Name: 순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 학습하세요 순환 종양 세포의 폐 식민 과정을 시각화하는 생체 내 분석법을 통해 암 전이 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 조기 혈관외 이탈 암 세포를 관찰하여 전이 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자 박사 Ming 분 장 및 양 나중 Hsin 쳉 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품만 사역의 과학 및 기술에 의해 지원 되었다 (대부분-103-2325-B-006-009, 대부분-104-2325-B-006-001, 대부분-105-2325-B-006-001, 및 MOST-106-2320-B-006-068-MY3)의 보건 및 복지 (MOHW106-TDU-B-211-144004). 우리는 또한 그들의 다 광자 공초점 현미경에 대 한 국립 쳉 쿵 대학, 의학 대학의 핵심 연구소에서 지원에 대 한 감사.

모든 실험 쥐에 우리의 연구소 (관리 및 실험 동물의 사용, NCKU 의학 대학에 대 한 가이드)의 지침에 따라 수행 했다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
<ol><li>시작 하기 전에 실험 프로토콜, 메 마른 외과 봉합, 1 mL 주사기 26 G/0.5 c m 바늘 (대 한 꼬리 정 맥 주사), 얻을 3 mL 주사기 24 G/3 c m 바늘 (대 한 폐 관류), Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM), 트립 신-EDTA 솔루션 (5 g/L 트립 신 및 0.53 m m), 소 태아 혈 청 (FBS), 1 x PBS (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4및 1.8 m m KH2포4), 그리고 6 cm 문화 요리.</li>
</ol>2. 준비 및 서 스 펜 션에 종양 세포의 복구
<ol><li>살 균 Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM) 10% 또는 20% 포함 된 준비 FBS 갓 추가 2mm L-글루타민, 1 x PBS, 0.05% 트립 신-EDTA.</li>
	<li>10% 보충 DMEM 셀 문화 37 ° C에서 FBS 문화 접시에 70-80% 합류 있을 때까지 그들을 성장 하 고.</li>
	<li>뒤에 두 세척 살 균 1 x PBS의 2 mL와 함께 요리에서 문화 미디어 (DMEM)를 제거 합니다.</li>
	<li>0.05%의 1 mL를 추가 모든 세포를 철저 하 게 요리에 트립 신-EDTA. 즉시 솔루션의 800 μ를 제거 하 고 요리에만 200 μ를 떠나. 30에 대 한 37 ° C에서 요리를 품 어 s (셀 유형)에 따라 1 분 및 일시 중단된 상태에서 세포의 대부분은 때까지 기다립니다.</li>
	<li>신선한 DMEM 1 mL을 추가 10% 포함 된 트립 신 하 고 적극적으로 효소 활동을 중지 하는 요리에 직접 FBS 플라스틱 셀 서 스 펜 션 아래로 단일 세포 현 탁 액을 준비 하는 1000 µ L 피 펫과.</li>
	<li>접시에서 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀을 전송 하 고 162 x g 3 분에 실 온에서 셀 아래로 회전.</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 resuspend 종양 세포 1.5 mL 20 %FBS 및 이상 끝 포함 된 DMEM 회전 2 h 37 ° C에서에 셀. 참고: 경우 매체 복구 하는 동안 노란색, 교환 20% 포함 된 신선한 매체와 오래 된 매체 FBS.</li>
</ol>3. 형광 착 색 및 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CFSE)에 종양 세포의 분석
<ol><li>정지에서 세포 복구, 후 Trypan 파랑 Neubauer 챔버 titrating 복용량을 얼룩이 지기 형광 세기에 적절 한 실행 가능한 핸드폰 번호를 계산 하 고 꼬리 정 맥 주입.</li>
	<li>3 분 및 resuspend 수송과 셀의 1 mL에 1 x PBS, 실내 온도 3 분 162 x g에서 원심 분리 뒤 소독에 대 한 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>500 µ L 10를 포함 하는 1 X PBS의 수송과 셀 resuspend %FBS 0, 5, 10, 20, 또는 40 µ M CFSE 복용량 적정을 위한 37 oC 어둠 속에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 품 어 고.</li>
	<li>3 분 동안 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 1% 포함 된 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend FBS. 이 세척 단계 세 번 더 반복 합니다. 마지막 세척에 대 한 혼자 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend</li>
