퀀싱 깊이 샘플 및 다운스트림 생물 정보학 분석에 의존 하 고 신중 하 게 고려해 야 합니다. Cotranscriptional 접합, 100 intronic 읽기를 분석 하 bp 쌍-엔드 시퀀싱 선택 될 필요가 있다.
바이어스 시퀀싱: 전사, 번역, 또는 녹음 방송 요인 바인딩 글로벌 변화를 결정할 때 시퀀싱 금 되고있다. 최근 몇 년 동안, 내 기존의 방법 그들의 한계를 밀어 했다 또는 새로운 기술을 점점 시작의 소량 RNA 시퀀싱을 위해 개발 되었다. 잡음 또는 편견을 소개 하는 cDNA 증폭을 해야 합니다. 최근, 독특한 분자 식별자 (Umi) 실험적으로 PCR에 의해 도입 된 중복을 식별 하기 위해 개발 되었다. 최근, Umi를 그냥 약간 전원 시퀀싱 및 차동 진 식32거짓 검색 속도 개선 보였다. 그럼에도 불구 하 고, RNA의 낮은 금액으로 시작 하는 때에 특히 그리고 많은 PCR 주기 필요한 모든 시퀀싱 라이브러리 라이브러리 복잡성에 대 한 제어를 위한 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하 여 고려 하십시오.
버퍼 및 재고 솔루션: 4sU-seq와 리보솜 프로 파일링에 대 한 모든 버퍼 nuclease 무료 물을 사용 하 여 엄격한 RNase 없는 조건 하에서 준비 되어야 한다. 미리 만든된 nuclease 무료 NaCl, Tris HCl, EDTA, 나트륨 구 연산 염과 물 구입 하는 것이 좋습니다. Nuclease 무료 조건을 보장 하기 위해, 펫 또는 표면 청소 RNase 오염을 솔루션을 사용할 수 있습니다. 칩 seq에 대 한 모든 버퍼 해야 적어도 DNase 무료 실내 온도에 저장 될 수 있다. 항상 protease 억제제와, 필요에 따라 사용 하기 바로 전에 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 하 고 얼음에 계속.
생물 정보학: (즉, 칩 seq, RNA-seq, 및 ribsosome 프로 파일링) 모든 시퀀싱 데이터 분석의 품질 관리를 포함 (예를 들어, FastQC를 사용 하 여 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), 어댑터 트리밍 (예를 들어, 함께 cutadapt20) 다음에 매핑 참조 게놈 연구에서 셀에 대 한. (총 및 4sU-seq), RNA-seq 데이터 뿐만 아니라 데이터를 프로 파일링 하는 리보솜, 접합된 RNA-seq 매퍼는 ContextMap 221등 필요 합니다. 칩 seq unspliced 데이터 정렬의 경우, BWA MEM22 를 사용 하 여 충분 하다. 유전자 발현은 유전자 프로그램, 예를 들면 featureCounts23을 사용 하 여 당 수를 읽고 확인 한 후 RPKM 모델 (Kilobase의 Exon 백만 조각 매핑 당 당 읽기)1을 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 하기 위한 피크 칩 seq 데이터, 프로그램의 수 있습니다, 예를 들어, 맥24 또는 보석25. 또한 다운스트림 분석 R26, 특히 Bioconductor 프로젝트27에서 제공 하는 도구를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
여기, 4sU 및 총 RNA 수준 및 리보솜 프로 파일링에서 변환 활동의 통합에 주요 도전은 정규화 이다. 이 문제를 해결 하기 위해 고전적인 방법은 집 유지 유전자의 수준에 정상화 하는 것입니다. 소음을 줄이기 위해 개별 집 유지 유전자에 대 한 임의의 변동으로 인해, 것이 좋습니다 아니라 더 큰 집합, 예를 들어 중간 수준 하지만 몇 집 유지 유전자를 사용 하는 > 3000 집 유지 유전자 아이젠 버그와 Levanon28에 의해 컴파일된 . 비율-에 4sU의 총 RNA, 정규화는 평균 매출 기반에서 RNA 이직 률의 계산에 대 한 요금 (예를 들어, 5 h의 RNA 반감기를 가정)29. 그러나,이 가정 집 유지 유전자에 대 한 전체 변경, 이후 좋습니다 정규화, 예, 상관 관계 기반 유전자의 그룹을 식별 하는 다른 데이터 형식의 시계열의 클러스터링의 독립적인 분석 방법을 사용 하 여 와 함께 전사 및 번역 활성화 중에 뚜렷한 동작입니다. 서로 다른 데이터 형식의 bioinformatical 통합에 대 한 자세한 설명에 대 한 우리는 원래 게시11를 참조 하십시오.
회전율 속도 데이터 통합의 분석: 최근에 출판 된 종이33 반감기 멀티플렉스 유전자 제어 (MGC)에 의해 결정 글로벌 방법 비교 반감기 (예를 들어, 다른 방법에 비해 대사 표기 방법으로 얻은 그 최고 상관을 보여줄 수 있는 일반의 금지 약물에 의해 전사)입니다. 그러나, 그것은 하프 라이프 계산 차이 발생할 수 있습니다 고 설명된 15,34되었습니다 언급 되어야 합니다. 우리는 대부분의 문제 및 장기 4sU 노출으로 인해 스트레스 반응에 의해 도입 된 차이점에 대 한 계정. 따라서, 4sU 라벨 도입 스트레스 응답을 제외에 없어서는 아니다. 이직 률을 추가 검증 하려면 MGCs 사용을 하는 것이 좋습니다.
