순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

이 방법은 암 전이를 달성하는 데 있어 폐 집락화의 역할에 대한 암 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 암이 전이되는 동안 초기에 유출된 암세포를 폐에서 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Cheng-Han Yang입니다.

종양 세포 배양액이 70-80% 합류점에 도달하면, 세척당 2ml의 멸균 PBS로 배양액을 2회 세척하고, 배양 접시에 1ml의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가합니다. 즉시 800마이크로리터의 상층액을 제거하고 대부분의 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 30-60초 동안 배양 접시를 섭씨 37도에 놓습니다. 10%FBS가 보충된 1ml의 신선한 배지를 첨가하여 반응을 중지하고 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 세포 용액을 격렬하게 혼합합니다.

생성된 단일 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 그런 다음 20% FBS가 보충된 1.5ml의 배지에 종양 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 종단 회전시킵니다. 배양이 끝나면 trypan blue exclusion으로 생존 가능한 세포를 계수하고 원심분리로 수집합니다.

두 번째 원심분리를 위해 1ml의 멸균 PBS에 펠릿을 다시 현탁시키고 10% FBS 및 20마이크로 밀리리터 CFSE가 보충된 500마이크로리터의 PBS에 펠릿을 다시 현탁합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10분 후 세포를 원심분리하고 또 다른 원심분리를 위해 1% FBS가 보충된 4밀리리터의 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 마지막 세척 후, FBS 농도가 없는 신선한 배지 밀리리터당 5 곱하기 10에서 6번째 종양 세포로 세포를 다시 현탁시키고 세포를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로, 생후 4-6주 된 수컷 C570 Black Six 마우스의 꼬리를 5-10분 동안 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 확장시키고 26 및 반 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 세포를 완전히 혼합합니다. 주사기에 200마이크로리터의 세포를 조심스럽게 넣고 마우스를 구속기에 넣습니다. 그런 다음 확장된 꼬리 정맥의 내강에 세포의 전체 부피를 주입합니다.

적절한 주입 후 시점에서 복부에서 가슴까지 세로 피부와 피하 조직을 절개하고 흉강을 열어 심장과 폐를 노출시킵니다. 멸균 수술용 봉합사를 사용하여 상대정맥과 하대정맥을 결찰하여 풍부한 용액의 역류를 방지하고 가위를 사용하여 좌심실에 2-4mm의 균열을 만들어 폐에서 관류액이 배출되는 것을 용이하게 합니다. 그런 다음 3ml 주사기를 사용하여 PBS를 우심실에 주입하고 폐가 붉은색에서 완전히 창백해질 때까지 지속적인 흡입을 사용하여 배수된 용액을 제거합니다.

성공적인 폐 관류를 위해 상대정맥과 하대정맥을 적절하게 고정하도록 주의하십시오. 폐를 적출한 후 6cm 접시에 담긴 맞춤형 폐 홀더에 엽을 넣고 홀더의 그물 질감에 폐를 고정합니다. PBS로 엽을 덮고 적신 다음 배양 접시를 컨포칼 현미경의 이미징 스테이지에 놓습니다.

5x 대물렌즈를 선택하고 필터 휠을 NIBA로 돌립니다. 488 나노미터 레이저를 사용하여 CFSE를 여기시켜 폐엽 내의 형광 파란색 표지된 종양 세포를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 필터 휠을 R690으로 돌려 픽셀당 2마이크로초의 스캔 속도로 스캔하고 고전압 게인 및 오프셋 레벨을 최적화합니다.

그런 다음 픽셀당 10마이크로초의 스캔 속도를 사용하여 5개의 12 x 5개의 12 픽셀 형광 이미지를 캡처합니다. 방금 설명한 바와 같이 염색 방법을 사용하면 종양 세포가 용량 의존적 방식으로 CFSE로 효과적으로 표지됩니다. 라벨링의 형광 강도로 인해 20 마이크로 몰 농도에서 밀리리터 당 5 번째 루이스 폐 암종 세포의 6 배 10에 거의 도달합니다.

방금 시연된 바와 같이 수확 전 폐 관류는 이미징 분석 전에 비특이적으로 잘린 순환 종양 세포의 폐 혈관 구조를 제거합니다. 형광 컨포칼 현미경 검사는 채취 및 관류된 폐엽 내에 집락화하는 CFSE 표지 종양 세포의 존재를 보여줍니다. 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 형광 이미지를 흑백으로 변환하면 폐 집락화의 정량화가 용이합니다.

Lewis 폐암 세포를 발현하는 피브로넥틴 발현 또는 스크램블 피브로넥틴의 정맥 투여는 주사 후 38시간 및 45시간 후에 채취한 폐 조직에서 피브로넥틴 발현 세포의 수가 현저히 적음을 보여주며, 이는 폐엽 집락 형성 및 종양 발달에서 피브로넥틴의 역할을 강조합니다. 이 절차를 시도하는 동안 부착되지 않은 세포를 씻어낼 수 있도록 폐를 조심스럽게 관류하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 암 전이 분야의 연구자들이 마우스 제로 그램 모델에서 종양 세포를 순환시켜 폐 집락화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 종양 세포 현탁액을 형광 라벨링하고, 종양 세포를 관류하는 마우스 폐를 정맥 주사하고, 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 전이된 종양 세포를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.