	<li>꼬리 정 맥 주입 또는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀의 형광 강도 계량 분석 CFSE 표시 된 셀을 대상 합니다. 참고: 얼음 FACS 분석 또는 꼬리 정 맥 주사를 수행 하기 전에 셀을 계속.</li>
</ol>4. 폐 식민 분석 결과
<ol><li>20 µ M CFSE와 함께 표시 하는 셀을 준비 (3.4 통해 단계 3.1 참조). 참고: 종양 세포, FACS 분석에서 적정 결과에 따라 라벨 CFSE의 작업 복용량 결정 (단계 3.3 참조).</li>
	<li>4-6 주 꼬리 워밍업-오래 된 남성 C57BL/6 마우스 (6 쥐) 마우스 꼬리 혈관을 팽창 하는 마우스-의해-마우스 기준 5-10 분 위한 할로겐 램프로.</li>
	<li>철저 하 게 혼합 하 고 (5 x 106 셀/mL의 최종 셀 밀도)와 세포 현 탁 액에서 모든 거품을 피하고 1 mL (26Gx1/2) 주사기 CFSE 표시 된 종양 세포를 발음.</li>
	<li>신중 하 게 주사 1 x10 마우스 restrainer에 제기 해야 하는 마우스 꼬리 정 맥으로 DMEM의 200 µ L에서6 CFSE 표시 된 종양 세포. 참고: 동안 주입, 바늘 꼬리 정 맥의 루멘에 직접 배치 됩니다 경우 종양 세포 한다 쉽게 배달 순환으로 주사기에 하드 밀어 필요 없이. 경우를 통해 종양 세포를 밀어, 그들은 있다 가장 가능성이 되었습니다 주입 꼬리 정 맥 이외의 피하 공간으로.</li>
	<li>쥐를 두 그룹으로 CFSE 표시 된 종양 세포를 정 맥으로 받은 분할: 하나의 그룹 confocal 현미경 검사 법 이어서 폐 관류를 받게 될 것 이다 및 ImageJ 정량화 폐 식민 분석 결과 다른 것에서 남아 있을 것입니다 혼자 4-5 장기적인 폐 식민 주 시험.</li>
	<li>20, 38, 또는 45 h와 시간 과정 및 복용량 의존 적정 하는 동안 정 맥으로 주입 하는 1 x 106 종양 세포, anesthetize 50-75 mg/kg zoletil 50, 잘 허용 하 고 적절 한 anesthetizer23와 종양 방위 쥐. 참고: 사용 하 여 수 의사 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 연 고.</li>
	<li>경도 수술가 위로 잘라 피부와 가슴 지역에서 복 부 피하 조직. 수술가 위 및 심 혼 및 폐를 완전히 노출 하는 집게와 흉 막 캐비티를 엽니다. 참고: 혈관을 절단 하지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>뛰어난 베 나 정 맥 (SVC) 및 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 폐 관류 동안 관류 솔루션의 역류를 방지 하기 위해 불 임 수술 봉합을 묶어.</li>
	<li>좌 심 실 벽 균열 (약 2-4 m m) 폐 로부터 관류 솔루션을 배출 하 여 수술가 위로 잘라.</li>
	<li>3 mL 주사기 1 x PBS를 우 심 실에 삽입 하 고 폐는 완전히 창백 하는 붉은 색에서 돌 때까지 폐 관류 동안 지속적인 흡입 물기 솔루션을 제거 합니다.</li>
</ol>5. confocal 현미경 이미징 및 식민지 화 하는 폐 종양 세포의 분석
<ol><li>흉 막 캐비티에서 지금 창백 폐를 제거 하 고 멀리 외과 시저 및 집게24기도 및 결합 조직 인 대를 절단 하 여 5 개의 돌출부를 분리.</li>
	<li>폐 엽의 배치에 대 한 두 개의 막대 사이의 공간을 가진 reticulate 텍스처를 생산 하기 위해 들 것 같은 폐 홀더 같이 그림 3B 에서 나일론 봉합 와인딩 하 여 약 2 개의 금속 막대를 준비 합니다. 6 cm 접시에 폐 소유자를 설정 합니다. 참고: 폐 홀더 confocal 현미경의 대물 렌즈 아래 폐 엽을 안정 시키기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>별장 및 폐 소유자의 reticulate 텍스처에 폐 엽을 수정. 표지 및 1 x PBS와 폐 엽을 축 축 하 게.</li>
	<li>제목 6 cm 문화 접시 폐 엽 폐 식민지 종양 세포를 기록 하는 형광 이미지를 캡처 confocal 현미경 검사 법을 폐 소유자를 은닉.</li>
	<li>이미징, 렌즈를 사용 하 여 (5 X, MPLN, 나: 0.1, WD: 20, 공기).</li>
	<li>NIBA (여기/방출, 470-495 nm/510-550 nm)을 필터 바퀴를 회전 하 고 488 nm 레이저를 사용 하 여 폐 엽에 형광 점의 이미지를 명확 하 게 시각화 CFSE를 자극.</li>
	<li>R690 (MaiTai HP DeepSee 레이저)에 대 한 필터 휠을 회전 2.0 스캔 µs/픽셀 스캔 속도 및 HV, 이득 및 오프셋 최적화 수준.</li>
	<li>10 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 (512 x 512 픽셀) 캡처 µs/픽셀 스캔 속도.</li>
	<li>계량 하 고 앞에서 설명한21로 ImageJ GraphPad 소프트웨어를 사용 하 여 미세한 이미지를 통계적으로 분석.</li>
</ol>6. 장기 폐 식민 분석 실험
참고: 4.1 4.5 통해 단계를 반복 합니다.
<ol><li>4-5 주 동안 종양 세포 접종 후 쥐를 희생 하 고 1 ~ 2 일 동안 Bouin의 유체25 그들의 폐를 고치십시오.</li>
	<li>계량 하 고 통계 분석 소프트웨어21쥐 폐에서 종양 작은 혹.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