또한, 데이터 집합으로 여기에 생성 된 더 통합 데이터 분석 (예를 들어, 긴 비 코딩 RNAs의 규칙)35,36또한 사용 될 수 있습니다.

최근 몇 년 동안, RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석 하는 셀 또는 유기 체1내 모든 표현된 RNAs를 표준 도구가 되고있다. 그러나, 특정 자극/약물에 대 한 응답에 적응 하는 셀의 전체 프로세스를 이해 하려면 그것은 완벽 하 게 처리, 회전율, 및 번역 mRNA 전사에서 배열 하는 모든 기본 프로세스를 결정 하는 데 필요한. RNA 녹음 방송에 있는 단기적인 변화 거의 측정 될 수 있다 총 RNAseq에 의해 총 RNA의 변화 요인 예: RNA 반감기 그리고 transcriptional 활동에 따라 달라 집니다 이후는 세포의 적응을 반영을 위한 빈약한 서식 파일 환경 효과2,3. 사실, 다양 한 새로운 시퀀싱 기법 개발 되었다 유전자 규칙4 오른쪽 방식으로 결합 하는 과정에서 다른 단계에 대 한 분석을 허용 하는. 이 프로토콜 비교 방식에서 mRNA의 필수 레이어 규제를 추적 하도록 하는 일부 오히려 쉽게 적용 가능한 시퀀싱 기법을 결합 하는 방법을 설명 합니다. Transcriptional 활동을 분석 하기 위한 다양 한 방법 설명 되었습니다, 모자-진 식 (케이지)5, 네이티브 신장 사본 시퀀싱 (NET-seq)6및 게놈 넓은 핵 실행 (GRO-seq)7 의 분석 등 , 8로 bromouridine-시퀀싱 (Bru-seq) 및 4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq), 대사 산물을 사용 하는에 새로 통합은 복사할 RNA9,10, 그냥 몇 가지 언급. 케이지 정확한 전사 시작 사이트 식별, NET-seq와 촉진제-seq 방향, 독서에 대 한 더 정확한 정보 제공 및 4sU-seq (이 방법은 여기에 설명 된) 감지만 새로 동안 RNA를 복사할 수 있습니다. 그러나, 4sU-seq 매우 민감한 이며 적극적으로 변화 하는 mRNA 처리 (분 이내 발생)는 양적 변화 뿐 아니라 셀에 양적 transcriptional 활동 측정에 서로 다른 시간 프레임에 적용할 수 있는9, 11,12. 또한, 4sU-seq RNA 유전자9에 대 한 이직 률을 계산 하는 RNA-seq와 결합 이상적입니다. MRNA의 전사를 실시 하 여 RNA 중 합 효소 II (RNAPII), 녹음 방송 요인, 히스톤 수정 및 일반적인 활성/repressors 수는 transcriptional의 일부가 될 같은 다양 한 요인에 의해 영향에 복잡 한. 테스트 하려면 얼마나 많은 유전자/발기인/증강 지역 한 요인에 의해 묶여있다, 칩 seq는 개발 되었습니다는 지금 많은 상용 항 체13인이 목적에 대 한 표준 방법입니다. 그러나, 비록 ChIPseq 어디 바인딩 요소 규제에 대 한 명확한 정보를 제공, 그것은 반영 하지 않습니다 그것은 실제로 전사14에서 변화를 리드 하는 경우. 따라서, 4sU-seq와 함께 수행 하는 칩 seq 같은 생물학 질문에 대 한 이상적인 조합 이다. MRNA와 단백질 수준에 반드시15,16, 변환 또는 닢에 잠재적으로 중대 한 규칙을 나타내는 연관 하지 않습니다 이후 유전자 발현의 규칙 또한 이후 단계에서 발생할 수 있습니다. 수준, 상황에 따라입니다. 2011 년에 리보솜 프로 파일링 먼저 RNA-seq 결합 되었습니다 했다 하 고 지금 있기 때문에 여전히 일부 감도 한계 질량 분석17단백질, 급속 하 게 발생 하는 변화를 계량 하는 선택의 방법입니다. 실제로, 그런 방법에서 얻은 번역 요금 보였다 변화 단백질 수준 (적어도 장기적인 변화에 대 한 측정)에 상대적으로 좋은 견적을 제공 하 고 번역, 예를 들면 의 과정에 더 상세한 보기를 허용 하는 시작-측면 및 대체 번역의 결정17프레임. 모든 4 개의 방법의 조합 사용 다양 한 세포 유형 사이 정상 상태에서 사용할 수 있습니다 또는 시간 직렬에서11빠르게 변화 하는 셀 실험. 이 사용의 녹음 방송 요인 바인딩 RNA 전사, 처리, 및 번역에 영향을 미치는 변화 게놈 넓은 개요를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>4sU-라벨링</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>멸균 H2O/PBS에 50 mM 재고를 준비하십시오; &ndash에 보관하십시오; 20&deg; 50-500 &마이크로의 분취량에서 C; l; 다시 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>1.5 ml 안전 잠금 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>옵션</td></tr><tr><td>1.5 ml 스크류 탑 폴리프로필렌 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td>와 호환 BD <td>Falcon</td><td>352096</td><td>Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml 스크류 탑 폴리프로필렌 튜브</td>와 호환 <td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml와 호환 가능 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>호환 가능 Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>이 상자성 구슬을 사용하는 것을 권장합니다. 분취 및 4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마 Aldirch</td><td>372978</td><td>경고 &ndash; 건강에 해로운</td></tr><tr><td>디메틸포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>뉴클레아제가 없는 H2O에서 100 mM DTT로 준비; 항상 신선한</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>50mg 비오틴-HPDP를 50ml DMF에 용해시켜 1mg/ml 원액을 준비합니다. 부드러운 온난화는 용해를 향상시킵니다. 4°C에 저장; C 1ml의 분취액. DMF는 일부 플라스틱 물질을 용해시킵니다. 유리 피펫을 사용하여 ist stock 유리병에서 50ml Falcon 튜브로 DMF를 옮기는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>원액</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 EDTA(500mM), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>원액</td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 H2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>W4502</td><td>원액</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>원액</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td></td><td>2302830 1.3.4 단계에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 15&nbsp; ml 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>또는 이와 동등한 것; 그들은 최대 15,000회까지 견뎌야 합니다; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis 시약 (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>이 시약이나 동등한 TRI 시약을 RNA 분리에 사용하십시오, 경고 &ndash; 부식성이 있고 건강에 해롭습니다! Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td>에 대한 즉각적인 접근 보장 <td>이 키트를 사용하여 1.4.11단계에서 RNA 수량을 정량화하십시오</td></tr>. <tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>선택 사항; 버퍼 RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>nuclease-free water를 사용하여 1.6 M stock solution 준비</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&마이크로; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>4&deg에 저장; C, &micro 포함; 1.4.6단계에서 사용된 Mac 열입니다. (RT에 보관)</td></tr><tr><td>세포 생존율 및 스트레스 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>선택</td></tr><tr><td>사항 Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>선택</td></tr><tr><td>사항 p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>선택</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>선택 사항</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>옵션</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU 세척 완충액</td><td></td><td>RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>에서 4°C에 보관; C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 뉴클레아제가없는 물에서 10 mM EDTA; 1 ml의 분취량을 만드십시오. 4°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>RNA 침전 완충액</td><td></td><td>은 RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate에 뉴클레아제가 없는 물에 저장합니다. 뉴클레아제가 없는 조건에서 미리 준비합니다. 50ml 팔콘 튜브에 넣어 실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기 기기</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>이 키트를 사용하여 1.3.10단계에서 RNA 무결성 검증</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>옵션</td></tr><tr><td>UV/VIS 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>또는 이와 동등합니다. 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 단계에서 사용</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>또는 13,000&nbsp에 도달할 수 있는 동등한 장비; &시간; &nbsp; g</td></tr><tr><td>고속 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td></td><td></td><td></td>용 어댑터</tr>, <tr><td>냉장 탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>또는 동급.</td></tr><tr><td>써모믹서</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>또는 동급.</td></tr><tr><td>자기 스탠드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>하나의 스탠드는 8 &micro를 수용합니다; Macs 열.</td></tr><tr><td>초미세 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>또는 동급.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>RNA 겔용; 또는 이와 동등한.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% 아가로스 프리캐스트 겔</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>RNA 겔용; 또는 이와 동등한.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>선택적</td></tr><tr><td>TruSeq 좌초 총 RNA 라이브러리 준비 키트</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>또는 동급. T 세포의 경우 PCR 증폭을 위해 400ng, 4sU 및 Total RNA를 11주기로 사용했습니다. 이 키트에는 rRNA 고갈이 포함되어</td></tr> 있습니다: <tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>은 Nanodrop 또는 이와 동등한 기기를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다</td></tr><tr><td>Ribosome Profiling</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ribo Profile kit(포유류 또는 효모)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116(효사)TruSeq</td><td></td></tr> <tr><td>Ribo Profile kit(포유류 또는 효모)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (포유류)</td><td></td></tr> <tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA 클린 & Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA 제거 키트(인간/마우스/쥐)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 또는 MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(고감도 DNA 키트)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>4sU-seq</td></tr><tr><td><strong에 이미 필요함>기타 모든 소모품 및 장비는 사용자 가이드에 나열되어 있습니다!!</td><td></td><td></td><td>사용 설명서를 주의 깊게 읽고 필요한 소모품을 미리 주문하십시오(예: 젤과 같은 일부 소모품의 경우 긴 배송 시간 고려)</td></tr><tr><td>ChIP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mM Tris-HCl(pH 8.0)</td><td>gereral lab 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>최종 농도 1 %</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td>를 추가하십시오 <td>항상 새로운</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab 공급 업체</td><td></td><td></td></tr>를 준비하십시오 <tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>우리는 이러한 상자성 비드를 사용하는 것이 좋습니다. 분취 및 4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>ChIP 라이브러리 준비 키트</td>: <td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>또는 원하는 DNA</td></tr><tr><td>저결합 마이크로 원심분리 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>4.3.1단계에서 단백질 G에 결합된 이 초상자성 비드를 사용하십시오. 사용 전 RT로 가져 오기</td></tr><tr><td>글리신</td><td>gereral 실험실 공급 업체</td><td></td><td>2M 원액 준비</td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>이 키트(또는 동급)를 사용하여 4.2.4단계에서 염색질을 정제합니다.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>buffer에 새로 넣고 얼음에 보관</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>buffer에 새로 넣고 얼음에 보관</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>이 키트를 사용하여 Qubit 형광측정기</td></tr><tr><td>RNASE, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자(약 100bp로 초음파 처리)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항체(가능한 경우 ChIP 등급)</td>에서 DNA 수량을 정량화할 수 있습니다.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>또는 관심</td><td></td><td></td><td></td> 항체</tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>0.5 % BSA 및 0.5 % Tween 20</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td>로 RT PBS에 저장<td>RT</td><td>5 mM 파이프[pH 8.0], 85 mM KCl 및 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP 버퍼</td><td></td>에 보관 <td></td><td>RT 0.01 % SDS에 보관; 1. 1% 트리톤 X-100; 1.2&nbsp; 엠엠 EDTA; 16.7&nbsp; mM 트리스-HCl, pH 8.1; 16.7&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr><td>용리 완충액</td><td></td><td>RT에서 최대 6 개월 저장</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl 및 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>핵 용해 완충액</td><td></td><td>RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA 및 1 % SDS</td></tr><tr><td>세척 완충액 I</td><td></td><td>RT</td><td>0.1 % SDS에 저장 ; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>세척 버퍼 II</td><td></td><td>RT</td><td>에 저장0.1% SDS; 1% 트리톤 X-100; 2&nbsp; 엠엠 EDTA; 20&nbsp; mM 트리스-HCL pH 8.1; 500개&nbsp; mM NaCl</td></tr><tr><td>세척 버퍼 III</td><td></td><td>RT</td><td>0.25&nbsp; 남 LiCl; 1% NP-40; 1&nbsp; 엠엠 EDTA; 10&nbsp; mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer 기기</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>전기 영동 분석에 이 기기를 사용합니다</td></tr>. <tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX 마이크로튜브 1.5ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>또는 초음파 처리 장치 전용 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor 초음파 처리 장치 또는 선택한</td><td></td><td></td> 초음파 처리 장치 <td>Bioruptor를 사용한 T 세포의 초음파 처리 : 20 - 25 사이클 (30 초 켜기, 500 &micro를 가진 2 개의 1.5 ml bioruptor 마이크로 튜브에서 30 초 끄기; l 각 튜브)</td></tr><tr><td>튜브</td><td></td><td></td><td></td>용 마그네틱 스탠드</tr><tr><td>써모믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아가로스 젤 전기영동</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>큐비트 형광계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>이 형광측정기를 사용하여 소량의 RNA/DNA를 정량화합니다</td></tr></tbody></table>.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

활성화, 세포 급속 하 게 그들의 기능 프로그램 변경 및, 따라서, 그들의 유전자 식 프로필. 유전자 발현에 거 대 한 변화, 예를 들어 중 발생 세포 분화, morphogenesis, 고 기능 자극 (예: 면역 세포의 활성화), 또는 로컬 환경에서 약물 및 기타 요인에 노출 후. 자극 및 세포 유형에 따라 이러한 변경 내용을 신속 하 고 유전자 규칙의 모든 수준에서 발생합니다. 자극/약물의 특정 유형에 응답 셀의 모든 분자 프로세스 표시 분자 생물학에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 여기, 우리는 유전자 규칙의 여러 층의 동시 분석을 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리를 비교 하 여, 특히, 녹음 방송 요인 바인딩 (Chromatin-immunoprecipitation-시퀀싱 (칩 seq)), 드 노 보 전사 (4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq)), mRNA 처리, 및 회전율으로 번역 (리보솜 프로 파일링). 이러한 메서드를 결합 하 여 작업의 상세 하 고 게놈 넓은 과정 표시 가능 하다.
새로 베 껴 진된 RNA 시퀀싱 특히 좋습니다 빠르게 적응 또는이 (업 또는 downregulated 인지 여부)에 관계 없이 4sU 노출 시간 동안 모든 유전자의 transcriptional 활동을 묘사 하는 때문에, 시스템, 변화를 분석할 때. 총 RNA-seq와 리보솜 프로 파일링의 조합 사용은 또한 RNA 회전율 및 번역 요금 계산 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 결과 Bioinformatic 분석 분석 및 데이터의 해석에 대 한 많은 의미에 대 한 수 있습니다. 생성 된 데이터는 또한 co-transcriptional 및 대체 접합, 그냥 몇 가지 가능한 결과 언급을 추적 있습니다.
결합된 방법은 여기에 설명 된 다른 모형 유기 체 또는 세포 유형, 1 차 셀을 포함 하 여 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 품질 컨트롤을 포함 하 여 사용 하 고, 각 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 잠재적인 문제 및 함정을 토론.