긴 기간 폐 식민 분석 실험, 단기 우리 고용 여기 먼 장기에 폐 식민 CTCs에 의해 vivo에서 평가 하는 방법론 명확 하 게 발표 하 고 식민지에서 CTCs에 조립 하는 polyFN의 특정 역할 분화와 함께 폐에 넘쳐 흐름 및 전이성 프로세스18,19,,2021다음 주도. 비록 장기 셀 추적기 CFSE 3 일전 폐 관류에 대 한 정 맥 주입된 CTCs를 추적 하 고 양적으로 충분 한 녹색 형광을 유지 하는 셀 라벨, 그건 직접 확인할 수 종양 세포 배 루멘 내 위치 여부 이미 혈관에서 extravasated. 이 문제, 빨간색 형광을 해결 하기 위해 rhodamine 활용 된 dextran lectins endothelia에에 비 특정 바인딩 할 수 있는 폐 관류<sup class...

전이 암 죽음1,2의 주요 원인입니다. 기본 조직에서 파생 하는 종양 세포에에서 순환을 입력 하 고 전에 그들은 다양 한 hematogenous 도전, 예를 들면, anoikis, 면역 공격, 및 혈압 또는 기하학적 구속 조건에서 전단 응력으로 인해 손해 생존 식민지 먼 장기 전이3,4,,56의 성공을 지시 된 중요 한 단계를 수 있습니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 특성화 및 종양 악성 종양, 전이, 암 환자7,8 의 생존 율과 이러한 특성을 상호 활발 한 노력에 현재 되었습니다 따라서, , 9. 암 전이의 과정 vivo에서 이벤트를 구체적으로 묘사, 동물 모델은 유일한 접근 전이10,11,12의 전체 조직의 프로세스를 .
CTCs 먼 장기1,2의 식민지를 포함 하 여 여러 개의 셀룰러 이벤트를 통해 전이성 종양 조직 된다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 전이 분석 실험13,,1415 먼 장기의 CTC 식민지를 관찰 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 vivo에서 분석 결과 디자인 CTC 식민 시각화에 대 한 긴급 하 게 필요 합니다. 하지만 여러 vivo에서 비보 전 짧은 기간 폐 식민 분석 실험 설계 되었습니다, 문제 및 단점 남아 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 동안-overexpressing 종양 세포에서 사용 된 분석 실험22,23, 안정적 transfect 아래에서 충분 한 GFP 형광 강도 종양 세포를 복제 하는 시간이 걸립니다 현미경입니다. 마찬가지로, 비록 GFP 표현 종양 세포를 대체 하 긴 기간 셀 추적 CFSE와 종양 세포의 얼룩 과도 고용 된 남아 CFSE 표시 된 종양 세포 부착 여부를 판단 하기 어렵거나 단지 내 존재는 삭제 먼 장기16,17의 맥 관 구조.
CTCs의 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직18,,1920,21,22의 마지막 설립에 비판적으로 기여할 발견 되었습니다. . 여기, 우리가 수행 단기 폐 식민 분석 실험 중단된 루이스 폐 암 셀 (LLCs)에서 안정적으로 표현 하는 FN-shRNA (shFN) 또는 출 격-shRNA (shScr) 고 미리 CFSE와 C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 2-3 일 후, 마우스 폐 처음 confocal 현미경 검사 법 및 폐 식민지 LLCs의 정량화를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 완전히 복종 되기 전에 맥 관 구조 내에서 연결 되지 않은 CTCs 제거와 함께 끼얹는다 했다. 우리가 명확 하 게 보여주었다 폐 식민지 shFN LLCs의 숫자와 종양 혹 shScr LLCs, 실질적으로 식민과 CTCs에의 성장 촉진에 CTCs에 polyFN 어셈블리의 역할을 확실 한지 알아보는 비해 크게 감소 했다 그는 폐입니다. 우리의 연구 영장 추가 암 전이에서 polyFN의 역할에 대 한 조사.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 세럼 알부민&nbsp;( BSA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)</td><td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's Fluid</td><td>MCC(Medical Chemical Corporation)/POISON</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation Dye</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>성명: Carboxyfluorescein succinimidyl ester</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>Cyrusbioscience (타이페이, 대만)</td><td>101-6381-92-6</td><td>준비된 트립신-EDTA 용액( 최종 농도: 0.53mM)&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lewis lung carcinoma (LLC)</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, USP&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Cyrusbioscience (타이페이, 대만)</td><td>101-7447-40-7</td><td>준비된 1X PBS (최종 농도: 2.7mM)</td></tr> <tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)</td><td>Cyrusbioscience (타이페이, 대만)</td><td>101-7778-77-0</td><td>준비된 1X PBS (최종 농도: 1.8mM)</td></tr><tr><td>나트륨 염화물(NaCl)</td><td>Cyrusbioscience(대만 타이베이</td>)<td>101-7647-14-5</td><td>준비된 1X PBS(최종 농도: 137mM)</td></tr>인<tr><td>산나트륨이염기성(Na2HPO4)</td><td>Cyrusbioscience(대만 타이베이)</td><td>101-10039-32-4</td><td>준비된 1X PBS(최종 농도: 10mM)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.5g과 100mL 1X PBS</td></tr> <tr><td>혼합Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td>준비된 트립신-EDTA 용액 (최종 농도: 5g/L)</td></tr> <tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td></td><td>1X PBS로 희석하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compact 탁상용 원심분리기 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>배양 접시 (6cm)</td><td>무석 NEST 생명 공학 Co.</td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>일회용 주사기 (바늘 포함)</td> <td>Perfect Medical Industry Co.</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>엔드 오버 엔드 믹서</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>부유 세포 회수용&nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Direct Heat CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>마우스 억제기 (원통형 억제기 15-30 gm)</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>다광자 컨포칼 현미경 BX61WI</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계수실</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>수술용 봉합사&nbsp;</td><td>UNIK 외과 봉합사 MFG. CO.</td><td>NO. 0034</td><td>블랙 브레이드 실크; 비흡수성(25YD; U.S.P. 4/0)</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td></td><td></td>615001</tr><tr><td>15 mL Greiner 튜브</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

전이 암 사망의 주요 원인입니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이, 폐 식민 CTCs에 의해 비판적으로 공헌 한다 폐 전이성 프로세스 초기에 홍보에 역할을 적극적으로 조사 되었습니다. 따라서, 동물 모델은 유일한 접근 전이의 전체 조직의 프로세스를. 우리는 vivo에서 폐 식민 분석 결과 설립 문제가 혈관 넘쳐 흐름 CTCs의 기여를 조사 하기 위한 이전 실험 설계에서 발생, 그 긴 장기 형광 세포 추적 프로그램, carboxyfluorescein 그리고 에스테 르 succinimidyl (CFSE), 일시 중단 된 종양 세포를 사용 폐 관류 폐 제거, confocal 영상 및 정량화 이전 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 했다. CTC 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직의 최종 설립에 폐 식민 중재 발견 되었습니다. 여기, 특히 polyFN 어셈블리 CTCs에 폐 식민 넘쳐 흐름의 요구 사항을 테스트, 단기 수행 있는 폐 식민 분석 실험 중단 루이스 폐 암 세포 (LLCs) 안정적으로 FN-shRNA (shFN)를 표현 하거나 출 격-shRNA (shScr)와 20 미리 레이블이 CFSE의 μ M C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 우리는 성공적으로 마우스 폐를 식민지로 shFN LLC는 세포의 능력 shScr LLC 셀에 비해 현저 하 게 점감 되었다 설명 했다. 따라서,이 단기 방법론 특히 식민지 폐 순환 내 CTCs의 능력을 보여 주기 위해 널리 적용할 수 있습니다.