4 수 라벨: 최적의 확인 4 수 라벨 조건 (apoptosis, 핵 스트레스, 세포질 긴장), 시간, 및 농도: 4sU의 높은 수준의 생산 및 처리 rRNA의 억제 하 고 세포질로 핵 스트레스30유도 수 있습니다. 따라서, 관심사의 세포 apoptosis로 서 4sU을 이용한 스트레스 테스트 되어야 합니다. 서쪽 오 점 분석 시각화 p53 축적, 핵 스트레스를 나타내는 것이 좋습니다 세포질 스트레스와 형광 활성화 된 세포 apoptosis에 대 한 분석 (FACS) 정렬 표시 인-EIF2a 레벨을 증가. 높은 수준 및 4sU 또는 thapsigargin 또는 arsenite 같은 약물에 긴 노출 세포 스트레스를 유도 하기 위해 사용할 수 있습니다. Apoptosis 또는 세포 죽음을 유도, 세포 BH3I-1로 치료 했다 (500 ng / µ L) 또는 incubated 95 ° C (열 충격)에서 5 분. V/7-AAD 얼룩 annexin apoptotic (Annexin V)과 죽음 (7-AAD) 셀을 결정 하기 위해 사용 되었다. 500 µ M 4sU와 0.5 h에 대 한 기본 Th1 세포 생성 된 생체 외에서 의 라벨 (최종 농도) 또는 200 µ M 4sU와 함께 1 h도 유도 하는 세포 긴장의 표시도 apoptosis (그림 1)은 충분 한 4sU 설립 하지만 이어질.
RNA 라벨 시간 또한 단축 될 수 있다 (≤ 5 분) 이상에 비해 라벨 시간 시퀀스 intronic 짧은 증가를 리드. Co-transcriptional 접합 속도 시각화 하려면 4sU 라벨 시간 30 분 넘지 말아야 한다. 4sUlabeling에 대 한 자세한 내용은 Rädle 외를 참조 하십시오. 19
품질 관리: RNA 무결성은 매우 중요 때 RNA를 처리. 그것은 electrophoretical 분석에 의해 biotinylation 후 4sU 표시 된 RNA의 RNA 품질을 확인 하기 가장 편리한 ( 재료의 표참조). 총 RNA의 시퀀싱에 대 한 그것을 사용 하는 경우에 특히 단계 2.2.2에서 고립 된 RNA를 확인 하십시오. RNA 무결성 번호 (린) ≥8 추가 처리 (그림 3)에 대 한 RNA 무결성을 보장 해야 합니다.
Electrophoretical 분석은 또한 새로 베 껴 진된 RNA를 확인을 사용할 수 있습니다. 훨씬 덜 눈에 띄는 되 고 전형적인 rRNA 밴드와 함께 총 RNA에 비해 훨씬 덜 성숙 rRNAs 새로 베 껴 진된 RNA에 포함 되어 있음을 유의 하십시오.
리보솜 프로 파일링: cDNA 라이브러리의 PCR 증폭: cDNA 증폭 (단계 4.9.1) 좋은 시퀀싱 결과 보장 하기 위해 중요 한 단계입니다. Electrophoretical 분석에 의해 증폭 된 라이브러리를 분석 합니다. 증폭된 라이브러리의 좋은 샘플 보여줍니다 주위 피크 140-160 bp (그림 4A). 이합체 되어야 하는 어댑터의 과도 한 양의 피해 (그림 4B)와 제조 업체의 프로토콜 (PCR 제품의 정화 페이지)에 따라 페이지 정화 절차를 사용 하 여 이러한 샘플을 더 순화 될 한다. 너무 많은 템플릿 또는 너무 많은 PCR 주기 예상 보다 높은 분자량 밴드, 바탕색이 PCR 제품 및 어댑터 이합체 제품 (그림 4C)의 외관에 의해 특징-증폭 될 수 있습니다. 대부분의 샘플에 대 한 circularized cDNA의 1-5 µ L 및 확대를 위한 9 PCR 주기 올바른 PCR 제품의 충분 한 양의 얻을 것입니다 일반적으로.
칩: Chromatin 전단: 최적의 전단 조건 셀의 각 유형에 대 한 조정 될 필요가 있다. 사전에 전단 조건 (예를 들어, 사이클, 높은 또는 낮은 전력의 수)을 결정 합니다. 셀과 동일한 볼륨의 동일한 수를 사용 하 여 테스트 목적으로, 더 낮은 세포 밀도 전단 효율 증가 때문에. 이상-또는 아래-기울이기는 chromatin를 방지 하려고 합니다. 큰 chromatin 조각 극적으로 영향을 미칠 수 칩 결과 막힘, 여 고-전단 항 체에 의해 낮은 바인딩 효율성에 지도 하는 관심사의 단백질에 epitopes를 파괴할 수 있다. 이 실험에서 전단된 chromatin의 주요 분수 주위 1000 때 최상의 결과 달성 했다 혈압 또는 약간 낮은 (그림 5A).
정량 하 여 칩 확인: 시작 하기 전에 칩, 그것은 사용 된 항 체는 칩에 적합 테스트 하는 것이 좋습니다 (만약에 가능 하다 면, 칩 학년 항 체 사용) 칩 정량에 의해. 라이브러리 준비를 시작 하기 전에 정량 하 여 시퀀싱에 대 한 칩을 확인 (단계 5.6.5 참조). 관심사의 단백질의 알려진된 대상 사이트에 바인딩되는 뇌관 디자인. 유전자 내에서 정확한 대상 사이트를 알 수 없는 경우 여러 뇌관 쌍 유전자와 관련 된 규제 요소 검색에 사용할 수 있습니다. RNAPII 칩의 Th1 세포 Ifng, 대 한 어떤 transcriptionally 자극, 따라 upregulated 이며 말라 뇌관 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. Sox9 및 인슐린 역할을 부정적인 컨트롤 때문에이 유전자 Th1 세포 (그림 5B)에서 표현 되지 않는다. MRNA의 정량에 대 한 일반적으로 사용 되는 엑손에 걸친 프라이 머를 사용 하지 기억 하십시오. IgG 컨트롤 사용된 항 체의 특이성을 증명 하기 위해 사용할 수 있습니다. Immunoprecipitated DNA는 적당 한 fluorometer로 측정 될 수 있다 ( 재료의 표참조). IgG 컨트롤에서 바인딩된 nonspecifically DNA의 양은 해야 크게 낮은에 비해 수 DNA 금액의 항 체에 의해 구속.
복제: 생물학 중요성의 증거: 그것은 강력 하 게 셀 모든 치료 및 치료 샘플 (그림 2)는 동일한 id를 가질 수 있도록 셀의 동일한 수영장에서 시작 하는 모든 방법에 대 한 운동 실험을 수행 하 고 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 복제 (예를 들어, 정량, FACS 분석에 의해)을 샘플 비교 하 각 방법에 대 한 주요 시간 포인트의 작은 aliquots를 려는 것이 좋습니다. 이로써 거친 추정 두 복제에 대 한 치료 재현 되었고 시퀀싱으로 진행할 수 있습니다. 유효성 검사는 복제의 bioinformatical 분석을 통해 수행 되어야 한다. 결과의 재현성 복제 사이의 FPKM 값 사이 상관 관계 측면에서 평가 될 수 있다 고 점도 (그림 6)를 사용 하 여 시각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> 그림 1: 세포 생리학을 perturbing 없이 최적의 4sU 라벨 조건 확인 (그림에서 Davari 외. 11) FACS 분석에 의해 세포 apoptosis의 (A) 탐지: 시험관에 각각 생성 Th0 세포 0.5 h, 1 시간, 2 시간, (괄호 안에 표시) 4sU의 다른 농도로 치료 했다. BH3I-1 치료는 반면 열 충격 (95 ° C에서 5 분) 7-AAD에 의해 결정 하는 세포 죽음을 유도 하는 데 사용 되었다 Annexin V에 의해 결정 하는 apoptosis를 유도 하기 위해 사용 되었다. (B) 서쪽 오 점 분석 4sU의 p53에 대 한 치료 및 T 세포 활성화: 샘플 200 µ M 4sU 활성화, 0.5 h 시간 점은 500 µ M 4sU와 함께 표시 했다를 제외 하 고 지정 된 시간에 대 한 표시 했다. (C) 인 EIF2a 및 (B)와 같이 동일한 라벨 조건 활성화 Th1 세포에서 총 EIF2a의 서쪽 오 점 분석. Thapsigargin 긍정적인 제어로 사용 되었다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> 그림 2: 게놈 넓은 변화를 추적 하는 키네틱 설치의 개요 개요 이 제도 4sU-seq, 총 RNA-seq, 리보솜 프로 파일링 및 세포 치료 시 게놈 넓은 변화를 공부 하 칩 seq 결합에 대 한 설치 프로그램을 보여 줍니다. 세포를 풀 고 치료 컨트롤에 대 한 셀의 필요한 수를 따로. 나머지를 취급 하 고 각 방법 및 시간 요소에 대 한 분할. 설명 된 대로 4sU와 4sU-seq에 대 한 치료/치료 셀 라벨. 시간 점 및 각 메서드에 대 한 샘플 검사 되 고 특정 생물 학적 질문에 따라 달라 집니다. 각 시간 포인트 및 방법, 샘플 고 프로토콜의 전용된 부분을 따라. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> 4sU 표시 된 RNA의 그림 3: 품질 관리 총 RNA와 RNA 활성화 Th1 세포에서 얻은 biotinylated는 Bioanalyzer에 분석 되었다. 18S rRNA와 28S rRNA 표시 되 고 RNA 무결성 번호 (린) RNA의 무결성을 확인 하는 계기에 의해 주어진 다. 린 ≥8 RNA 무결성을 보장 해야 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> 그림 4: Bioanalyzer 프로 파일 라이브러리를 프로 파일링 하는 리보솜의 (A) A 좋은 라이브러리: 샘플 예상된 크기 범위 (혈압 140-160)에 피크를 표시 하 고 아니 더 정화가 필요 하다. (B)이이 샘플 보여 과도 한 어댑터 이합체 증폭된 제품 (120 bp) 원하는 제품 (혈압 140-160)를 기준으로. 이 라이브러리는 더 정화를 필요합니다. (C)-증폭 된 샘플: 예상 보다 높은 분자량 봉우리와 바탕색이 PCR amplicons (화살표로 표시) 볼 수 있습니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> 그림 5: 최적의 chromatin 크기 전단 및 칩의 정량 확인 후 (A) Agarose 젤 그림 25 주기는 sonicator에 대 한 전단 및 정화 하기 전에 프로토콜에 설명 된 대로 세 가지 샘플에서 깎인된 chromatin의 최적의 조각 크기를 보여 줍니다. (B) 총 RNAPII 칩 (안티-RNA Pol II, 8WG16, ab817)의 Q-PCR 결과 입력의 백분율로 표현 됩니다. Sox9 와 인슐린 부정적인 컨트롤 (두 유전자 활성화 Th1 세포에 표현 되지 않는다)는 Ifng 와 말라 뇌관 긍정적으로 사용 되었다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> 그림 6: 생물의 비교 복제 (Davari 그 외 여러분 에서 그림 11) 식 값 (FPKM) 사이 비교 하는 대표적인 점도 활성화 Th1 세포의 자극 후 새로 베낀된 (4sU) RNA 4 h의 복제 합니다. 녹색 라인 같은 FPKM 값을 나타냅니다 그리고 순위 상관 관계 각 플롯에 표시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>기간 (분) 라벨</td>
			<td>권장된 4sU 농도 (µ M)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100-200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15-30</td>
			<td>500-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>&lt; 10</td>
			<td>500-2000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 권장 4sU 농도 (Rädle에서 외. 19) 권장된 4sU 농도의 범위는 라벨의 다른 시간에 대 한 표시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>메서드</td>
			<td>휴대폰 번호</td>
			<td>RNA의 금액</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU 라벨</td>
			<td>≥2 10 x7
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>리보솜 프로 파일링</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>칩 seq</td>
			<td>≥2 10 x7 -3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 필요한 양의 기본 T 세포 각 방법에 대 한 필요한 기본 T 세포의 최소 양입니다. 다른 세포 유형을 사용 하 여 때 금액은 작을 수도 있습니다.