Vivo에서 폐 식민 분석 결과 수행 하기 전에 일시 중단 된 종양 세포에 polyFN 중재 폐 식민지 그리고/또한 전이, 촉진에 넘쳐 흐름 여부를 테스트 하려면 그림 1A 에서 볼 수 있듯이 우리가 먼저 적정 다른 CFSE, 세포 투과성 covalently 세포내 포함 하는 아민 분자26,27 일시 중단 된 종양 세포에 변화 하 고 꽤 긴 시간 동안 셀에 남아 형광 화합물 농도 우리는 그 종양 세포에 그림된 그림 1B와 복용량 의존 방식에서 CFSE와 효과적으로 표시 했다 발견. CFSE 라벨 6에서 그림 1 c에 나와 있는5 LLC 셀/mL는 거의 20 µ M로에 대 지...

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

이 방법은 암 전이를 달성하는 데 있어 폐 집락화의 역할에 대한 암 전이 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 암이 전이되는 동안 초기에 유출된 암세포를 폐에서 시각화할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Cheng-Han Yang입니다.종양 세포 배양액이 70-80% 합류점에 도달하면, 세척당 2ml의 멸균 PBS로 배양액을 2회 세척하고, 배양 접시에 1ml의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가합니다. 즉시 800마이크로리터의 상층액을 제거하고 대부분의 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 30-60초 동안 배양 접시를 섭씨 37도에 놓습니다. 10%FBS가 보충된 1ml의 신선한 배지를 첨가하여 반응을 중지하고 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 세포 용액을 격렬하게 혼합합니다.생성된 단일 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 그런 다음 20% FBS가 보충된 1.5ml의 배지에 종양 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 종단 회전시킵니다. 배양이 끝나면 trypan blue exclusion으로 생존 가능한 세포를 계수하고 원심분리로 수집합니다.두 번째 원심분리를 위해 1ml의 멸균 PBS에 펠릿을 다시 현탁시키고 10% FBS 및 20마이크로 밀리리터 CFSE가 보충된 500마이크로리터의 PBS에 펠릿을 다시 현탁합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10분 후 세포를 원심분리하고 또 다른 원심분리를 위해 1% FBS가 보충된 4밀리리터의 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 마지막 세척 후, FBS 농도가 없는 신선한 배지 밀리리터당 5 곱하기 10에서 6번째 종양 세포로 세포를 다시 현탁시키고 세포를 얼음 위에 놓습니다.다음으로, 생후 4-6주 된 수컷 C570 Black Six 마우스의 꼬리를 5-10분 동안 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 확장시키고 26 및 반 게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 세포를 완전히 혼합합니다. 주사기에 200마이크로리터의 세포를 조심스럽게 넣고 마우스를 구속기에 넣습니다. 그런 다음 확장된 꼬리 정맥의 내강에 세포의 전체 부피를 주입합니다.적절한 주입 후 시점에서 복부에서 가슴까지 세로 피부와 피하 조직을 절개하고 흉강을 열어 심장과 폐를 노출시킵니다. 멸균 수술용 봉합사를 사용하여 상대정맥과 하대정맥을 결찰하여 풍부한 용액의 역류를 방지하고 가위를 사용하여 좌심실에 2-4mm의 균열을 만들어 폐에서 관류액이 배출되는 것을 용이하게 합니다. 그런 다음 3ml 주사기를 사용하여 PBS를 우심실에 주입하고 폐가 붉은색에서 완전히 창백해질 때까지 지속적인 흡입을 사용하여 배수된 용액을 제거합니다.성공적인 폐 관류를 위해 상대정맥과 하대정맥을 적절하게 고정하도록 주의하십시오. 폐를 적출한 후 6cm 접시에 담긴 맞춤형 폐 홀더에 엽을 넣고 홀더의 그물 질감에 폐를 고정합니다. PBS로 엽을 덮고 적신 다음 배양 접시를 컨포칼 현미경의 이미징 스테이지에 놓습니다.5x 대물렌즈를 선택하고 필터 휠을 NIBA로 돌립니다. 488 나노미터 레이저를 사용하여 CFSE를 여기시켜 폐엽 내의 형광 파란색 표지된 종양 세포를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 필터 휠을 R690으로 돌려 픽셀당 2마이크로초의 스캔 속도로 스캔하고 고전압 게인 및 오프셋 레벨을 최적화합니다.그런 다음 픽셀당 10마이크로초의 스캔 속도를 사용하여 5개의 12 x 5개의 12 픽셀 형광 이미지를 캡처합니다. 방금 설명한 바와 같이 염색 방법을 사용하면 종양 세포가 용량 의존적 방식으로 CFSE로 효과적으로 표지됩니다. 라벨링의 형광 강도로 인해 20 마이크로 몰 농도에서 밀리리터 당 5 번째 루이스 폐 암종 세포의 6 배 10에 거의 도달합니다.방금 시연된 바와 같이 수확 전 폐 관류는 이미징 분석 전에 비특이적으로 잘린 순환 종양 세포의 폐 혈관 구조를 제거합니다. 형광 컨포칼 현미경 검사는 채취 및 관류된 폐엽 내에 집락화하는 CFSE 표지 종양 세포의 존재를 보여줍니다. 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 형광 이미지를 흑백으로 변환하면 폐 집락화의 정량화가 용이합니다.Lewis 폐암 세포를 발현하는 피브로넥틴 발현 또는 스크램블 피브로넥틴의 정맥 투여는 주사 후 38시간 및 45시간 후에 채취한 폐 조직에서 피브로넥틴 발현 세포의 수가 현저히 적음을 보여주며, 이는 폐엽 집락 형성 및 종양 발달에서 피브로넥틴의 역할을 강조합니다. 이 절차를 시도하는 동안 부착되지 않은 세포를 씻어낼 수 있도록 폐를 조심스럽게 관류하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 암 전이 분야의 연구자들이 마우스 제로 그램 모델에서 종양 세포를 순환시켜 폐 집락화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 종양 세포 현탁액을 형광 라벨링하고, 종양 세포를 관류하는 마우스 폐를 정맥 주사하고, 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 전이된 종양 세포를 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