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

이 실험 설정의 전반적인 목표는 RNA 및 DNA 조절의 주요 층을 설명하여 자극 또는 치료에 대한 반응으로 발생하는 주요 분자 메커니즘을 밝히는 것입니다. 이 방법은 일반적인 면역 반응뿐만 아니라 약물 치료에 대한 분자 반응과 같은 다양한 생물학적 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 시간이 지남에 따라 여러 층의 유전자 조절을 동시에 표시할 수 있다는 것입니다.따라서 각 방법에 대해 동일한 셀 풀을 사용하는 것이 중요합니다. 대체로 이 세 가지 프로토콜은 먼저 관심 세포를 서로 다른 시점으로 조작하는 것을 포함합니다. 각 조작 후 세포는 풀링되고 각 분석에 대해 하나씩 세 개의 그룹으로 나뉩니다.비디오의 이 섹션에서는 4sU 라벨링을 사용하여 가장 최근에 생성된 전사체의 라벨링 및 정제에 대해 설명합니다. 각 프로토콜은 궁극적으로 염기서열분석(sequencing)에 바로 사용할 수 있는 샘플을 생성합니다. 먼저, 관심 세포주에 필요한 4sU 농도와 배양 시간을 조회합니다.예를 들어, 200마이크로몰 4sU를 T 세포에 1시간 동안 사용합니다. 처리 후 세포 풀을 각 방법과 시점에 대해 하나의 별도 접시로 분리합니다. 그런 다음 필요한 수의 4sU 부분 표본을 완전히 해동하고 4sU를 세포 배지에 직접 첨가하고 지시에 따라 배양물을 배양합니다.다음으로, 폴리프로필렌 튜브에서 4sU 표지 세포를 수집합니다. 그런 다음 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 TRIzol에 밀리리터당 약 300만 개의 세포로 재현탁시키고 TRIzol의 세포를 실온에서 5분 동안 배양합니다.이제 Radle과 회사의 방법을 사용하여 30-80 마이크로 그램의 RNA를 준비하십시오. 다음으로, 티올 특이적 비오틴화 반응을 이 순서로 혼합합니다. 뉴클레아제가 없는 물, 10배 완충액, RNA, 마지막으로 비오틴-HPDP로 시작합니다.그런 다음 피펫팅과 혼합하여 배양합니다. 정제 단계를 진행하여 표지되지 않은 기존 RNA와 혼합된 새로 전사된 비오틴화된 RNA의 샘플을 생성합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 65도에서 10분 동안 가열합니다.그런 다음 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오. 각 샘플이 냉각되면 100마이크로리터의 스트렙타비딘 비드를 추가하고 실온에서 15분 동안 회전하면서 배양합니다. 이제 마그네틱 컬럼을 사용하여 새로 전사된 RNA로 장식된 비드를 분리한 다음 염기서열분석을 위해 11마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 RNA를 용리합니다.이 섹션에서는 활발하게 번역되고 있는 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 전사체를 염기서열분석하면 동적 트랜스라토솜을 조사할 수 있습니다. RNA 염기서열분석 데이터와 결합된 이 분석을 통해 RNA 회전율 및 번역 속도를 계산할 수 있습니다.현탁액에 cycloheximide를 추가하고 반전을 사용하여 혼합하는 것으로 시작합니다. 실온에서 1분 후 세포를 원심분리하고 배지를 제거한 다음 시클로헥시미드가 보충된 최소 10ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 다음으로, 배지를 흡인하고 1,000만 개의 세포당 100마이크로리터의 포유류 세포 용해 완충액으로 교체합니다.20-25 게이지 바늘을 사용하여 세포를 용해하기 위해 혼합물을 분쇄합니다. 그런 다음 세포 용해물을 예냉각된 1.50ml 튜브로 옮기고 주기적인 반전으로 얼음에서 10분 동안 용해물을 배양합니다. 10분 후 용해액을 원심분리하고 상층액을 시원한 1.5ml 튜브로 옮깁니다.다음으로, 뉴클레아제가 없는 물에 용해물을 1-10 희석하여 준비하고 260나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 희석되지 않은 용해물의 200마이크로리터 분취액을 생성하고 각 흡광도 단위에 대해 7.5 단위의 뉴클레아제로 각각 처리합니다. 뉴클레아제가 45분 동안 반응하도록 한 다음 15마이크로리터의 RNase 억제제를 사용하여 반응을 종료하거나 섭씨 음의 80도에서 보관합니다.그런 다음 상용 키트를 사용하여 RPF RNA를 정제하고 키트를 사용하여 rRNA 고갈을 수행합니다. 다음으로, 500나노그램의 분리된 RPF RNA에 대해 PAGE 정제를 수행합니다. 샘플을 젤에 적재할 준비를 한 후 섭씨 95도에서 5분 배양으로 샘플을 변성시키고 대조군을 변성시킵니다.그런 다음 약 75분 동안 180볼트에서 샘플을 실행하고 결과를 평가합니다. 