본 연구에서보고 된 소설 프로토콜 결합에 의한 마우스의 단일 셀 해상도로 폐 metastases의 선택적 검출 할 수...

복합에 의한 마우스의 싱글 셀 해상도에서 폐 Metastases의 향상된 시각화<em&gt;에서 시츄</em폐 조직 및 X-걸의 착색의&gt; 재관류<em&gt; lacZ</em&gt; 태그 종양 세포

이 비디오는 폐암 세포가 무한정 증식하고 개별 군체를 형성하는 능력을 결정하는 데 도움이 되는 군집 형성 분석에 대해 설명합니다. 항암제가 군집 형성 세포에 미치는 영향은 결과 군체의 수 및/또는 크기의 변화를 분석하여 분석할 수 있습니다.

Colony Formation Assay: Colony Forming Lung Cancer Cells에 대한 항암제의 효능 평가

이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

시험관내 모델 시스템은 폐암 관련 섬유아세포(CAFs)와 3차원(3D) 공동 배양에서 폐 편평상피암(LUSC) 진행 동안 조직 건축 변화를 포착하기 위해 개발되었다. 이 오르가노이드 시스템은 종양 표현형을 조절하는 다양한 종양 세포 본질 및 외인성 변화의 역할을 조사하는 독특한 플랫폼을 제공한다.

폐 편평상피암 진행을 모델링하는 다차원 동문화 시스템

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

이 프로토콜은 건강한 쥐 및 종양이 있는 쥐 폐 조직 모두에서 고품질 단세포 현탁액을 분리하는 상세한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 scRNA-seq, 유세포분석 및 1차 세포 분리에 적용할 수 있습니다.

플로우 사이토메트리 및 단세포 RNA 시퀀싱을 위한 전체 쥐 종양 탑재 폐 조직의 최적화 준비

학습하세요 순환 종양 세포의 폐 식민 과정을 시각화하는 생체 내 분석법을 통해 암 전이 메커니즘을 연구하는 방법을 배우세요. 이 기술은 조기 혈관외 이탈 암 세포를 관찰하여 전이 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

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