젤 슬라이스 수집의 경우 멸균 20게이지 바늘을 사용하여 0.5ml 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다. 다음으로, 28 내지 30 염기 뉴클레오티드 영역에 해당하는 겔 슬라이스를 절제하고, 이를 준비된 0.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.RNA 대조군의 샘플과 음성 대조군의 샘플을 포함하여 오염을 확인합니다. 다음으로, 뚜껑이 있는 작은 샘플 튜브를 더 큰 마이크로 원심분리기 튜브에 로드합니다. 그런 다음 어셈블리를 원심 분리하여 겔을 파쇄하고 샘플을 1.5ml 튜브로 옮깁니다.다음으로, 물, 아세트산암모늄 및 SDS를 샘플 튜브에 첨가하여 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 반응하여 RNA를 용리시킵니다. 그런 다음 상용 키트를 사용하여 작은 RNA에서 cDNA 라이브러리를 만들고 cDNA 라이브러리의 염기서열분석을 진행합니다. ChIP-seq는 게놈 전체에 걸쳐 관심 있는 전사 인자의 결합을 매핑하는 데 사용됩니다.리보솜 프로파일링 및 모든 새로운 전사체 조사의 데이터와 결합된 ChIP-seq는 전사 인자 결합의 실제 영향을 보여줍니다. 먼저 포름알데히드를 사용하여 세포 샘플을 최종 농도 1%로 가교하고 실온에서 부드럽게 흔들면서 10분 후 글리신 농도를 0.125 어금니로 올려 반응을 중지합니다. 그런 다음 세포를 모아 얼음처럼 차가운 PBS로 세 번 씻고 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 동결합니다.그 후, 갓 첨가한 프로테아제 억제제가 함유된 1ml의 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시키고 10분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다. 10분 후, 세포를 스핀다운하고 상층액을 흡인하며 용해 완충액 추가 및 배양을 반복합니다. 다음으로, 초음파 처리를 사용하여 200에서 1, 000 염기쌍 사이의 전단 염색질을 생성합니다.그런 다음 염색질을 항체로 코팅된 마그네틱 비드에 연결하고 단백질-DNA 복합체를 50마이크로리터의 용리 완충액에 용리시킵니다. 다음으로, 5마이크로리터의 40%RNase와 용리 완충액을 첨가하고 샘플을 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플에 proteinase K 1단위와 글리코겐 20마이크로그램을 추가하고 2시간 동안 배양합니다.다음으로, 샘플을 밤새 섭씨 65도로 옮겨 역방향 교차 결합시킵니다. 다음날, 샘플을 자석에 최소 30초 동안 놓고 관심 DNA가 포함된 상등액을 수집합니다. 그런 다음 DNA를 정제하고 검증을 위해 정량적 PCR을 사용하고 DNA를 시퀀싱합니다.4sU-라벨링은 세포에 스트레스를 주고 세포사멸을 유발할 수 있습니다. Annexin V 및 7-AAD 염색을 사용하여 세포사멸 및 사멸 세포를 식별했습니다. 30분 또는 60분 처리를 사용하여 Th1 세포를 4sU로 표지한 후 세포가 죽거나 세포사멸을 겪지 않았습니다.RNA를 처리할 때 매우 중요하기 때문에 표준 분석을 사용하여 염기서열분석 전에 RNA의 무결성을 항상 확인했습니다. 증폭된 라이브러리는 건강한 범위의 뉴클레오티드를 가지고 있었습니다. 과도한 어댑터 이량체는 PAGE에 의한 추가 정제가 필요했습니다.너무 많은 템플렛 또는 너무 많은 주기는 무거운 뉴클레오티드, 번진 제품 및 접합기 이량체 제품 귀착됩니다 염색질 전단은 전단된 염색질의 주요 부분이 약 1, 000의 염기쌍 또는 경미하게 더 적은일 때 제일 작동하는 것을 찾아냈습니다. 정량적 PCR을 사용하여 염색질 면역침전 염기서열분석에 대한 항체의 적용 가능성을 테스트했습니다. negative control primer는 관심 세포에서 발현되지 않는 유전자를 위한 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 4sU를 추가할 시기와 각 방법에 대한 세포 수확 시기에 대한 일정을 포함하여 실험 설정에 대한 자세한 계획을 세우는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 4sU가 세포 생존율 및 스트레스 반응에 미치는 영향을 사전에 테스트하여 최적의 4sU 라벨링 조건을 항상 검증합니다. 요약하면, 이 접근 방식을 사용하면 세포 활성화 과정에서 발생할 수 있는 모든 유전자 조절 이벤트를 시각화할 수 있습니다.이 방법은 또한 1차 면역 세포와 자극 또는 약물에 대한 반응에 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

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